隔离LacZ基因表达的小鼠内耳组织用流式细胞仪检测细胞

摘要

流式细胞术是一种强大的工具，可用于分离和研究特定细胞群。该方案描述了从新生转基因小鼠的耳蜗组织中分离表达 LacZ 的细胞的步骤。在通过流式细胞术分离之前，使用 β-半乳糖苷酶的荧光偶联底物标记解离的耳蜗细胞。

摘要

分离特定细胞类型可以分析稀有细胞群，例如干细胞/祖细胞。这种研究内耳组织的方法提出了独特的挑战，因为缺乏感兴趣的细胞并且转基因报告小鼠模型很少。在这里，我们描述了一种使用荧光偶联探针选择性标记新生儿耳蜗的 LacZ 阳性细胞的方案。

感音神经性听力损失最常见的潜在病变是耳蜗感觉毛细胞的不可逆损伤和丧失，而耳蜗感觉毛细胞是将声波转导为神经冲动所必需的。最近的证据表明，小鼠听觉和前庭器官含有可能具有再生潜力的干细胞/祖细胞^1,2。这些发现值得进一步研究，包括鉴定具有干细胞/祖细胞特征的特定细胞类型。Wnt 信号转导通路已被证明在维持多个器官系统中的干细胞/祖细胞群中起关键作用^3-7。我们最近在新生儿耳蜗中发现了表达 Wnt 反应性 Axin2 的细胞，但它们的功能在很大程度上是未知的⁸。

为了更好地了解这些 Wnt 反应细胞在体外的行为，我们开发了一种从 Axin2-LacZ 报告小鼠的耳蜗中分离表达 Axin2 的细胞的方法⁹.使用流式细胞术从新生儿耳蜗中分离 Axin2-LacZ 阳性细胞，我们可以反过来对活细胞进行各种实验，以询问它们作为干细胞/祖细胞的行为。在这里，我们详细描述了新生儿耳蜗显微解剖、这些组织的解离、使用荧光底物标记 LacZ 阳性细胞和细胞分选的步骤。已经描述了将耳蜗解离成单细胞并通过流式细胞术分离耳蜗细胞的技术^2,10-12。我们对这些技术进行了修改，以建立一种新的方案来从新生儿耳蜗中分离表达 LacZ 的细胞。

方案

1. 耳蜗显微解剖

1. 通过用 70% 乙醇擦拭表面并放置冰块，在引擎盖下准备解剖显微镜。
2. 在无菌条件下准备 10-15 个 35 mm 培养皿，并用无菌的含钙汉克平衡盐溶液 （HBSS） 填充一半 （~2 ml）。
3. 在无菌条件下准备两个 35 mm 培养皿，并用无菌 1x 磷酸盐缓冲溶液 （PBS） 填充一半 （~2 ml）。
4. 在含 70% 乙醇的 50 ml 锥形 Falcon 管中对微镊子进行消毒。
5. 在与无菌罩分开的房间中，使用虹膜剪刀将 12-15 只出生后 （P） 0-3 日龄的 Axin2^LacZ/+ 报告小鼠斩首，并将头部放在冰块上的 60 毫米培养皿上。
6. 使用 #5 Dumont 镊子和虹膜剪刀，切除下颌骨和舌头，并在上颚水平切开颅底。
7. 去除颅骨的覆盖皮肤，并将剪刀插入枕骨大孔的下部到上颚中部，横切颅底。
8. 用虹膜剪刀从上颚的切割边缘到两侧颅骨的上部再做一个切口，小心不要损坏耳囊。
9. 通过做两个 45 度倾斜的切口，从枕骨大孔的上部开始，延伸到硬腭的冠状切口，从而完全隔离颞骨。
10. 将分离的颞骨放在冰块上含有 HBSS 的 35 毫米培养皿中。
11. 从大约 12-15 只被处死的动物身上收集颞骨，总共 24-30 块颞骨。
12. 将带有分离颞骨的培养皿转移到先前准备好的无菌解剖罩 （1.1） 中。
13. 将四块颞骨转移到每个含有 HBSS （1.2） 的预制 35 毫米培养皿中，并放在冰块上。
14. 使用两个 #55 镊子开始显微解剖，轻轻去除耳囊上方颞骨中的皮层、脑干和小脑。
15. 在不取出耳囊的情况下，从前庭耳蜗神经入口开始
从耳廓囊开始从耳蜗囊部分切开。
16. 暴露耳蜗基部后，轻轻拉出耳蜗和周围组织。去除任何剩余的螺旋神经节和从基部开始的血管纹。
17. 将耳蜗转移到冰块上含有 PBS 的 35 mm 培养皿中。
18. 为了获得最佳组织活力，解剖总时间应小于 60 分钟。
19. 对 3-5 只野生型 （WT） P0-P3 小鼠重复上述步骤，作为 Axin2-LacZ 小鼠的对照。

2. 细胞解离（从前面描述的方法修改）^2,10

1. 将 50 μl 无菌 PBS 置于 6 孔无涂层培养皿的孔中心。
2. 将多达 20 个 Axin2^LacZ/+ 耳蜗转移到每 50 μl PBS 液滴中。对于 20 个以上的耳蜗，应使用新的 50 μl PBS 液滴。
3. 将 50 μl 等分试样的 0.125% 胰蛋白酶在 37°C 水浴中预热 ~2 分钟。
4. 将 50 μl 预热的 0.125% 胰蛋白酶加入含有耳蜗的 PBS 中。
5. 将 6 孔培养皿在 37°C 下放置 8 分钟，注意不要摇晃培养皿。
6. 为了终止胰蛋白酶消化，向每 100 μl 液滴中加入 50 μl 大豆胰蛋白酶抑制剂。
7. 再加入 50 μl 全培养基 （FM）（IGF-1、EGF、bFGF、HS、DMEM/F12 中的氨苄青霉素）²
8. 使用 300 μl 平头移液器吸头和 125 μl 的 p200 移液器，轻轻研磨细胞 80 次，注意不要产生气泡。
9. 研磨每个液滴后，向每个孔中额外添加 200 μl FM。
10. 将细胞通过 40 μm 蓝色 Falcon 细胞过滤器进入新孔中。
11. 将细胞转移到标准 Falcon FACS 管中（研磨和过滤后剩余约 300 μl）。
    1. 将野生型耳蜗的细胞分成三管，每管中用 300 μl FM 稀释 100 μl。一根管将用作空白对照，一根将仅用碘化丙啶（PI，1 μg/ml）染色（在此步骤中不添加），而最后一个将用 3-羧基伞形基 β-D-吡喃半乳糖苷（CUG，参见 2.15）染色以检测背景荧光。
    2. 将 400 μl 来自 Axin2-LacZ 耳蜗的解离细胞放入每个 FACS 管中。作为仅 CUG 对照，在 390 μl FM 中稀释 10 μl 细胞（参见步骤 2.15 中的试管 F）。将任何剩余试管的体积增加到 400 μl。
12. 将细胞在 37°C 加湿培养箱中孵育 10 分钟。
13. 准备 CUG 解决方案：
    1. 为每个需要染色的 FACS 管准备 200 μl CUG。
    2. 在黑暗的罩子中以 FM 1：50 稀释 CUG，并尽量减少光照。
    3. 将稀释的 CUG 在 37°C 下预热 3-5 分钟。
14. 接下来，将 200 μl 稀释的 CUG 添加到每个适当的 FACS 管中。对于未指定为具有 CUG 的管，请仅添加 FM（2.15） 。
15. 此时，应有五类管子，内容如下（此步骤不要添加 PI）：
    1. 野生型 — 无CUG或PI（有关补偿，请参阅步骤3.5-6）
    2. 野生型 - 仅使用 PI（用于补偿）
    3. 野生型 - 使用 CUG 和 PI（用于控制 Axin2-LacZ 细胞）
    4. Axin2-LacZ - 仅带 CUG（用于补偿）
    5. Axin2-LacZ - 带 CUG 和 PI（用于实际细胞分选）
    6. Axin2-LacZ - 带 CUG 和 PI（用于事件分析）
16. 保护所有试管避光，并在 37°C 加湿培养箱中孵育 25 分钟。
17. 准备新鲜的 HEPES + 胎牛血清 （FBS） 溶液，用于孵育后终止反应：
    1. 在 15 ml Falcon 管中，在 10 ml 无菌 10 mM HEPES（在 PBS 中）中稀释 400 μl 新鲜解冻的 FBS。
    2. 将试管置于冰上直至 2.16 完成。
18. 在无菌罩下向每个 FACS 管中加入 1.8 ml 冰冷的 HEPES 溶液，并关灯以尽量减少光照。
19. 以 1200 rpm 离心细胞 5 分钟。
20. 去除上清液，将细胞重悬于 300 μl FM 中，合并所有等分试样用于分选样品（用 CUG 和 PI 染色的 Axin2-LacZ）。
21. 向每个试管中加入 PI 以达到 1 μg/ml 的最终浓度。
22. 将细胞放在冰上避光。

3. 流式细胞术

1. 我们使用配备 488 nm、633 nm 和 407 nm 激光器的 BD Aria II。在斯坦福共享 FACS 设施中使用 407 nm 紫色激光检测 CUG，使用 488 nm 蓝色激光检测 PI。
2. 需要训练有素的流式细胞仪作员。预热激光器后，按照制造商的说明校准细胞仪检测器，并设置最佳分选参数，然后继续下一步。根据我们的经验，我们发现使用 100 μm 喷嘴可以优化后续实验的细胞活力。
3. 使用了以下参数：5,000 个事件时的阈值，流速小于 3,000 个事件/秒，125 伏的前向散射 （FSC） 和 250 伏的侧向散射 （SSC），PE-Cy5 通道用于 PI，Cascade Blue 用于 CUG。
4. 按顺序用 70% 乙醇和 PBS 冲洗细胞仪腔室两次。
5. 从未染色的野生型细胞（步骤 2.15 中的试管 A）开始分析。收集 1,000 个事件以确定 FSC 与 SSC 图上的细胞分布。如果不需要散射，则调整 FSC 和 SSC 参数。
6. 使用未染色的 WT（管 A）、PI 染色的 WT（管 B）和 CUG 染色的 Axin2-LacZ（管 D）细胞进行补偿。补偿将允许在不同的激光波长之间实现更准确的信号区分。
7. 使用野生型 PI 和 CUG 染色的细胞（试管 C）开始分析，并设置门控参数：
   1. 基于 FSC 与 SSC 图的碎片排除。
   2. 使用 FSC 高度与 FSC 面积图排除双合体和团块。
   3. 基于 FSC 面积与 PE-Cy5 面积图排除死细胞。
   4. 设置具有任何门放置的 FSC 区域与 Cascade Blue 区域的图。
8. 接下来，分析来自包含 Axin2-LacZ PI 和 CUG 染色细胞（管 F）的分选样品管中的 10,000 个事件。
   1. 使用野生型单元格设置的所有门都应在此处应用。
   2. 使用野生型像元的绘图，为 Cascade Blue-high 像元创建门，该门小于事件总数的 1%。
   3. Cascade Blue-high 的相同门现在包含 Axin2-LacZ 样品中大约 15-20% 的细胞，从而形成这些 Axin2-high 细胞。
   4. 使用 Axin2-LacZ 细胞的分析图，为荧光最少的 15-20% 细胞创建一个门，此后称为 Axin2-low 细胞。
9. 基于上述门控策略，将细胞分选到含有 500 μl FM 的 FACS 管中，一根管用于 Axin2-high 细胞，另一管用于 Axin2-low 细胞。在分选过程中，确保收集管位于冷却至 4°C 的腔室中。
10. 记录每个群体的流式细胞仪计数的细胞数。

4. 代表性结果（见图 2）：

使用上述方案，我们通常从野生型和 Axin2^LacZ/+ 耳蜗中回收 40-45% 的无碎片细胞（图 2A 和 B），其中约 70% 没有双峰（参见图 2A' 和 B'）。大多数分选的细胞是活的，不吸收 PI （~95%）（图 2A'' 和 B''）。平均而言，前 ~20% CUG 阳性细胞被认为是 Axin2-LacZ 阳性细胞（图 2B'''），并且与每 10-12 只动物约 15,000 个 Axin2-LacZ 高细胞相关。

对 Axin2 高细胞的流式细胞术重分选分析显示，Cascade Blue 通道的纯度大于 93%。为了进一步确认这些细胞的身份，我们使用抗 β-半乳糖苷酶抗体对 Axin2-high 和 Axin2-low 细胞进行了分选后免疫染色，发现 Axin2-high 细胞含有 ~93.4% β-半乳糖苷酶阳性细胞（分析的细胞超过 1,500 个），Axin2-low 细胞含有 ~4.8% β-半乳糖苷酶阳性细胞。

图形和表格：

图 1.实验范式。上图描述了通过协议部分描述的整体实验策略和技术。收获野生型和 Axin2^LacZ/+ 小鼠的耳蜗并解离成单细胞，然后用 CUG（β-半乳糖苷酶的荧光底物）处理。然后通过流式细胞术分离出 Axin2-LacZ-high 和 -low 细胞。单击此处查看此图像的全尺寸版本。

图 2.门控策略。该图说明了所使用的流式细胞术门控策略。A） 这里使用总共 10,000 个事件分析经过与 Axin2-LacZ 细胞相同处理的解离野生型细胞。第一个面板演示了侧向散射区 （SSC-A） 与前向散射区 （FSC-A）。在这里，一组不同的事件比那些靠近 y 轴的事件大得多。这些事件被指定为"碎片负面"。下一个门 A' 分析了面板 A 中的"碎片负"单元格，占事件总数的 43.8%（见下表）。在该面板中，前向散射高度 （FSC-H） 与 FSC-A 的对比用于排除双峰。偏离图的预期线性性质的事件将被排除。这种制备通常在指定门内产生 ~70% 的事件，其余细胞被排除在外。在图 A'' 中，PE-Cy5 通道检测到的碘化丙啶 （PI） 用于标记死细胞 （5.3%）。在下一个面板 （A''' ） 中，Cascade 蓝色通道用于检测荧光底物 CUG。在这里，LacZ 高门包括的事件总数不到 1%。B） 在这里使用总共 10,000 个事件分析用 CUG 和 PI 处理的 Axin2-LacZ 小鼠的解离细胞。此处应用了面板 A 中的相同门。B' 表明 29.5% 的细胞被排除为双峰，而 B'' 表明 5.4% 的细胞是不可存活的。使用面板 B''' 绘制 LacZ 高和低电池的初始门，其中 LacZ 高最初设置为 19.7%，LacZ 低设置为 20.4%。单击此处查看此图像的全尺寸版本。

<表 border="1">     事件编号 百分比 一个 野生型分析 10,000 个   A' 碎片负数 4,381 43.80% A'' 双峰负数 3,116 71,10% 一个 PI 阴性 2,951 94.70%   LacZ 高 16 0.54%   LacZ 低 2,790 94.50% 乙 Axin2-LacZ 分析 10,000 个   B' 碎片负数 4,218 42.2% 乙 双峰负数 2,973 70.50% B''' PI 阴性 2,813 94.6%   LacZ 高 553 元 19.70%   LacZ 低 573 元 20.40%

表 1.图 2 中门控策略的定量分析。

讨论

独立研究已经表征了新生儿耳蜗内有限的再生能力^2,10,12,13。使用GFP报告小鼠和流式细胞术，White及其同事分离出特定的耳蜗支持细胞，发现它们具有祖细胞特征¹²。

规范的 Wnt 途径已被证明可以标记多个器官系统中的干细胞/祖细胞群，包括大脑、乳腺、造血系统、皮肤和胃肠道肠隐窝。最近的工作在新生儿耳蜗⁸ 中特征不佳的细胞群中发现了活跃的 Wnt 信号传导。Axin2-LacZ报告小鼠⁹ 在耳蜗⁸ 中生成活性Wnt信号传导的忠实读数，就像在其他系统中一样^5,7。为了更好地表征这群 Axin2-LacZ 阳性细胞，我们修改并结合了几种既定方法来研究 Wnt 信号传导在调节新生儿耳蜗再生中的作用。

在细胞分选之前使用荧光偶联底物标记LacZ阳性耳蜗细胞提出了一些技术挑战，这些挑战在从转基因小鼠中分选荧光报告（例如GFP阳性）细胞时不会遇到。我们使用了一种已知的β-半乳糖苷酶荧光底物，称为3-羧铵...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
培养皿，聚苯乙烯，无菌 Geriner Bio-one 35 x 10 mm	VWR 国际	82050-540
BD Falcon 细胞过滤器，无菌，BD Biosciences，蓝色，40 &μ;男	VWR 国际	21008-949
Hanks' 平衡盐溶液 （HBSS）。 含钙、镁和不含酚红的溶液，无菌	VWR 国际	45000-456
Cellstar 离心管，聚丙烯，无菌，greiner bio-one，50 ml	VWR 国际	82050-346
Cellstar 离心管，聚丙烯，无菌，greiner bio-one，15 ml	VWR 国际	82050-278
B-27 无血清添加剂 （50x），液体	Invitrogen	17504-044
N-2 添加剂 （100x），液体	Invitrogen	17502-048
bFGF，成纤维细胞生长因子-碱性人	Sigma-Aldrich	F0291
IGF-1、小鼠胰岛素样生长因子-1	Sigma-Aldrich	I8779
EGF、人表皮生长因子	Sigma-Aldrich	E9644
Dulbecco's 改良鹰's 中等/火腿's F-12 50/50 混合物：1X，含 L-谷氨酰胺和 15 mM HEPES	VWR 国际	45000-350
BD Falcon 圆底管，一次性，聚苯乙烯，12x75	VWR 国际	60819-295
胰蛋白酶，0.25% （1X） 含 EDTA 4Na，液体	Invitrogen	25200-056
ep 双过滤器吸头 300 μL，960 吸头	Eppendorf	22491245
胰蛋白酶抑制剂，大豆，纯化< p>	沃辛顿生化	LS003570
BD Falcon 40um 细胞过滤器	BD Biosciences	21008-949
多孔板，聚苯乙烯，Greiner Bio-One，未处理板，6 孔	VWR 国际	82050-846
标记基因 FACS 蓝色 LacZ β-半乳糖苷酶检测试剂盒	Marker Gene Technologies	M0255