流式细胞术是一种强大的工具，可用于分离和研究特定的细胞群体。本方案描述了从新生转基因小鼠耳蜗组织中分离表达LacZ的细胞的步骤。在通过流式细胞术进行分离之前，将解离的耳蜗细胞使用荧光标记的β-半乳糖苷酶底物进行标记。
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摘要
摘要
分离特定细胞类型有助于分析稀有细胞群体，例如干细胞/祖细胞。由于目标细胞数量稀少且转基因报告小鼠模型有限，对内耳组织进行此类研究面临独特挑战。本文介绍了一种利用荧光标记探针选择性标记新生小鼠耳蜗中LacZ阳性细胞的实验方案。
感音神经性听力损失最常见的根本病理是耳蜗感觉毛细胞的不可逆损伤和丧失，而这些细胞是将声波转化为神经冲动所必需的。最近的研究表明，小鼠的听觉和前庭器官中含有具有再生潜能的干细胞/祖细胞1,2。这些发现值得进一步研究，包括鉴定具有干细胞/祖细胞特性的特定细胞类型。Wnt信号通路已被证明在维持多个器官系统的干细胞/祖细胞群体中发挥关键作用3-7。我们最近在新生小鼠耳蜗中鉴定出对Wnt有响应并表达Axin2的细胞，但其功能在很大程度上仍不清楚8。
为了更好地理解这些 Wnt 响应细胞在体外（in vitro）的行为，我们建立了一种从 Axin2-LacZ 报告小鼠耳蜗中分离 Axin2 表达细胞的方法9。通过流式细胞术从新生小鼠耳蜗中分离 Axin2-LacZ 阳性细胞，可进一步对活细胞开展多种实验，以研究其作为干细胞/前体细胞的生物学行为。本文详细描述了新生小鼠耳蜗显微解剖、组织解离、利用荧光底物标记 LacZ 阳性细胞以及细胞分选的具体步骤。已有研究报道过将耳蜗组织解离为单细胞及通过流式细胞术分离耳蜗细胞的技术2,10-12。我们在这些技术基础上进行了改进，建立了一种分离新生小鼠耳蜗中 LacZ 表达细胞的全新实验方案。
方案
1. 耳蜗的显微解剖
- 在通风橱内准备好解剖显微镜，用70%乙醇擦拭表面，并放置冰块。
- 在无菌条件下准备10-15个35 mm培养皿，每个培养皿中加入约一半体积（~2 ml）无菌含钙汉克斯平衡盐溶液（HBSS）。
- 在无菌条件下准备两个35 mm培养皿，每个培养皿中加入约一半体积（~2 ml）无菌1x磷酸盐缓冲液（PBS）。
- 将微型镊子置于50 ml圆锥形Falcon管中，用70%乙醇进行灭菌处理。
- 在与无菌操作台隔离的另一房间内，使用虹膜剪刀将12-15只出生后（P）0-3天龄的Axin2LacZ/+报告基因小鼠断头，并将头部置于冰块上的60 mm培养皿中。
- 使用#5 Dumont镊子和虹膜剪刀切除下颌骨和舌头，并在腭部水平处剪断颅底。
- 去除颅骨顶部的皮肤，将剪刀从枕骨大孔下部插入，沿中线剪至腭部，以横断颅底。
- 使用虹膜剪刀从腭部切口边缘向颅骨顶部两侧各做一延伸切口，注意避免损伤耳囊。
- 从枕骨大孔上缘开始，向硬腭的冠状切面方向做两个呈45度角的切口，完成颞骨的完全分离。
- 将分离出的颞骨置于含有HBSS并放置于冰块上的35 mm培养皿中。
- 收集约12-15只已处死动物的颞骨，共计24-30个颞骨。
- 将含有分离颞骨的培养皿转移至先前准备好的无菌解剖操作台（1.1）。 ....
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讨论
独立的研究已证实新生小鼠耳蜗的再生能力有限2,10,12,13。White 及其同事利用表达 GFP 报告基因的小鼠和流式细胞术分离出特定的耳蜗支持细胞，并发现这些细胞具有祖细胞特性12。
经典Wnt信号通路已被证实可标记多种器官系统中的干细胞/祖细胞群体，包括大脑、乳腺、造血系统、皮肤以及胃肠道隐窝。近期研究发现，在新生小鼠耳蜗中一个尚未充分表征的细胞群体存在活跃的Wnt信号传导8。Axin2-LacZ报告小鼠9能够像在其他系统中一样5,7，准确反映耳蜗中活跃的Wnt信号活动8。为了更深入地表征这一Axin2-LacZ阳性细胞群体，我们改进并整合了多种已建立的方法，以研究Wnt信号在调控新生小鼠耳蜗再生过程中的作用。
在细胞分选前使用荧光标记底物对 LacZ 阳性耳蜗细胞进行标记时，会遇到若干技术挑战，而这些挑战在分选转基因小鼠来源的荧光报告细胞（例如 GFP 阳性细胞）时通常不会出现。我们使用.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢 S. Heller、K. Oshima、R. Nusse 和 Y. Zeng 的有益讨论，以及 C. Tang、A. Lee、E. Liaw 和斯坦福共享 FACS 设施工作人员的技术支持。本研究得到了霍华德·休斯医学研究所医学研究培训奖学金、斯坦福大学医学学者项目（均授予 T.A.J.）、斯坦福大学院长奖学金（授予 R.C.）、美国耳科协会、耳鼻喉科研究学会、珀西纪念奖、安子山崎与杨致远教员学者基金以及 NIDCD/NIH K08 DC011043（以上均授予 A.G.C.）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 培养皿，聚苯乙烯，无菌，Geriner Bio-one 35 × 10 mm | VWR 国际公司 | 82050-540 | |
| BD Falcon 细胞筛，无菌，BD Biosciences，蓝色，40 μm | VWR 国际公司 | 21008-949 | |
| 汉克斯’ 平衡盐溶液（HBSS），含钙、镁，不含酚红，无菌 | VWR 国际公司 | 45000-456 | |
| Cellstar 离心管，聚丙烯材质，无菌，Greiner Bio-One，50 ml | VWR 国际公司 | 82050-346 | |
| Cellstar 离心管，聚丙烯材质，无菌，Greiner Bio-One，15 ml | VWR 国际公司 | 82050-278 | |
| B-27 无血清添加剂（50倍浓缩液），液体 | Invitrogen | 17504-044 | |
| N-2 补充剂（100倍浓缩液），液体 | Invitrogen | 17502-048 | |
| bFGF，碱性成纤维细胞生长因子-人 | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| IGF-1，小鼠胰岛素样生长因子-1 | Sigma-Aldrich | I8779 | |
| EGF，人表皮生长因子 | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| 杜尔贝科’s 改良伊格尔’s 培养基/Ham’F-12 50/50 混合培养基：1X，含 L-谷氨酰胺和 15 mM HEPES | VWR 国际公司 | 45000-350 | |
| BD Falcon 一次性圆底管，聚苯乙烯，12×75 | VWR 国际公司 | 60819-295 | |
| 胰蛋白酶，0.25%（1×），含EDTA 4Na，液体 | Invitrogen | 25200-056 | |
| ep Dualfilter TIPS 300μL，960个吸头 | Eppendorf | 22491245 | |
| 大豆胰蛋白酶抑制剂，纯化 | 沃辛顿生物化学 | LS003570 | |
| BD Falcon 40 μm 细胞滤网 | BD 生物科学 | 21008-949 | |
| 多孔板，聚苯乙烯，Greiner Bio-One，未处理板，6 孔 | VWR 国际公司 | 82050-846 | |
| 标记基因 FACS Blue LacZ β-半乳糖苷酶检测试剂盒 | 标记基因技术 | M0255 |
参考文献
- Li, H., Liu, H., Heller, S. Pluripotent stem cells from the adult mouse inner ear. Nat. Med.. 9, 1293-1299 (2003).
- Oshima, K. Differential distribution of stem cells in the auditory and vestibular organs of the inner ear. J. Assoc. Res. Otolaryngol
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