我们描述了一种利用 C. elegans 和RNAi饲喂文库的实验方案，可对群体中单个线虫的荧光强度、体型大小和不透光度等多个参数进行自动化测量。我们以一个筛选参与C. elegans抗真菌先天免疫相关基因的实验为例进行说明。
本文内容
摘要
摘要
RNA干扰是一种用于研究基因功能的强大方法，尤其是在全基因组范围内并结合定量分析时尤为有效。在C. elegans中，通过喂食表达与特定基因对应的dsRNA的细菌，即可简便高效地实现基因功能的敲低1。尽管已构建覆盖大部分C. elegans基因组的RNAi克隆文库2,3，为真正意义上的功能基因组学研究铺平了道路（例如参见4-7），但大多数既有的方法仍较为耗时费力。Moy及其同事开发了半自动化的实验流程，以促进全基因组范围的筛选8。该方法依赖于显微成像与图像分析。
本文介绍一种基于机器人操作细菌RNAi克隆、采用COPAS Biosort（Union Biometrica（UBI））进行定量分析，并结合集成软件MBioLIMS（Modul-Bio实验室信息管理系统，MBioLIMS）的高通量全基因组筛选替代方案。该技术可提高数据管理和样本追踪的通量。该方法支持在固体培养基平板上开展筛选实验，这对于某些研究尤为重要，例如涉及秀丽隐杆线虫（C. elegans）宿主-病原体相互作用的研究，因为某些微生物在液体培养条件下无法有效感染线虫。
我们展示了该方法如何用于量化基因在C. elegans抗真菌先天免疫中的重要性。在此情况下，该方法依赖于使用一种转基因品系，该品系携带一个表皮感染可诱导的荧光报告基因，其中绿色荧光蛋白（GFP）受抗菌肽基因nlp 29启动子的调控，同时携带一个在表皮持续表达的红色荧光报告基因。后者可作为表皮功能完整性和非特异性转基因沉默的内部对照9。当对照线虫被真菌感染时，会发出绿色荧光。通过RNAi敲低对nlp 29表达必需的基因后，感染后的荧光强度会减弱。目前，该实验方案每周可测试和分析超过3,000个RNAi克隆，使得在不到两个月的时间内完成全基因组筛选成为可能。
方案
如下所述的实验方案分为连续五天的步骤（图1）。如所注明，某些步骤可在不同日期进行。每个步骤的持续时间以及所需材料的数量（例如线虫、细菌、培养基）将取决于每次实验处理的96孔板数量。
第1天
1. 96 孔 NGM RNAi 板的制备
以下方案改编自制作线虫培养板的标准方法10，其中包含不同溶液的灭菌技术细节。
- 对于 10–12 块 96 孔板，用去离子水配制 100 mL 线虫生长培养基（NGM）2O：1.7 g BactoAgar，0.29 g NaCl，0.25 g Peptone 100 μL 胆固醇（5 mg/mL，溶于乙醇）。
- 高压灭菌 NGM（5 分钟于 121°C 100 mL，30 分钟 121°C 4升）并冷却至约 50°C （刚好冷却到可以持握）。重要的是，NGM 需保持足够温度，以免凝固。
- 每 100 mL 加入：2.5 mL 磷酸盐缓冲液 pH 6（1 M）， 100 μL MgSO₄4 (1 M) 100 μL CaCl2 (1 M) 400 μL IPTG (1 M) 100 μL 氨苄青霉素（100 mg/mL） 100 μL 四环素（12.5 mg/mL，溶于乙醇）。
- 分配 75 μL 向96孔平底板的每孔中加入NGM。为避免培养基凝固，需快速分装，建议使用多通道重复分液器（如Repeatman，Eppendorf）。确保各孔中无气泡残留。
- 立即将培养板放入湿润的孵育盒中（例如，在保鲜盒底部放置湿的纸巾）于 4°C.
注意：平板可提前一周制备，并在 4°C 下保存；这可以使后续步骤的安排更加方便。
2. 96孔深孔LB培养板的自动化制备
- 准备并分装1.5 mL含有氨苄青霉素100μg/mL和四环素12.5 μg/mL的LB培养基至96深孔板的每孔中，该深孔板每孔最大容量为2 mL。分装过程可使用自动化液体处理系统（例如TECAN）以优化操作，必要时也可手动完成。
- 为每块板加盖，并于4°C保存。为便于追踪每块96孔板，应在本步骤或后续步骤中为每块板添加唯一的标签或条形码。
注意：平板可提前 2 至 3 天制备，并在 4°C 下保存；这有助于更方便地安排后续步骤。
3. 在96孔深孔LB培养板中培养RNAi细菌克隆（过夜培养）
- 为便于后续操作，当原始RNAi文库克隆为384孔板格式时，应首先将克隆重新分配至含有添加100 μg/mL氨苄青霉素（Amp）和12.5 μg/mL四环素（Tet）并补充甘油（终浓度10%）的LB培养基的标签化或条形码标记的标准96孔板中。当原始384孔板并非所有孔均含有克隆时（例如最常用的“Ahringer”文库即为此情况），可采用多种方式组织子板。可对克隆进行重新分配，使子板中无空孔，从而最小化需筛选的板数。然而更理想的做法是在复制过程中，每块子板预留少量空孔，以便后续加入标准对照克隆（阳性与阴性对照），从而便于板间比较。随后，这些96孔子板将用于接种96深孔LB培养板，进行过夜（ON）培养。
所有液体操作步骤最好使用自动化液体处理系统（例如 Tecan）完成，但也可以手动操作，例如使用96针复制器。如果RNAi文库克隆已经处于96孔板格式，则直接进入步骤3.5。
- 将96孔RNAi子板在37°C下振荡培养（200 rpm）14-15小时。
- 确认细菌生长正常，并识别未生长的克隆。这些克隆将在后续分析中被排除。理想情况下应测定每孔的OD600，但也可通过肉眼观察判断。
- 使用前将96孔RNAi子板储存于-80°C。
- 在室温下解冻含有RNAi克隆的96孔板。解冻后可暂时存放于4°C直至使用。
- 从96孔复制板中向相应标记/条形码的96深孔LB板的每个孔中分配3 μL细菌克隆，该深孔板每孔含有1.5 mL LB培养基，并添加100 μg/mL氨苄青霉素和12.5 μg/mL四环素。用于控制RNAi效率的细菌克隆（例如本实验中的gfp(RNAi)克隆）以及阴性对照克隆，可手动加入任意可用的空孔中。
- 用粘性封板膜（例如Dutscher公司的AeraSeal细胞培养膜）密封96深孔板。将已使用的96孔复制板重新放回-80°C保存。
- 随后将标记好的96深孔板在37°C下振荡培养过夜（200 rpm，14-15小时）。
第2天
4. 将RNAi细菌克隆接种到96孔NGM RNAi平板上
此步骤应在过夜培养后的次日上午进行。
- 从4°C取出96孔NGM平板，在无菌超净工作台中放置5-15分钟使其升温并干燥。切勿将平板在超净台中放置过久（最长不超过30分钟），否则NGM可能随后开裂。为每块平板贴上相应的标签或条形码。
- 从37°C取出96深孔培养板中的过夜培养物。记录任何空孔的位置（空孔完全透明）；这些孔将在后续分析中被排除。
- 将96深孔板在4000 rpm下离心5分钟。
- 通过迅速将平板倒置来倾去上清液，并用纸巾快速擦干平板边缘。由于培养物为重组细菌，上清液需根据当地法规进行处理（例如高压灭菌）。
- 通过涡旋振荡重新悬浮细菌沉淀物（残留液体约50 μL），最好使用专用振荡器（如Tecan），以确保每块平板接受完全相同的处理。可选择测量每个孔的OD600以精确标准化后续步骤的细菌接种量，但这并非必需，我们通常不进行此项检测。
- 使用8通道或12通道多道移液器，将5 μL重悬的细菌转移至96孔NGM平板上。注意不要触碰或刺破NGM表面。此步骤可手动操作，也可使用如Liquidator96（Rainin）等自动化设备优化，实现一步完成96个RNAi克隆的分配。
- 将细菌置于无菌超净工作台中干燥，定期检查以避免NGM过度干燥。此过程大约需要2小时。
- 将96孔RNAi-NGM平板置于湿润培养盒中，于37°C过夜培养。
5. 准备同步化的线虫群体
在此步骤中，我们使用携带目标报告基因的转基因线虫（例如，感染可诱导的 pnlp-29::GFP 构建体，以及作为内参对照的组成型表达的 pcol-12::dsRed 转基因构建体）。由于观察到转基因表达随时间推移而下降，我们每 6 周重新解冻一批新的线虫。使用前，线虫需培养至少两代，并确保在实验前从未经历饥饿。若实验流程的第 2 天为星期二，则我们于星期五开始准备：将 30 只年轻成虫置于 9 cm 涂有 OP50 菌的 NGM 平板上，在 20°C 培养；至星期二即可进行漂白处理（见表 1）。
- 按照标准方案漂白线虫10。
- 将卵置于M9溶液中，25°C下振荡过夜，使其孵化，以获得同步化的L1幼虫群体。
第3天
6. 将线虫分配至96孔RNAi-NGM板中进行喂食及RNAi处理
此步骤应在早晨进行。将L1期同步化的线虫分配到每个96孔板中的细菌克隆中，用于喂养和RNA干扰。
- 从37°C取出96孔RNAi-NGM板，置于室温下冷却。
- 从25°C取出经漂白处理的线虫。估算每2 μL中的线虫数量，并用M9缓冲液调节，使每2 μL中含有约100–120条线虫（大约为一滴）。
- 使用重复分液器手动将2 μL的L1期线虫分配至每个孔中。检查每个孔中是否有线虫（应可见线虫在液体中游动）。
- 将板置于无菌超净台中晾干（最长不超过1小时）。定期检查板子；线虫应处于爬行状态而非游动状态。注意NGM培养基不可过度干燥，否则会开裂。
- 将板置于25°C的湿盒中培养。
7. 检测 Drechmeria coniospora 孢子的有效感染性
此步骤专用于本实验的筛选过程，包括测试不同批次的孢子以选择感染性高的孢子。因此，该步骤应尽可能在感染日（即第4天）之前完成。需要提前准备足够数量的L3-L4期线虫用于这些测试（表1）。有关D. coniospora培养的详细方法已在其他文献中描述11。
- 用少量M9缓冲液收集每种真菌培养物样品中的孢子。
- 将每种孢子悬液的一滴加到接种了OP50的大肠杆菌的35 mm NGM平板上，待其干燥。
- 加入30–40条携带目的报告基因（例如 pnlp-29::GFP）的L3-L4期线虫。
- 将感染后的平板置于25°C条件下过夜培养。
- 次日，观察线虫中GFP的诱导表达情况，并选择能够产生最明亮、最广泛且最均一的绿色荧光诱导效果的真菌批次。
第4天
8. 用 D. coniospora 分生孢子感染经RNAi处理的线虫
在蠕虫经 RNAi 喂养后 30 小时，当其发育至 L3-L4 阶段时进行此步骤。
- 确定用于向每孔分配 4 μL 孢子的孢子体积。
- 用 M9 缓冲液收集所选批次的新鲜 D. coniospora 孢子。每块 9 cm 培养皿的孢子使用 8–10 mL M9 缓冲液。
- 使用重复加样器向每孔分配 4 μL 孢子。检查每孔中是否有孢子（可观察到线虫在液体中游动）。
- 将培养板置于无菌超净台中晾干（约 1 小时）。定期检查培养板，直至线虫开始爬行。注意：NGM 培养基不可过度干燥，否则会开裂。
- 将感染后的培养板置于 25°C 的湿润培养箱中。
第5天
9. 自动定量分析前的平板观察与保存
该步骤从感染后18小时开始，在第5天进行。此时线虫应处于开始产卵的年轻成虫阶段。在此步骤中，通过肉眼观察表型：若线虫发出绿色荧光，则代表感染后的正常情况；若某个孔中GFP的诱导发生变化，则表明被沉默的基因改变了对感染的反应。
- 在荧光解剖显微镜下快速观察平板。如果平板显示出良好的总体GFP诱导，则进行下一步；否则，只要线虫仍有食物，可等待至下午以获得更好的诱导效果。
- 对每个平板进行目视评分，并记录任何表现出明显表型的孔（例如GFP无表达）。通过检查同时加入的任何对照RNAi克隆所获得的结果，这一初步分析可初步判断实验是否成功。
- 使用8通道或12通道多通道移液器，将线虫以100 μL的50 mM NaCl-0.05% Triton溶液转移至相应标记或条码化的96孔圆底板中。将平板在-80°C下冷冻保存，直至进行分析。
- 在分析当天，将平板于室温下解冻，并使用COPAS Biosort进行自动化分析。该分选仪分析一个平板需22分钟。平板在分析前于室温下放置不得超过1小时，且不可再次冷冻。
- 从COPAS Biosort获得的数据被转录至Excel文件中，用于初步的数据质量核查。COPAS Biosort测得的原始数据（包括光密度（消光值）、轴向长度（飞行时间）、以及三个不同检测器同时检测的荧光发射信号）随后被存储至专用的LIMS系统（MBio LIMS, Modul-Bio）中，用于后续的详细定量分析。
10. 代表性结果
根据上述提供的线虫和细菌用量，实验结束时，大多数孔中的动物应均已发育至成虫阶段，且所有孔中仍应残留部分食物。在此条件下，大多数孔中还应含有卵。每个孔中应有足够数量的成虫，以确保生物分选仪（Biosort）能够获取至少50条个体线虫的数据。另一方面，如果RNAi效率较高，则大量RNAi克隆将引发可见的表型。例如，线虫可能出现运动不协调，或更明显的表型如不育或发育停滞。此类表型应较为常见，通常每块96孔板至少应有一个孔中的线虫表现出明显的RNAi表型。当关注的表型为GFP报告基因的表达时，含有gfp(RNAi)克隆的孔可作为可靠的对照（图2）。其他表型，例如体型变化，也可通过生物分选仪轻松测量（图3A）。我们观察到，当某孔中食物耗尽时，线虫极少发生迁移至邻近孔的现象（频率<1%，BS，未发表结果）。
敲低不同类别的基因功能可能会影响 C. elegans 中转基因的表达。其中一些基因对转基因表达具有非特异性的需求12；而另一些基因，例如组织特异性转录因子——表皮GATA因子ELT-313，则仅在特定细胞亚群中发挥作用。这正是本实验方案所用菌株中包含一个无关的、组成型表皮细胞转基因报告基因（pcol-12::dsRed）的原因之一。该对照系统有助于将上述非特异性作用的基因与特异性参与所研究基因调控过程的基因区分开来（图3B和3C）。该转基因在所有幼虫阶段均有表达。若实验涉及胚胎中基因表达的检测，则需要采用不同的对照报告基因。
本方案的创新之处之一是使用冷冻平板以推迟其分析时间。冷冻可使平板保存长达两周，而不会显著改变实验结果。尽管所测荧光的绝对值可能发生变化，但其相对比值仍保持相似（图4）。另一方面，RNAi 是一种本质上具有变异性的实验操作14。为了获得可靠的结果并排除大量潜在的假阳性，RNAi 筛选至少需要重复一次。如果实验操作成功，则在不同日期检测的同一块平板的结果之间应存在合理的相关性。特别是那些具有显著效应的基因，即使在重复平板之间的精确定量效应不完全一致，也应能够被明确识别（图5）。
图1. 典型实验的整体方案。
图 2. 使用靶向 GFP 表达的克隆进行对照 RNAi 实验。转基因线虫在固体培养基的 96 孔板中培养，其组成包括持续表达的 pcol-12::dsRed 报告基因和可诱导表达的 pnlp-29::GFP 报告基因，使用配备可同时观察红色和绿色荧光滤光片组的 GFP 体视显微镜进行观察。线虫分别暴露于对照组（上排）或 GFP RNAi 克隆（下排）中 48 小时。左侧图显示未感染线虫，右侧图为感染 D. coniospora 18 小时后的线虫。比例尺为 1 mm。
图 3. 96 孔板的定量分析。COPAS Biosort 为每条被分析的线虫生成数值数据。图中显示了飞行时间（TOF；A），该参数对应于线虫的大小15，红色荧光（B），以及绿色荧光与 TOF 的比值（乘以 100）（C），这些数据来自转染了组成型表达 pcol-12::dsRed 报告基因和可诱导表达 pnlp-29::GFP 报告基因的转基因线虫。这些线虫在 96 孔板的固体培养基上，与不同的 RNAi 克隆共同培养 48 小时后，再感染 D. coniospora 18 小时。某些克隆（如图 A 中箭头所示）会引起生长缺陷和/或影响 pcol-12::dsRed 的表达。另一些克隆则特异性影响 GFP 的表达，如图 C 中箭头所示。该特定克隆靶向的基因为 nsy-1，此前已证明该基因在调控 nlp-29 中具有重要作用13。绿色荧光、红色荧光和 TOF 的测量值单位为任意但恒定的单位。
图4. 同一实验中活体样本与冻存样本所得数据的比较。携带 pnlp-29::GFP 和 pcol-12::dsRed 转基因的 L4 期线虫培养板，部分接种 D. coniospora，部分不接种。18 小时后，每块培养板大致分为两半；其中一半立即进行分析，另一半在 -80°C 冻存 24 小时后解冻并分析。对每个样本分别计算平均 TOF（线虫大小）、EXT（光密度）以及 Green 和 Red 荧光值。该图显示了冻存样本与活体样本中，感染组与未感染组平均值的比值（线虫数量分别为 n = 7638 和 5096，以及 8634 和 3850）。
图5. 96孔板重复实验的比较分析归一化荧光比值（每孔的平均荧光比值（此处为100×绿色/TOF）除以经修剪（25th 至 75th （百分位数）来自对一个代表性96孔板的每个孔进行重复分析后所得每块板的平均值。
| 材料 | 实验时间表 |
| 星期四
|
表1. 30块板的一循环实验示例。
本文列出了进行一轮30块板的实验所需材料，以及从第1步到第12步、为期9天的实验时间安排。
线虫生长培养基（NGM），100 mL：
| 0.3 g | NaCl |
| 0.25 g | BactoPeptone |
| 2 g | BactoAgar |
| 100 μL | 5 mg/mL 胆固醇溶于乙醇 |
| 加入去离子水至 100 mL | |
| 121°C 高压灭菌 5 分钟，冷却后加入以下成分： | |
| 100 μL | 1 M MgSO4 |
| 100 μL | 1 M CaCl2 |
| 2.5 mL | 1 M KPO4 pH 6.0 |
用于96孔板RNAi处理的NGM培养基，100 mL：
| 0.29 g | NaCl |
| 0.25 g | BactoPeptone |
| 1.7 g | BactoAgar |
| 100 μL | 5 mg/mL 乙醇溶解胆固醇 |
| 加入去离子水至 100 mL | |
| 121 °C 高压灭菌 5 分钟，冷却后加入以下成分： | |
| 100 μL | 1 M MgSO4 |
| 100 μL | 1 M CaCl2 |
| 2.5 mL | 1 M KPO4 pH 6.0 |
| 400 μL | 1 M IPTG |
| 100 μL | 100 mg/mL 氨苄青霉素 |
| 100 μL | 12.5 mg/mL 四环素 |
漂白剂溶液，5 mL：
2.5 mL H2O
2.3 mL 次氯酸钠溶液
0.2 mL 50% NaOH
50% NaOH，100 mL：
50 g NaOH
加入去离子水至 100 mL
50 mM NaCl-Triton 0.05%，400 mL：
4 mL NaCl 5 M
1 mL Triton 20%
加去离子水至 400 mL
Triton 20%，10 mL：
2 mL Triton X-100
8 mL 去离子水
M9 缓冲液，1L
6 g Na2HPO4（分子量：178）
3 g KH2PO4（分子量：136）
5 g NaCl
加去离子水至 1 L
高压灭菌
加入 1 mL 1 M MgSO4
LB 培养基（Luria Broth），1 L：
10 g BactoTryptone
20 g 酵母提取物
10 g NaCl
加去离子水至 1 L
高压灭菌
1 M MgSO4，300 mL：
73.95 g MgSO4
加入去离子水至 300 mL
121°C 高压灭菌 20 分钟，室温保存
5 mg/mL 胆固醇，200 mL：
1 g 胆固醇
加入 100% 乙醇至 200 mL
过滤除菌，室温保存
1 M CaCl2，500 mL：
27.75 g CaCl2
加去离子水至 500 mL
过滤除菌，室温保存
1 M KPO4 pH 6.0，4 L：
517 g KH2PO4（分子量：136）
207 g K2HPO4（分子量：174）
加入去离子水至 4 L
100 mg/mL 氨苄青霉素（Amp），10 mL：
1 g 氨苄青霉素
加入去离子水至 10 mL
于 -20 °C 保存
1 M 异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG），10 mL：
2.38 g IPTG
加入去离子水至 10 mL
于 -20 °C 保存
12.5 mg/mL 四环素，100 mL
1.25 g 四环素
加入 100% EtOH 至 100 mL
表2. 溶液。
讨论
本方案允许在固体培养基上对C. elegans进行大规模RNAi筛选，以荧光报告基因的表达水平作为检测指标。该方法已通过自动化工具优化，便于高通量检测，能够高效、可靠且可重复地快速处理大量样本。此外，已有其他方法被报道，这些方法对自动化液体样本处理的依赖程度较低8。
该实验方案的一个关键组织环节是通过与公司 ModulBio 合作，将商用 MBioLIMS 软件适配于 RNAi 筛选流程，从而建立了一种可靠的样本追踪方法。在操作的每个阶段，目前均通过 LIMS 系统生成的条形码对微孔板进行识别。由于 LIMS 还记录了每块板上每个孔中克隆的身份信息，因此从孔到候选基因的追溯变得十分简便。此外，LIMS 与公共数据库 WormBase 相关联，可直接获取任意特定基因的分子与功能数据。LIMS 还支持在微孔板、染色体乃至全基因组水平上进行数据分析。对于这些分析，数据的存储方式与先前描述的工具（如 COPAmulti 16）完全兼容。
该方法中的一个关键实验要点是根据线虫数量调整食物的用量。对于许多实验而言，必须确保线虫在实验结束时不处于饥饿状态，但同时在实验开始时也不应提供过多食物。我们观察到，在携带 pnlp-29::GFP 报告基因的线虫中，食物密度过高会降低荧光诱导水平。这可能反映出当线虫培养在过多细菌中时，感染效率有所下降（BS，未发表结果）。同时，RNAi 细菌的培养条件也至关重要，因为它决定了 dsRNA 是否能够达到最佳表达水平。某些大规模 RNAi 实验方案要求在接种液体培养物之前，先将 RNAi 克隆培养于琼脂平板上8。我们在省略该步骤的情况下仍获得了稳定的基因沉默效果。我们选择过量培养每种菌液，以确保结果的一致性。事实上，本方案所提供的材料足以同时进行 2 至 3 次筛选实验。然而，为了获得最可靠的结果，我们更倾向于使用独立培养的线虫、RNAi 细菌和真菌孢子，进行平行重复实验。
另一个关键步骤是使用湿度适中的培养基，既不能太潮湿也不能太干燥。如果培养板不够干燥，RNAi细菌无法充分干燥，线虫会在实验过程中游动，这可能导致问题。例如，线虫在液体环境中无法被D. coniospora有效感染（C. Couillault，未发表结果）。相反，在过于干燥的培养板上，培养基的渗透压会升高，这会直接影响线虫的生理状态17，包括诱导某些抗菌肽基因（如nlp 29）的表达18。接种线虫和孢子时所用液体的体积至关重要，需确保能够快速有效地干燥。若向新鲜培养板中加入超过10 μL的液体，孔板可能需要数小时才能干燥，这使得难以采用机器人系统将线虫加入培养板。例如，Biosort每次分配单个线虫时会携带约1 μL的液体。目前我们仍采用手动分配线虫，这种方法也有助于避免线虫在溶液中发生沉降。
我们此前报道过对Biosort的调整，使一个96孔板可在36分钟内完成分析19。该设备的制造商UBI现已推出Biosort的改进版本，可进一步缩短分析时间。采用“FastReFlex”模式后，样品将直接进入流动池进行分析，从而绕过气泡捕获过滤器。这显著缩短了数据采集时间，整个孔板可在22分钟内完成分析，每天可处理约20块孔板。然而，如果孔板在分析前不进行冷冻，则第一块与最后一块孔板之间将存在8小时的时间间隔。考虑到实验持续时间相对较短（感染过程仅18小时），这会在不同孔板间引入不可接受的变量。冷冻孔板不仅可在分析前解决这一问题，而且在高通量分析中至关重要，因为根据当前方案并结合标准液体处理机器人，两名人员每周可轻松处理多达50块孔板。目前，我们常规每周筛选30块孔板，使得全基因组筛选可在不到两个月内完成一次。
该实验方案的一个有趣特征是使用固体琼脂培养基，从而能够开展在液体培养条件下无法进行的检测。由于线虫的生理状态会因培养条件不同而有所差异20,21，在固体培养基上进行检测也可作为常规液体培养筛选的补充。对于某些表型（例如运动能力），可直接使用96孔固体培养板进行分析。然而，在本项筛选中，由于Biosort无法从固体培养板中取样，需先将线虫转移至液体环境中再进行冷冻保存。另一方面，COPAS Biosort可实现多参数定量分析，适用于多种不同表型的测量。在任何特定筛选中，很可能并非所有测量参数都是主要的检测指标。尽管如此，这些测量数据仍具有多方面的用途。它们可用于判断实验是否正常运行。例如，可检查每个孔中线虫的数量和大小。只有在预期RNAi克隆会抑制生长或繁殖的情况下，才应出现偏离正常值的结果。若某孔中线虫数量少于20条，或个体体积比对生长无影响的标准对照（例如 gfp(RNAi)）小30%以上（以TOF为指标），则该孔应从后续分析中剔除。对于这些克隆的功能，可通过另一种实验方案进行研究，即在线虫发育已较为成熟后再使其接触RNAi细菌15。此外，不同参数还可用于优化候选基因（命中基因）的筛选，例如仅保留影响绿色荧光而不影响红色荧光的基因。具体采用何种方法筛选命中基因，将取决于筛选的类型及其确切的检测指标。鉴于定量全基因组筛选所产生的数据较为复杂，可能需要与统计学家合作进行分析。
我们所描述的方案可轻松适用于其他类型的检测。例如，在感染步骤中，D. coniospora 可替换为任何能够在固体培养基上感染的其他病原体。这一点可能具有重要意义，因为我们发现，许多在液体培养中对粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）感染至关重要的毒力因子，在固体培养基上的感染过程中并不发挥作用（E. Pradel，个人交流）。该方案也完全适用于化学化合物的测试22-24，或利用不同的细菌文库筛选具有生物活性的化合物25，因此应在 C. elegans 研究领域中具有广泛的实用性。
披露
Ewbank 实验室与 Union Biometrica 和 Modul-Bio 合作。
致谢
感谢 D. Braendle、C. L. Kurz 和 F. Montañana-Sanchis 的贡献。本项目获得了法国国家研究局（ANR）和普罗旺斯-阿尔卑斯-蓝色海岸大区议会（Conseil Regional PACA）的资助，以及法国国家健康与医学研究院（INSERM）和法国国家科学研究中心（CNRS）的机构资金支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 细菌琼脂（BactoAgar） | BD Biosciences | 214010 | |
| 氨苄青霉素（Ampicillin） | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| 蛋白胨（BactoPeptone） | BD Biosciences | 211677 | |
| 氯化钙（CaCl2） | 任意供应商（Any Supplier） | ||
| 密封膜（AeraSeal adhesive film） | Dutscher | 760214 | |
| 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl β-d-Thiogalactopyranoside, IPTG） | 赛默飞世尔科技公司（Thermo Fisher Scientific, Inc.） | AB-0481 | |
| 磷酸氢二钾（K2HPO4） | 任意供应商（Any Supplier） | ||
| 磷酸二氢钾（KH2PO4） | 任意供应商（Any Supplier） | ||
| 硫酸镁（MgSO4） | 任意供应商（Any Supplier） | ||
| 氯化钠（NaCl） | 任意供应商（Any Supplier） | ||
| 磷酸氢二钠（Na2HPO4） | 任意供应商（Any Supplier） | ||
| 氢氧化钠（NaOH） | 任意供应商（Any Supplier） | ||
| 96孔深孔板（96 deep well plate） | 赛默飞世尔科技公司（Thermo Fisher Scientific, Inc.） | AB-0932 | |
| 96孔平底板（96 well flat plate） | Falcon BD | 353072 | |
| 96孔圆底板（96 well round plate） | Falcon BD | 353077 | |
| 四环素（Tetracycline） | Sigma-Aldrich | T8032 | |
| 吐温X-100（Triton X-100） | 任意供应商（Any Supplier） | ||
| 帝肯机器人（TECAN robot） | Tecan Group Ltd. | ||
| 多通道移液器96（Liquidator96TM） | Rainin | ||
| COPAS Biosort | Union Biometrica | ||
| 实验室信息管理系统（LIMS） | Modul-Bio |
参考文献
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