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神经退行性疾病中的高内涵筛选

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DOI：

10.3791/3452

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2012年1月6日

 ,  , 
1Department of Clinical Genetics, VU University Medical Center, 2Center for Neurogenomics and Cognitive Research, Neuroscience Campus Amsterdam

本文内容

摘要

我们介绍了一种将自动细胞培养与高内涵成像相结合的方法，可高通量地可视化并定量多种细胞过程和结构。此类方法有助于进一步完善基因组的功能注释，同时识别疾病相关基因网络及潜在的药物靶点。

摘要

基因组的功能注释、分子网络的构建以及新药物靶点的鉴定，是亟需解决的重要挑战1-4。多种互补的“组学”方法为揭示众多神经退行性疾病的遗传风险因素和致病机制提供了线索，但大多数发现仍需要进行功能验证5。例如，最近一项针对帕金森病（PD）的全基因组关联研究鉴定出许多新的位点作为该疾病的風險因素，但其潜在的致病变异或致病机制尚不清楚6, 7。由于每个相关区域可能包含多个基因，若使用传统的细胞生物学技术对每个基因在与疾病相关的表型中进行功能评估，将耗时过长。

还迫切需要理解将基因突变与其所导致的表型联系起来的分子网络。疾病表型很可能是多个被破坏的相互作用共同作用的结果。利用传统的分子方法重建这些网络将耗费大量时间。此外，通过独立研究各个组分（即还原论方法）所得到的网络预测，可能会低估网络的复杂性8。这种低估可能部分解释了由于不良或毒性副作用而导致药物审批成功率较低的原因。通过高通量/高内涵细胞筛选方法获得与疾病相关通路的网络视角，并识别这些通路中的关键节点，可能有助于发现更适合作为治疗干预靶点的分子靶标。

高通量筛选（HTS）是解决这些问题的理想方法9-12，但传统方法依赖于一维的全孔细胞检测，仅对复杂的生物过程采用简化的读出方式。这些方法无法同时量化神经退行性疾病中观察到的多种表型，例如轴突运输缺陷或形态学特性的改变13, 14。该方法也不能用于研究细胞过程中或在部分细胞中发生的致病事件的动态特性。为了量化此类特征，必须转向被称为高内涵筛选（HCS）的多维表型分析方法4, 15-17。HCS 是一种基于细胞的多过程同步定量技术，相较于 HTS，能够更详细地反映细胞对各种扰动的响应。

HCS 与 HTS 相比具有多种优势18, 19，但在神经元模型中开展高通量（HT）-高内涵（HC）筛选仍存在困难，主要由于成本高昂、环境变异以及人为误差。为了利用高内涵成像在“表型组学”尺度上检测细胞反应，必须在提高灵敏度和可重复性的同时，降低变异性和误差。

本文介绍了一种利用自动化细胞培养20和高内涵成像技术在神经元细胞模型中准确、可靠地进行shRNA筛选的方法。我们描述了如何应用该方法学鉴定某一特定蛋白DJ1的调节因子，DJ1基因突变可导致常染色体隐性遗传性帕金森病21。

将高内涵成像的多功能性与高通量方法相结合，可精确量化多种表型。这有助于进一步深入理解基因组、疾病发病机制中涉及的通路，并识别潜在的治疗靶点。

方案

1. 自动化贴壁细胞培养过程（图1）20

  1. 为自动细胞培养系统准备细胞培养板的输入。使用图形用户界面（GUI）将耗材（例如移液吸头、细胞培养板、检测板）装入系统。确保机器人系统中有足够的细胞培养基、磷酸盐缓冲液（PBS）和胰蛋白酶。
  2. 手动在两块Omnitray培养板中接种SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞系，每板接种2 × 106个细胞。使用含10%胎牛血清（FBS）的Opti-MEM培养基培养细胞。通过图形用户界面（GUI）将培养板放入细胞培养机器人中。细胞将在37°C和5% CO2条件下孵育。
  3. 选择需要启动的细胞培养方案20。可从贴壁细胞培养流程22、在小鼠饲养层细胞上培养和扩增胚胎干细胞（ES细胞）23，或悬浮细胞培养22中进行选择。
  4. 选择贴壁细胞培养方案（图1），并确保调整与贴壁细胞系相关的参数文件，使融合度阈值（即Omnitray培养板上含有细胞的面积比例）设定为70%。将总胰蛋白酶消化时间设为两分钟。
  5. 指示机器人准备新的Omnitray培养板，每板接种细胞数为2 × 106个。
  6. 使用自动贴壁细胞培养方案（图1）将Omnitray培养板输入细胞培养系统。该方案包括以下步骤：培养板在系统中孵育并成像，直至达到预设的融合度阈值。若细胞在5次读数内未达到融合度阈值，则将培养板从系统中移除。当达到用户设定的融合度阈值后，细胞将被洗涤、胰蛋白酶消化并计数。随后将预定数量的细胞接种至新的Omnitray培养板中；若细胞数量充足，则指定数量的检测板将被传送至操作平台，并将设定数量的细胞分配至每孔。检测板可通过集成显微镜直接成像，或从系统中输出以进行后续处理。
  7. 指示系统为每块Omnitray培养板准备4块检测板，每孔接种总数为5,000个细胞。

2. shRNA 病毒的制备及接种至检测板（所需时间：6 天）

  1. 在含有 100 μg/ml 氨苄青霉素（Sigma-Aldrich）的 2 ml LB 培养基中，将含有 shRNA 载体（Open Biosystems, TRC1）的细菌甘油菌种过夜培养。
  2. 按照生产商的说明书（Promega Wizard MagneSil Tfx）提取质粒。
  3. 采用 RNAi 联合会高通量慢病毒生产（96 孔板）方案24制备病毒。慢病毒操作相对安全，因为用于转导的病毒颗粒为复制缺陷型，且其制备过程采用分裂基因包装策略。然而，在操作慢病毒时，仍需采取额外的生物安全措施，以最大限度降低对自身及他人的风险25。所有实验必须在 MLII 或 BSL2 级别的生物安全实验室中进行。所有接触过慢病毒颗粒的塑料制品（移液器、塑料培养皿、培养基）在丢弃前应与漂白剂孵育 24 小时。
  4. 利用 pLKO.1 GFP 质粒（Sigma-Aldrich）检测 GFP 阳性细胞百分比，计算慢病毒的感染复数（MOI）。
  5. 将慢病毒以 MOI 为 3 的条件接种至检测用培养板中。

3. 慢病毒转导及SH-SY5Y细胞的神经元分化（所需时间：6天）

  1. 将细胞加入检测板中（参见步骤1.7）。将含有shRNA慢病毒的检测板装入自动细胞培养系统。
  2. 24小时后，将检测板中的培养基更换为含0.5% FBS和0.1 μM视黄酸的Opti-MEM，以启动分化过程。SH-SY5Y细胞的分化可使神经突结构可视化，并同步细胞分裂。
  3. 在分化培养基中继续孵育检测板5天，以确保目标基因表达的最大程度敲低。
  4. 第5天，向一半检测板中加入50 μM H2O2，处理24小时，以诱导DJ1向线粒体的转位。
  5. 第6天，向细胞中加入Mitotracker CmxROS（Invitrogen），每孔终浓度为200 nM，37°C孵育30分钟。
  6. 可指示系统直接使用HC成像仪对检测板进行成像，或从系统中导出检测板以进行后续处理。

4. 检测板的自动化免疫染色（所需时间：2 天）

图像质量对于进行灵敏且可靠的高内涵筛选（HCS）至关重要。由于移液操作不准确而导致的细胞单层损伤，可能引起图像质量下降和结果不可重复。为了最大限度减少细胞层损伤，免疫染色过程采用机器人工作站完成。该流程与先前报道的方法类似26，但已针对提高通量和减少耗材使用进行了优化定制。

  1. 用 100 μl 预热至 37°C 的 4% 多聚甲醛固定细胞，在室温下孵育 20 分钟。
  2. 用 200 μl PBS 洗涤细胞，每次 5 分钟，共洗涤 3 次。
  3. 用含 0.1% Triton 的 200 μl PBS（PBST）孵育检测板，孵育 10 分钟。
  4. 用 200 μl PBS 洗涤细胞，每次 5 分钟，共洗涤 3 次。
  5. 用 200 μl 封闭缓冲液（含 5% FBS 的 PBST）在室温下孵育检测板 1 小时。
  6. 用 200 μl PBS 洗涤细胞，每次 5 分钟，共洗涤 3 次。
  7. 在 4°C 下用以下一抗孵育过夜：
    1. Goat DJ1 N20（Santa Cruz，5 μg/ml）
    2. Rabbit β-III tubulin（Sigma-Aldrich，1 μg/ml）
  8. 次日，用 200 μl PBS 洗涤细胞，每次 5 分钟，共洗涤 3 次。
  9. 在室温下用以下二抗孵育检测板 1 小时：
    1. AlexaFluor 488 donkey anti-goat（Invitrogen，2 μg/ml）
    2. AlexaFluor 647 goat anti-rabbit（Invitrogen，2 μg/ml）
  10. 用 200 μl PBS 洗涤细胞，每次 5 分钟，共洗涤 3 次。
  11. 用 Hoechst（Invitrogen；1 μg/ml）孵育细胞 10 分钟。
  12. 用 200 μl PBS 洗涤细胞，每次 5 分钟，共洗涤 3 次。
  13. 将检测板储存于 4°C，待成像时使用。

5. 高内涵图像采集与图像分析（所需时间：5 天）

  1. 使用20倍物镜对每个孔总共成像30个视野。使用FITC滤光片检测DJ1，TRITC滤光片检测线粒体，Cy5滤光片检测β-III微管蛋白，UV滤光片检测细胞核（图3）。
  2. 使用Compartmental Analysis生物应用软件（Cellomics, ThermoFisher）分析图像，以确定线粒体内Mitotracker信号的平均强度（图4B，F）。
  3. 为确定DJ1与线粒体之间的平均共定位系数，使用Cellomics Colocalisation生物应用软件（Cellomics, ThermoFisher）分析图像。按如下方式定义感兴趣区域（ROI）：ROI A — 细胞核（图4A，E），ROI B — 线粒体（图4B，F）。从ROI B中排除ROI A，以确保仅对细胞质进行分析。将线粒体定义为目标区域I，DJ1定义为目标区域II（图4C，G）。
  4. 使用Neuronal Profiling生物应用软件（Cellomics, Thermofisher）分析图像，根据β-III微管蛋白染色追踪神经突的平均长度（图4D，H）。
  5. 使用Opera LX全自动共聚焦成像系统（Perkin-Elmer）对培养板进行成像。使用60倍水浸物镜，对每个孔总共成像30个视野。使用561 nM激光检测线粒体，UV激发光检测细胞核。
  6. 使用斑点-边缘-脊（Spot-Edge-Ridge, SER）纹理特征算法分析图像。SER-Ridge滤波器可传递形成脊状模式的像素强度。线粒体越碎片化，SER-Ridge评分越高（图8）。

6. 数据标准化与分析

  1. 将图像分析软件中的数据导入 R 软件环境（R 版本 2.11.1，BioConductor 版本 2.6）中的 BioConductor CellHTS2 软件包。
  2. 在基于每块板中位数进行标准化之前，对数据进行以 2 为底的对数转换27, 28。不要对每块板应用方差调整。
  3. 为了鉴定表型的调控因子，对不同处理组之间进行双向方差分析，即：Scrambled 感染未处理细胞 vs. Scrambled 毒素处理细胞 vs. 目标基因未处理细胞 vs. 目标基因处理细胞（图 5-7）。

7. 代表性结果

DJ1基因内的突变可导致早发性隐性帕金森综合征21，但目前尚不清楚DJ1功能缺失如何引发疾病表型。已知缺乏DJ1的细胞对氧化应激诱导的细胞死亡更为敏感，并且在氧化应激条件下，DJ1会从细胞质转位至线粒体29, 30。通过构建高通量筛选（HC）检测方法来监测这些表型，我们可以鉴定出调控或影响DJ1相关表型的基因。该方法有助于解析DJ1所参与的生物学通路，以及这些通路在疾病发病机制中的潜在作用。

DJ1 存在上位性相互作用的一个示例（图5）：在暴露于毒素的细胞中，DJ1 基因沉默导致细胞活力显著降低（BAR-B：图像-B），相较于感染了乱序慢病毒的细胞（BAR-A：图像-A）。靶基因A的沉默所产生的效应与DJ1沉默细胞中观察到的效果相似（BAR-C：图像-C）。当同时沉默DJ1和靶基因A时，细胞活力的下降程度明显大于任一基因单独沉默所造成的影响（BAR-D：图像-D）。这表明DJ1与靶基因A之间存在上位性相互作用。

调控DJ1转位的基因示例（图6）：当细胞暴露于毒素时，DJ1从细胞质转位至线粒体，DJ1与线粒体之间的重叠系数升高可量化该过程（BAR-A：图像A与BAR-C：图像C）。在靶基因B被沉默的细胞中，当细胞暴露于毒素时，较少的DJ1转位至线粒体。这表明靶基因B参与了DJ1向线粒体的转运过程。（BAR-B：图像B与BAR-D：图像D）

参与神经元轴突发育的基因示例（图7）：在野生型SH-SY5Y细胞中，敲低目标基因C可显著增加神经突长度（BAR-B：图像B），相比之下，感染表达乱序shRNA的慢病毒的细胞则无此现象（BAR-A：图像A）。该效应在经毒素处理的细胞中消失（BAR-C和D）。

参与线粒体形态调控的基因示例（图8）：与感染乱序慢病毒的细胞（图8，图像A和B）相比，用靶向基因D的shRNA感染野生型SH-SY5Y细胞后，线粒体SER-脊状结构分割值降低（图8，图像C和D）。

figure-protocol-1
图1。 自动化细胞培养流程示意图。请点击此处查看此图的高清版本。

figure-protocol-2
图 2. 筛选过程、图像分析及筛选过程中所用统计方法的示意图：i) 细胞培养至融合后，接种至含有 shRNA 慢病毒的检测板中。细胞分化 5 天后，向检测板中加入毒素并作用 24 小时。随后将检测板从系统中取出并进行免疫染色。括号中显示了每个步骤所需的时间。ii) 使用 HC 成像仪（检测细胞活力、蛋白转位和神经元突起生长）和自动共聚焦成像仪（检测线粒体形态）获取数据。数据导出至 R 语言中的 CellHTS2 软件包，进行以 2 为底的对数转换并归一化处理。采用双因素方差分析（Two-way ANOVA）识别不同变量间的显著性相互作用。请点击此处查看本图的高清版本。

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图3. 通过高内涵成像获得的细胞复合图像。A) 未处理的细胞，B) 经 H2O2 处理的细胞。DJ1 以绿色标记，线粒体为红色，细胞核为蓝色。神经突染色未被突出显示。

figure-protocol-4
图4. 从高内涵筛选（HCS）获得的多种细胞特征的定量分析。A-D) 未经处理的SH-SY5Y细胞；E-H) 经H2O2处理的SH-SY5Y细胞。A, E) 细胞核分割及ROI A区域的定义；B, F) 线粒体的识别与定量，ROI B区域；C, G) DJ1蛋白的识别，靶标通道II；D, H) 神经突平均长度的识别与计算。位于图像边缘附近的细胞被排除在分析之外。插图显示的是分析前的原始图像。

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图5. 与DJ1基因存在上位性关系的基因的鉴定（柱状图上的字母对应图像上的标号）。图像A至D为用Mitotracker CMXRos（红色）标记的SH-SY5Y细胞，用于细胞健康状态的定量分析。

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图6. 调控DJ1转位的基因鉴定（柱状图上的字母对应图像上的标注）。图像A至D为SH-SY5Y细胞，分别标记DJ1（绿色）、线粒体（红色）和细胞核（蓝色），用于定量分析DJ1向线粒体的转位。

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图7. 参与神经元轴突发育的基因鉴定（柱状图上的字母对应图像上的标注）。图像A至D为SH-SY5Y细胞，经β-III微管蛋白（绿色）和细胞核（蓝色）标记，用于轴突长度的定量分析。

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图8. 参与调控线粒体形态的基因的鉴定。图像A和C分别为感染了乱序shRNA或靶向基因D的shRNA的SH-SY5Y细胞的复合图像。线粒体显示为红色，细胞核显示为蓝色。图像B和D为SER-Ridge定量分析的可视化结果。

讨论

随着高通量/高内涵（HT/HC）细胞筛选系统的成本不断降低，以及能够有效调控基因功能的全基因组工具的广泛应用，HT/HC筛选在学术界正变得越来越普遍。该方法已成功应用于多个研究领域，例如癌症药物靶点的鉴定9, 31-33和胚胎发育研究34-36，甚至在解析神经精神疾病相关通路方面也展现出应用潜力37,38。然而，此类系统的实施需要投入大量时间和精力，流程优化通常至少需要6个月。所有步骤，如胰酶消化时间、移液速度和接种密度等，都必须进行调整，以确保细胞健康并保持稳定的生长状态。防止细菌污染是自动化细胞培养面临的最大挑战之一，必须每周进行系统清洁，并持续使用70%乙醇冲洗所有液体管路，才能实现无污染的培养。此外，还需进一步改进机器人系统，以便整合更多仪器，例如用于更高分辨率成像的共聚焦显微镜以及用于化合物储存的-80°C超低温冰箱。

此外，还需要解决一些局限性，以提高该方法在研究基因网络和鉴定参与致病分子通路的基因方面的灵敏度、速度和实用性。

为了开展高通量/高内涵筛选并确保收集到可靠的数据，需要优化多个方面。首先，测量的可靠性至关重要，而这取决于检测方法的稳健性和灵敏度。例如，上文所述的检测方法适用于较小规模的筛选，但由于图像采集前需要进行较多的处理步骤，因此难以在全基因组范围内实施。因此，需要构建稳定表达报告基因的细胞系，从而实现直接成像，并因减少处理步骤而降低变异程度。目前，设计一种能够准确呈现并可靠量化目标表型的检测方法，仍是高内涵筛选过程中的主要瓶颈。

许多筛选在哺乳动物细胞中进行，使用不同的RNAi文库，而这些文库均存在脱靶效应、基因沉默效率有限以及基因组覆盖不完全的问题。因此，需要构建更具特异性、更强效且覆盖更全面的文库。目前已有多个项目正在致力于开发此类文库(http://www.sigmaaldrich.com/life-science/functional-genomics-and-rnai/shrna/library-information.html)，期望这些努力能够提高高通量/高内涵筛选结果的可重复性。

许多大规模基于细胞的筛选实验存在一个局限性，即这些实验通常在神经母细胞瘤细胞中进行，因为此类细胞易于进行遗传操作，并可相对容易地培养至较大数量。然而，在离体细胞培养模型中鉴定出的“阳性结果”与体内实际情况的相关性 体内 其功能尚存疑问，尤其是因为大脑由高度特化的细胞类型组成，这些细胞类型通过密集而复杂的突触连接网络，形成功能高度整合的统一体。因此，通常需要利用其他技术以及更具生理相关性的模型，在二次筛选中对上述筛选方法所鉴定出的阳性结果进行验证 39为了提高高内涵筛选（HCS）中所鉴定出的阳性结果的可转化性，需要开发并优化更具代表性且更为复杂的模型，例如原代细胞、分化后的干细胞或共培养系统，以适用于高通量/高内涵（HT/HC）研究方法。

通过结合自动化的细胞培养和高内涵成像技术，可以快速深入了解神经元的功能机制，并确定哪些通路在疾病发生过程中起重要作用。将高内涵筛选/高通量筛选数据与其他组学方法产生的信息相结合，将有可能构建脑部疾病的系统生物学全景，从而推动治疗策略的开发。

披露

我们无任何利益冲突需要披露

致谢

感谢 Hamilton 的程序员和专家们持续提供的支持，以及 Eva Blaas 提供的技术协助。本工作得到了两项荷兰科学研究组织（NWO）投资拨款（911-07-031 和 40-00506-98-10011）、2009 年 Princess Beatrix 基金会科学奖以及阿姆斯特丹神经科学园区的支持；S.J. 的研究由 Ti-Pharma（T5-207）资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
AI.CELLHOST汉密尔顿公司http://www.hamiltonrobotics.com/en-uk/applications/cellomics/
OPTI-MEMInvitrogen31985-054
视黄酸Sigma-AldrichR2625
OMNITRAY 培养板Nalge Nunc International465219
96 孔培养板Greiner Bio-One655086
DJ1 N20 抗体Santa Cruz Biotechnology, Inc.SC27004
βIII 微管蛋白抗体Sigma-AldrichT3952
MitoTracker CMXRosInvitrogenM-7512
H–CHST-33342InvitrogenH1399
过氧化氢Sigma-Aldrich216763-100ML
胰蛋白酶Invitrogen25050014
杜尔贝科’S 磷酸盐缓冲液Invitrogen14190086
PROMEGA WIZARD MAGNESIL TFX Promega Corp.A2380
shRNA 克隆Open Biosystemshttp://www.openbiosystems.com/RNAi/shRNALibraries/ TRCLibraryDetails/
CELLomics 生物应用赛默飞世尔科技公司http://www.thermo.com/hcs

参考文献

  1. Geschwind, D. H., Konopka, G. Neuroscience in the era of functional genomics and systems biology. Nature. 461, 908-915 (2009).
  2. Ge, H., Walhout, A. J., Vidal, M. Integrating 'omic' information: a bridge between genomics and systems biology. Trends. Genet. 19, 551-560 (2003).
  3. Zhu, H., Snyder, M. 'Omic' approaches for unraveling signaling networks. Curr. Opin. Cell. Biol. 14, 173-179 (2002).
  4. Jain, S., Heutink, P. From single genes to gene networks: high-throughput-high-content screening for neurological disease. Neuron. 68, 207-217 (2010).
  5. Manolio, T. A. Finding the missing heritability of complex diseases. Nature. 461, 747-753 (2009).
  6. Nalls, M. A. Imputation of sequence variants for identification of genetic risks for Parkinson's disease: a meta-analysis of genome-wide association studies. Lancet. 377, 641-649 (2011).
  7. Simon-Sanchez, J. Genome-wide association study confirms extant PD risk loci among the Dutch. Eur. J. Hum. Genet. 19 (6), 655-661 (2011).
  8. Van Regenmortel, M. H. Reductionism and complexity in molecular biology. Scientists now have the tools to unravel biological and overcome the limitations of reductionism. EMBO. Rep. 5, 1016-1020 (2004).
  9. Aherne, G. W., McDonald, E., Workman, P. Finding the needle in the haystack: why high-throughput screening is good for your health. Breast. Cancer. Res. 4, 148-154 (2002).
  10. An, W. F., Tolliday, N. J. Introduction: cell-based assays for high-throughput screening. Methods. Mol. Biol. 486, 1-12 (2009).
  11. Mayr, L. M., Bojanic, D. Novel trends in high-throughput screening. Curr. Opin. Pharmacol. 9, 580-588 (2009).
  12. Hertzberg, R. P., Pope, A. J. High-throughput screening: new technology for the 21st century. Curr. Opin. Chem. Biol. 4, 445-451 (2000).
  13. Conrad, C., Gerlich, D. W. Automated microscopy for high-content RNAi screening. J. Cell. Biol. 188, 453-461 (2010).
  14. Thomas, N. High-content screening: a decade of evolution. J. Biomol. Screen. 15, 1-9 (2010).
  15. Arrasate, M., Finkbeiner, S. Automated microscope system for determining factors that predict neuronal fate. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 3840-3845 (2005).
  16. Dragunow, M. High-content analysis in neuroscience. Nat. Rev. Neurosci. 9, 779-788 (2008).
  17. Varma, H., Lo, D. C., Stockwell, B. R. High throughput screening for neurodegeneration and complex disease phenotypes. Comb. Chem. High. Throughput. Screen. 11, 238-248 (2008).
  18. Durr, O. Robust hit identification by quality assurance and multivariate data analysis of a high-content, cell-based assay. J. Biomol. Screen. 12, 1042-1049 (2007).
  19. Miller, J. Quantitative relationships between huntingtin levels, polyglutamine length, inclusion body formation, and neuronal death provide novel insight into huntington's disease molecular pathogenesis. J. Neurosci. 30, 10541-10550 (2010).
  20. Jain, S., Sondervan, D., Rizzu, P., Bochdanovits, Z., Caminada, D., Heutink, P. The Complete Automation of Cell Culture. Journal of Biomolecular Screening. 16 (8), (2011).
  21. Bonifati, V. Mutations in the DJ-1 gene associated with autosomal recessive early-onset parkinsonism. Science. 299, 256-259 (2003).
  22. Ricardo, R., Phelan, K. Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (16), e755-e755 (2008).
  23. Kent, L. Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (34), e1427-e1427 (2009).
  24. Moffat, J. A lentiviral RNAi library for human and mouse genes applied to an arrayed viral high-content screen. Cell. 124, 1283-1298 (2006).
  25. Volksgezondheid, M. V. Integrale versie van de Regeling genetisch gemodificeerde organismen en het Besluit genetische gemodificeerde. Organismen. , (2004).
  26. Anderl, J. L., Redpath, S., Ball, A. J. A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity. J. Vis. Exp. (27), e1173-e1173 (2009).
  27. Wiles, A. M., Ravi, D., Bhavani, S., Bishop, A. J. An analysis of normalization methods for Drosophila RNAi genomic screens and development of a robust validation scheme. J. Biomol. Screen. 13, 777-784 (2008).
  28. Canet-Aviles, R. M. The Parkinson's disease protein DJ-1 is neuroprotective due to cysteine-sulfinic acid-driven mitochondrial localization. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 9103-9108 (2004).
  29. Blackinton, J. Formation of a stabilized cysteine sulfinic acid is critical for the mitochondrial function of the parkinsonism protein DJ-1. J. Biol. Chem. 284, 6476-6485 (2009).
  30. Gupta, P. B. Identification of selective inhibitors of cancer stem cells by high-throughput screening. Cell. 138, 645-659 (2009).
  31. Luo, J. A genome-wide RNAi screen identifies multiple synthetic lethal interactions with the Ras oncogene. Cell. 137, 835-848 (2009).
  32. Mouchet, E. H., Simpson, P. B. High-content assays in oncology drug discovery: opportunities and challenges. IDrugs. 11, 422-427 (2008).
  33. Vogt, A. Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos. Dev. Dyn. 238, 656-663 (2009).
  34. Pardo-Martin, C. High-throughput in vivo vertebrate screening. Nat. Methods. 7, 634-636 (2010).
  35. Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. J. Vis. Exp. (40), e1900-e1900 (2010).
  36. Ross, P. J., Ellis, J. Modeling complex neuropsychiatric disease with induced pluripotent stem cells. F1000. Biol. Rep. 2, 84-84 (2010).
  37. Ebert, A. D., Svendsen, C. N. Human stem cells and drug screening: opportunities and challenges. Nat. Rev. Drug. Discov. 9, 367-372 (2010).
  38. An, W. F., Tolliday, N. Cell-based assays for high-throughput screening. Mol. Biotechnol. 45, 180-186 (2010).

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shRNA neurite outgrowth SER

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