富含亮氨酸重复序列的激酶2是一种大型多结构域激酶，其突变是帕金森病最常见的遗传病因。对该蛋白激酶活性的分析已被证明是理解其生物学功能及功能障碍的关键工具。本文中 体外 描述了LRRK2及其一系列突变体的激酶活性检测方法，提供了一种实验体系，用于研究LRRK2对潜在底物的磷酸化作用及其在疾病中可能发生的功能障碍。
本文内容
摘要
摘要
富含亮氨酸重复序列的激酶2（LRRK2）是一种由2527个氨基酸组成的ROCO家族蛋白成员，具有复杂的多结构域结构，包含一个GTP酶结构域（称为ROC，即复杂蛋白中的Ras样GTP酶）和一个激酶结构域1。2004年发现LRRK2基因突变可导致帕金森病（PD），使LRRK2成为大量研究的焦点，旨在揭示其正常功能以及该蛋白在疾病状态下如何发生功能异常2,3。早期对LRRK2功能的研究主要集中在其酶活性方面4-6。尽管目前尚未明确这些酶活性在突变后是否发生一致性的改变，但多个研究团队的数据强调了LRRK2激酶活性在与突变相关的细胞死亡过程中的重要性7,8。最近发表的研究报道了靶向LRRK2激酶活性的抑制剂，为实验研究提供了关键工具9-11。鉴于这些研究结果，LRRK2的酶学特性很可能为我们理解该蛋白的生物学功能提供重要窗口，但其是否可作为帕金森病的潜在药物靶点仍有待讨论。
已有多种不同方法用于检测 LRRK2 的激酶活性。最初，实验采用在哺乳动物细胞系中过表达并带有表位标签的蛋白，经免疫沉淀后，将蛋白固定在琼脂糖珠上进行检测4,5,7。随后，也使用了溶液中纯化的重组 LRRK2 片段，例如从昆虫细胞中纯化的带有 GST 标签的 LRRK2 蛋白片段（包含 LRRK2 的第 970 至 2527 位氨基酸残基）12。最近，Daniëls 等报道了从人胚胎肾细胞中分离出溶液状态的全长 LRRK2 蛋白，但该蛋白尚未广泛可得13。相比之下，GST 融合截短型 LRRK2 蛋白已可商业化获得（来自 Invitrogen，详见表 1），为展示 LRRK2 激酶活性检测方法提供了便利工具。已有多种不同方式用于报告 LRRK2 激酶活性，包括 LRRK2 自身的自磷酸化、通用激酶底物髓鞘碱性蛋白（Myelin Basic Protein, MBP）的磷酸化，以及一种人工底物 LRRKtide（基于 Moesin 蛋白苏氨酸 558 位点的磷酸化）的磷酸化；此外，还尝试使用一系列潜在的生理底物，如 α-突触核蛋白、Moesin 和 4-EBP14-17。然而，这些蛋白是否确为 LRRK2 的底物仍不明确。因此，下述实验方案将重点介绍使用 MBP 作为通用底物的方法，同时指出该系统在检测 LRRK2 针对多种潜在底物激酶活性方面的适用性。
方案
安全
以下方案利用放射性标记的ATP 32在γ磷酸位置标记P以追踪LRRK2的激酶活性。该方法基于本实验室常用的标准实验流程，因此在凝胶电泳、蛋白质印迹等步骤中 等等 材料和具体条件仅供参考，因为各实验室所使用的仪器设备和操作流程可能有所不同。含有能释放电离辐射同位素的化合物可能对人体健康造成危害，其使用受到机构和国家层面严格的许可制度和法规管控。本实验方案中的实验均在伦敦大学学院完成，并遵循该院开放源辐射使用培训要求以及安全服务部门提供的良好实验室操作规范（指南可查阅于 http://www.ucl.ac.uk/estates/safetynet/training/）。在未接受适当培训并获得监管批准前，不得尝试使用开放源辐射。负责实验室研究中开放源辐射的监管机构因国家而异。例如：在英国，为健康与安全执行局（Health and Safety Executive，HSE）http://www.hse.gov.uk/radiation/ionising/index.htm），在美国，核管理委员会（ http://www.nrc.gov/materials/miau/regs-guides-comm.html），在加拿大为加拿大核安全委员会（http://nuclearsafety.gc.ca/eng/），在德国为联邦辐射防护局（Das Bundesamt für Strahlenschutz）（http://www.bfs.de/de/bfs）。其他国家的用户应咨询其辐射安全官员，以确认当地的法规、管理条例及许可机构要求。本方案相关的安全预防措施已在正文中注明，并以放射性三叶符号（
).
1. 激酶反应的准备
所有反应混合物均在带有螺口盖并配有O形圈的1.5 ml样品管中配制，以防止放射性物质扩散。
- 在冰上解冻蛋白——LRRK2 野生型、D1994A、G2019S。
- 在冰上配制反应体系——10 nM LRRK2、0.5 μg/μl MBP、5 μl 10×激酶缓冲液，加水至终体积 50 μl。
2. 运行检测
所有使用 32P ATP 的步骤均应在指定的放射性区域中进行。
应穿戴适当的个人防护装备——根据本实验室的标准操作程序，包括实验服、双层手套和防护护目镜。
含有 32P ATP 的样品应使用 6 mm 有机玻璃屏蔽板对操作人员进行隔离，以尽量减少辐射暴露。
在适用的情况下，应使用个人监测设备——在伦敦大学学院（UCL）内，任何经认证的开放源辐射使用者必须佩戴胶片徽章，以在实验期间监测辐射暴露情况。
所有实验表面在使用前后均应使用盖革计数器检测是否存在放射性污染。
所有可能被污染的耗材均应严格按照机构关于放射性废物处理的规定进行处置。
- 开始实验前，将加热模块分别预设至 30°C 和 100°C。
- 从 -20°C 冰箱中取出 32P ATP（注意：32P ATP 的储存条件可能因供应商或所用放射性核苷酸类型而异）。使用前在容器外进行放射性扫描，并在有机玻璃屏蔽后解冻。
- 将反应物置于冰上，向每个反应体系中加入 1μl 的 32P ATP 和 10μM 的非标记 ATP。
- 用移液器充分混匀。短暂离心，使液体沉降至管底，以最大限度降低污染风险。
- 取出 15μl 反应液作为零时点样品，并加入 5μl 4x SDS 上样缓冲液，在 100°C 下变性 10 分钟以终止该样品中的反应。短暂离心，使液体沉降至管底，以最大限度降低污染风险。
- 将剩余样品放入加热模块中，在 30°C 下孵育 60 分钟。
- 在 60 分钟时间点取出 15μl 反应液，加入 5μl 4x SDS 上样缓冲液，在 100°C 下变性 10 分钟以终止反应。短暂离心，使液体沉降至管底，以最大限度降低污染风险。
3. 样品的免疫印迹及结果分析
- 样品经 SDS-PAGE 电泳分离
- 制备用于电泳的10孔4-12% Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶，使用MOPS运行缓冲液。
- 20μl 每个样品上样至凝胶时，需同时加入 7μl 尖锐染色蛋白标准梯度
- 凝胶在160 V下电泳90分钟，或直至染料前沿迁移至凝胶底部。 所有接触放射性同位素的液体均应作为放射性废物处理，并按照机构规定进行处置。伦敦大学学院（UCL）的规定指出，液体放射性废物应倒入指定的放射性废物倾倒池中，并用大量水冲洗。
- 蛋白质转移至PVDF膜 通过 western blot
- 转移缓冲液已配制，含1×Tris-甘氨酸和20%甲醇。PVDF膜和滤纸根据凝胶大小裁剪至合适尺寸，PVDF膜用冰甲醇活化，滤纸则用转移缓冲液预先润湿。PVDF膜应用圆珠笔墨水预先标记方向，以便识别取向。 从塑料外壳中取出凝胶，去除多余的丙烯酰胺，并作为放射性废物处理。
- 凝胶应与膜和滤纸组成三明治结构，确保膜与凝胶之间无气泡，然后将膜置于凝胶和阳极之间，安装于蛋白质印迹装置中。
- 在25 V条件下转移16小时。
- 转移缓冲液已配制，含1×Tris-甘氨酸和20%甲醇。PVDF膜和滤纸根据凝胶大小裁剪至合适尺寸，PVDF膜用冰甲醇活化，滤纸则用转移缓冲液预先润湿。PVDF膜应用圆珠笔墨水预先标记方向，以便识别取向。
- 蛋白转移至PVDF膜后，应于室温下将膜自然干燥。最后，将干燥的膜夹在醋酸纤维素膜之间，置于磷屏或X射线胶片上，以检测放射性标记的蛋白。曝光时间可从数小时至超过一周不等，具体取决于所用放射性同位素的比活性及反应的酶动力学特性。
- 磷屏扫描/胶片处理。若使用磷屏，应将图像保存为高分辨率的 TIFF 或位图文件；若使用胶片，则需将所得胶片用台式扫描仪扫描，并保存为高分辨率的 TIFF 或位图文件。随后可在 ImageJ 中进行图像分析，ImageJ 是美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）网站提供的一款免费软件。http://rsbweb.nih.gov/ij/).
4. 典型结果
图1展示了使用野生型、G2019S突变型和D1994A突变型LRRK2，并以髓鞘碱性蛋白（Myelin Basic Protein）作为通用磷酸受体底物进行激酶活性检测的代表性结果。LRRK2的自磷酸化信号出现在约200 kDa处，而20–40 kDa范围内出现的多条条带代表磷酸化的MBP。请注意，D1994A（激酶失活型）泳道中未出现LRRK2的自磷酸化信号，而G2019S突变则导致磷酸化水平升高。此外，激酶失活型泳道中仍可见MBP的残余磷酸化信号，这可能是由于D1994A突变未能完全消除LRRK2的激酶活性，或反应体系中存在微量污染的其他激酶所致。
图 1.
讨论
本文介绍了一种使用基本方案检测LRRK2激酶活性的方法 体外 系统。为了简洁起见，此处仅展示使用通用底物的一小时终点检测模板，但该通用实验方案适用于多种潜在底物，并可进一步拓展用于更复杂的分析，以研究LRRK2激酶活性的动力学特征。这凸显了使用该方法的一个关键优势 体外 用于研究此类蛋白质激酶活性的系统：由于能够完全控制酶和底物的浓度，因此可以生成动力学数据并计算 Km 和 V最大值 用于反应的参数值。对于更详细的动力学评估或评估假定抑制剂的影响，使用高通量系统（例如Invitrogen提供的LRRKtide底物所支持的系统）是优于本文所述方法的替代方案。
然而，必须认识到，还原论模型系统所提供的 体外 激酶活性检测仅仅是研究激酶生物学特性及其与潜在底物关系的工具之一。此类检测所得数据应与其他研究方法相结合，以全面揭示激酶的功能行为。 体外和 在细胞环境中。例如，一种被推测的底物发生磷酸化 体外 可通过质谱分析以鉴定可能的磷酸化位点，随后可通过靶向诱变进行操控（例如将丝氨酸或苏氨酸磷酸化受体残基突变为非磷酸化残基（如丙氨酸），以研究磷酸化的功能影响 离体.
解读来自实验数据时的一个关键考虑因素是 体外 此类检测系统出现I型或II型错误（假阳性或假阴性）的可能性均存在。遗憾的是，该系统的还原论特性使其容易同时产生这两类错误：在I型错误的情况下，将纯化的假定底物与纯化的激酶置于人为接近且高浓度的环境中（相较于细胞内的真实环境），可能导致非真实的磷酸化事件；相反，许多激酶在细胞内是以复合物形式发挥作用，并需要辅因子的参与才能实现对特定底物的磷酸化。如上所述，利用纯化激酶对假定底物进行磷酸化检测得到阳性结果时， 体外 然后应在细胞体系中测试该检测系统以验证结果，且对阴性结果应谨慎解读。
鉴于此，尽可能设置阳性和阴性对照对于开展激酶活性的比较研究至关重要。精心选择一个对目标蛋白具有已知活性的阳性对照，以及一个不太可能磷酸化假定底物的阴性对照，具有重要价值。LRRK2 的一个候选对照是受体相互作用激酶 3（Receptor interacting kinase 3），其激酶结构域的初级序列与 LRRK2 相近，但整体结构域结构差异较大18。该蛋白可从 Invitrogen 公司获得重组蛋白形式，并已在本实验室中作为标准对照使用。
还需注意， commercially available 形式的 LRRK2 缺乏该蛋白的 N 末端，并带有谷胱甘肽-s-转移酶标签，因此在使用该蛋白进行激酶活性检测时，应将其视为潜在的混杂因素加以考虑，因为目前尚不清楚 LRRK2 的 N 末端在其正常功能中可能发挥的作用。例如，若本实验方案所用蛋白中缺失的 LRRK2 N 末端对于将特定底物招募至 LRRK2 激酶结构域至关重要，则这将对所述底物在检测中所观察到的磷酸化水平产生重大影响 体外 上述系统。
尽管存在这些注意事项，帕金森病研究中对LRRK2生物学特性的重视程度仍凸显了本方案作为研究该蛋白行为的有力工具的重要价值 体外 环境。
致谢
作者是帕金森病英国研究会的研究员（资助号 F1002）。本工作部分得到了惠康基金会/医学研究理事会神经退行性疾病联合资助项目（WT089698）对英国帕金森病联盟（UKPDC）的支持，该联盟成员来自伦敦大学学院神经病学研究所、谢菲尔德大学以及邓迪大学的医学研究理事会蛋白质磷酸化单位。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| LRRK2 野生型 | Invitrogen | PV4873 | |
| LRRK2 G2019S | Invitrogen | PV4881 | |
| LRRK2 D1994A | Invitrogen | PV6051 | |
| 激酶缓冲液 | Cell Signaling Technology | 9802S | |
| MBP | Sigma-Aldrich | M1891 | |
| 32P g ATP | PerkinElmer, Inc. | BLU002X500UC | 500μCi, 30Ci /mMole |
| 4x LDS 上样缓冲液 | Invitrogen | NP0007 | |
| 2-巯基–乙醇 | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 蛋白质标准品 | Invitrogen | LC5800 | |
| MOPS 电泳缓冲液 | Invitrogen | NP0001 | |
| Bis-tris 丙烯酰胺凝胶 | Invitrogen | NP0321 | 4-12% 1 mm 10 孔 |
| PVDF 膜 | EMD Millipore | IPVH00010 | |
| 转膜缓冲液 | Invitrogen | NP0006 | |
| 表 1. 试剂 | |||
| 所有稀释步骤均使用去离子蒸馏水 | |||
| 盖革计数器 | Mini Instruments | ||
| SDS-PAGE 电泳槽 | Invitrogen | ||
| 转膜槽 | Invitrogen | ||
| 加热块（2个） | Eppendorf | ||
| 磷屏 | GE Healthcare | 可用X射线胶片替代 | |
| 磷光成像仪 | GE Healthcare | ||
| 曝光暗盒 | GE Healthcare | ||
| 离心机 | Eppendorf | ||
| 有机玻璃屏蔽装置 | |||
| 1.5 ml 离心管 | VWR international | 带O型圈的螺口盖 | |
| 表 2. 设备 |
参考文献
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