钙调蛋白结合蛋白的下拉实验

摘要

钙调蛋白（CaM）下拉实验是研究CaM与多种蛋白质相互作用的有效方法。该方法利用CaM-琼脂糖 beads，可高效、特异性地分析CaM结合蛋白，为探索CaM在细胞功能中的信号转导提供了重要工具。

摘要

钙（Ca²⁺)是一种通过多种机制调节细胞功能的关键离子。大量Ca²⁺ 信号转导通过一种名为钙调蛋白（calmodulin, CaM）的钙结合蛋白介导^1,2CaM 参与调控几乎所有细胞过程的多个层面，包括细胞凋亡、代谢、平滑肌收缩、突触可塑性、神经生长、炎症及免疫反应。多种蛋白质通过与 CaM 相互作用来调节这些通路。其中许多相互作用依赖于 CaM 的构象，而 CaM 在结合 Ca²⁺ 后的构象具有显著差异。²⁺ (Ca²⁺- CaM）与结合钙离子后的CaM相对²⁺无钙状态（ApoCaM）³.

虽然大多数靶蛋白结合 Ca²⁺-钙调蛋白（CaM），某些蛋白质仅与脱钙钙调蛋白（ApoCaM）结合。其中一些蛋白质通过其IQ结构域与钙调蛋白结合，包括神经调节蛋白（neuromodulin）⁴神经颗粒蛋白（Ng）⁵以及某些肌球蛋白⁶这些蛋白质已被证实对突触前功能具有重要作用⁷，突触后功能⁸，以及肌肉收缩⁹分别。它们在有或无钙离子存在的情况下结合并释放钙调蛋白（CaM）的能力²⁺ 在其功能中起着关键作用。相比之下，许多蛋白质仅结合 Ca²⁺-钙调蛋白（CaM），并需要与CaM结合才能被激活，例如肌球蛋白轻链激酶¹⁰，Ca²⁺/钙调蛋白依赖性激酶（CaMKs）¹¹ 和磷酸酶（例如钙调磷酸酶）¹²和血影蛋白激酶¹³，具有多种直接和下游效应¹⁴.

这些蛋白质对细胞功能的影响通常取决于其以依赖 Ca²⁺ 的方式与钙调蛋白（CaM）结合的能力。例如，我们检测了神经粒蛋白（Ng）与 CaM 结合在突触功能中的重要性，并研究了不同突变对该结合的影响。我们构建了在 IQ 结构域含有特定突变的 GFP 标签 Ng 载体，这些突变会改变 Ng 以依赖 Ca²⁺ 的方式与 CaM 结合的能力。对这些不同突变体的研究使我们深入理解了突触功能中涉及的重要过程^8,15。然而，在此类研究中，关键是要证明突变后的蛋白质确实具有预期的、对 CaM 结合能力的改变。

本文介绍一种检测蛋白质在有或无 Ca²⁺ 条件下与钙调蛋白（CaM）结合能力的方法，并以 CaMKII 和神经粒蛋白（Ng）为例进行说明。该方法属于亲和层析的一种，称为 CaM 拉下实验（CaM pull-down assay）。该实验利用 CaM-Sepharose 微珠检测与 CaM 结合的蛋白质，以及 Ca²⁺ 对这种结合的影响。与柱层析及其他检测方法相比，该方法显著节省时间，且所需蛋白量更少。总体而言，该方法为研究 Ca²⁺/CaM 信号通路及与 CaM 相互作用的蛋白质提供了有力工具。

方案

请参见图1，了解从匀浆开始的实验基本示意图。从制备细胞提取物到洗脱CaM结合蛋白的预计时间为六至七小时。

1. 组织制备

1. 向海马体脑片注射含有表达目标重组蛋白质粒的病毒（本示例中为绿色荧光蛋白（GFP）标记的Ng），并在过夜孵育中使组织表达该蛋白。
2. 在病毒注射后约12至18小时（根据病毒表达时间而定），准备收集组织。加入1 mL解剖缓冲液（10 mM葡萄糖，4 mM KCl，26 mM NaHCO₃，233 mM蔗糖，5 mM MgCl₂）₂，1 mM CaCl₂，以及0.1%酚红，用5% CO₂气体饱和₂ 95% O₂ 将培养的组织/插入物转移至培养皿中，并加入2 mL解剖缓冲液至插入物中，使组织完全浸没。
3. 使用解剖刀轻轻刮取海马组织，将其从插入膜上分离，收集5至10片组织切片。也可选择性地切除特定感兴趣区域（如CA1区）。使用倒置的巴斯德移液管将悬浮的组织转移至1.5 mL微量离心管中。
4. 以1,500 rcf离心1分钟，使组织与解离缓冲液分离。小心吸除上清液，注意勿扰动沉淀。
5. 对于每一片使用的切片，加入 30 至 60 μL （150 mM NaCl，20 mM Tris（pH 7.5），1 mM DTT）的匀浆缓冲液 1μg/mL 亮抑蛋白酶肽， 1μg/mL 化学阻滞剂， 1μg/mL 抑蛋白酶肽， 1μg/mL 将 pepstatin、1% Triton X-100 加入组织中，用研杵充分匀浆。
6. 为去除细胞碎片，将剩余的匀浆在1,100 rcf下离心10分钟，并小心吸取上清液，避免接触沉淀物造成污染。
7. 取上清液的10%作为输入样品（样品1）。在准备步骤3使用的CaM-Sepharose beads期间，将剩余上清液置于冰上保存。

注意：此处使用的组织为海马区脑片。然而，也可使用离体培养的神经元或其他任何细胞培养系统。若采用此类材料，请在以适当方法获取组织后，从步骤1.4开始操作。

2. 准备用于下拉实验的珠子

在处理磁珠时，为防止磁珠在管壁上干燥，应尽量回收磁珠并提高反应效率。为此，在离心前应将离心管平放旋转，使溶液润湿管壁上的磁珠。

1. 每次进行下拉实验时，将400 μL悬浮的钙调蛋白-琼脂糖微珠移入一个底部相对平坦的2 mL微量离心管中，以最大化溶液与微珠在孵育过程中的接触表面积和相互作用。
2. 在21,000 rcf下离心30秒，然后小心地通过抽吸去除上清液，注意不要扰动微珠。
3. 为洗涤微珠，向用于下拉Ca²⁺-CaM结合蛋白的微珠中加入含2 mM CaCl₂的相应匀浆缓冲液，或向用于下拉ApoCaM结合蛋白的微珠中加入含2 mM EDTA（一种已知的Ca²⁺螯合剂）的缓冲液，每管100 μL。轻轻敲击管壁使微珠重新悬浮，然后在1,500 rcf下离心1分钟。小心地通过抽吸去除上清液，注意不要扰动微珠。

注意：进行所有吸液步骤时，建议使用具有细小开口的移液枪头（例如加样枪头），以便在不吸走微珠的情况下移除溶液。

3. 蛋白质与CaM-sepharose结合

1. 将上清液均分为两份，每份体积相等。根据实验条件，向每份上清液中分别加入适量的 CaCl₂ 或 EDTA，使其终浓度达到 2 mM。
2. 将步骤 1.7 中的上清液加入已用相应匀浆缓冲液洗涤过的磁珠中。轻轻敲击离心管以混匀。
3. 将样品在 4°C 条件下于摇床上孵育 3 小时。每隔约 30 分钟重新悬浮磁珠一次，以提高结合效率。
4. 将含有样品和磁珠的离心管在 1,500 rcf 条件下离心 3 分钟。
5. 取 50μL 上清液作为未结合蛋白样品（样品 2），然后小心吸除剩余上清液并弃去。
6. 使用 100μL 相应的匀浆缓冲液，按照步骤 2.3 所述方法洗涤磁珠三次。

4. 洗脱

1. 向珠子中加入50μL洗脱缓冲液（50mM Tris-HCl pH 7.5，150mM NaCl），其中含有相反条件（10mM CaCl₂ 或 10mM EDTA）。例如，在含有Ca²⁺的缓冲液中进行匀浆和结合的样品，应使用含有EDTA的洗脱缓冲液进行洗脱，反之亦然。

可选：在将洗脱缓冲液加入珠子前将其预热至 37°C，可能提高得率。

2. 将溶液与磁珠在室温下于摇床上孵育30分钟。每隔约5分钟轻轻敲击离心管，混匀磁珠。
3. 以1,500 rcf离心3分钟，然后小心吸取上清液50μL，用于收集结合的蛋白质（样品3）。注意勿扰动磁珠。
4. 向所有样品（即匀浆液、未结合蛋白、已结合蛋白以及仍与磁珠结合的蛋白）中加入蛋白质上样缓冲液。

注意：为了最大限度地提高洗脱效率（特别是在洗脱效率较低的情况下），在加热样品前向珠粒中加入50 μL相应的洗脱缓冲液（例如，向以CaCl₂结合的珠粒中加入含EDTA的缓冲液），以帮助洗脱任何残留的结合蛋白，并重复步骤4.3中所述操作，以去除残留的结合蛋白。

5. SDS-PAGE 和蛋白质印迹

进行SDS-PAGE电泳，并通过Western印迹分析目标蛋白的表达情况，同时在相反条件下检测一种已知可结合钙调蛋白（CaM）的蛋白作为阳性对照。

6. 代表性结果

图2B展示了一个CaM下拉实验的示例，用于检测GFP标记的Ng蛋白与内源性Ng蛋白在CaM结合能力上的比较。为此，我们在离体海马脑片中过夜过表达GFP-Ng，随后将组织匀浆。将匀浆液与CaM-Sepharose微珠在含Ca²⁺或EDTA的条件下孵育。匀浆输入样本显示，除内源性Ng和钙/钙调蛋白依赖性激酶II（CaMKII）外，GFP-Ng也成功表达。正如基于已知内源性Ng结合特性所预期的那样（如图2A所示），GFP标记的Ng在无Ca²⁺条件下被洗脱（EDTA结合蛋白），而在有Ca²⁺存在时未结合（图2B）。相反，作为对照的CaMKII仅在有Ca²⁺时被洗脱（结合蛋白），在无Ca²⁺（EDTA）时则未结合。这表明CaM微珠功能正常，且洗脱过程高效。最重要的是，该结果表明GFP-Ng与ApoCaM的结合方式与内源性Ng相似，提示GFP标签并未改变我们所用重组蛋白的功能。

图1. CaM pull-down 实验流程示意图
(A) 组织匀浆液经离心去除细胞碎片。取上清液约10%作为输入样品（1）。将剩余上清液等分至不同实验条件组，并分别加入相应试剂（CaCl₂ 或 EDTA），以检测在这些条件下蛋白的结合情况。将各上清液（分别含有 CaCl₂ 或 EDTA）加入预先准备好的 CaM-Sepharose 微球中，(B) 孵育以促进结合反应。去除未结合的蛋白（2），(C) 使用含与结合条件相反试剂的洗脱缓冲液（E.B.）将结合的蛋白（3）从微球上洗脱下来。这三种蛋白样品的组成可通过 SDS-PAGE 和蛋白质印迹（western blot）分析进行检测。

图2. A.) 拉下实验中Ca²⁺依赖性CaM结合与洗脱的示意图。图中给出了两种以Ca²⁺依赖方式与CaM结合的蛋白质示例。神经颗粒素（Ng）代表与无钙CaM（apo-CaM）结合的蛋白质，而CaMKII代表与富含Ca²⁺的CaM结合的蛋白质。图中显示CaM在与匀浆蛋白孵育前处于解离状态。当在高Ca²⁺浓度（2 mM）条件下或在Ca²⁺螯合剂EDTA（2 mM）存在下孵育时，这些蛋白质将相应地与CaM结合。在EDTA条件下，由于几乎不存在Ca²⁺，Ng会与CaM结合，并可在Ca²⁺存在时从CaM-琼脂糖珠上洗脱下来。然而，CaMKII仅在高浓度Ca²⁺存在时与CaM结合，一旦Ca²⁺被螯合，便会从CaM上解离。
B.) CaM拉下实验的示例结果。该图展示了使用CaM-琼脂糖进行拉下实验后的预期结果，样品经Ng和CaMKII探针检测。在EDTA存在下与CaM结合的蛋白泳道中，内源性Ng和GFP-Ng均可见。当样品在Ca²⁺存在下与CaM孵育时，未检测到Ng结合，表明Ng仅与无钙CaM（apo-CaM）结合。而作为阳性对照的CaMKII则仅在Ca²⁺存在时与CaM结合。

讨论

本实验方案利用钙调蛋白-琼脂糖珠（CaM-sepharose beads）研究钙调蛋白结合蛋白与Ca²⁺结合的依赖性。许多蛋白质以Ca²⁺依赖的方式与钙调蛋白（CaM）结合。鉴于钙调蛋白结合蛋白的数量众多，且在多种信号通路中发挥关键作用，这类相互作用具有重要意义。在本方案中，使用钙调蛋白-琼脂糖珠在有或无Ca²⁺的条件下，从组织匀浆中分离出钙调蛋白结合蛋白。这种简单方法的结果将有助于进一步理解蛋白质如何以Ca²⁺依赖的方式与钙调蛋白相互作用。该方法与蛋白质结合研究中常用的柱层析技术不同之处在于，钙调蛋白-琼脂糖珠处于溶液中，而非固定于基质中。

该方法的一个优势是无需使用层析柱，因为省去层析柱可节省时间，无需进行柱平衡或等待重力流穿。由于效率高，CaM沉淀法所需的组织量显著少于柱层析法，并且简化了样品制备过程，因为从蛋白质样品中分离细胞碎片仅需进行短暂离心即可完成所述的CaM-Sepharose沉淀。层析柱要求蛋白样品中不能含有任何细胞碎片，这可能需要额外的纯化步骤。该方法相较于其他沉淀技术（如免...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
钙调蛋白-琼脂糖珠	GE Healthcare	17-0529-01
抗CaMKII α抗体	Sigma-Aldrich	C6974
抗神经颗粒蛋白抗体	EMD Millipore	07-425
凝胶上样移液器吸头	Fisher Scientific	02-707-138	用于吸取上清液
微量离心管（2.0 mL）	Fisher Scientific	05-408-146	用于涉及钙调蛋白-琼脂糖珠的所有步骤