解剖的斑马鱼胚胎心脏免疫染色

摘要

本文介绍了一种快速对斑马鱼胚胎心脏进行免疫染色的方法。与整体免疫染色法相比，该方法显著增强了抗体的渗透性，可在更短的处理时间内获得高分辨率图像，从而清晰显示心脏中的细胞/亚细胞结构。

摘要

斑马鱼胚胎已成为一种流行的模型 体内 因其在胚胎学和遗传学方面的优势，成为研究心脏发育和人类心脏疾病的脊椎动物模型 ^1,2每周从一对成年鱼中可轻松获得约100–200枚胚胎。发育过程中的胚胎具有透明特性，便于观察 子宫外 使其成为评估心脏缺陷的理想选择 ³任何基因的表达均可通过吗啉代技术或RNA注射进行操控。 ⁴此外，正向遗传筛选已获得一系列影响心脏发育不同方面的突变体 ⁵.

整体免疫染色是该动物模型中揭示目标蛋白在特定组织中表达模式的重要技术⁶。然而，由于心脏的物理位置以及抗体渗透性差，获得能够显示细胞或亚细胞结构的高分辨率图像一直较为困难。

此处，我们介绍一种通过先解剖心脏，再在显微镜载玻片表面进行染色的方法，以解决上述瓶颈问题。为防止小型心脏样本丢失并便于溶液操作，我们使用immEdge笔在显微镜载玻片表面画出圆形区域，将心脏样本限制在其中。染色完成后，可直接通过复式显微镜观察荧光信号。

我们的新方法显著提高了抗体的渗透性，因为胚胎鱼的心脏仅由少数几层细胞构成。对于2至6日龄的斑马鱼胚胎，可在大幅缩短的处理时间内获得完整心脏的高质量图像。该方法有望扩展应用于染色斑马鱼或其他小型动物中分离的其他器官。

方案

1. 载玻片和加湿孵育盒的准备

1. 可使用空的枪头盒等容器制作加湿盒。用铝箔纸包裹加湿盒及其盖子，以保护样品免受光照。
2. 在加湿盒内放置一叠湿润的纸巾以维持盒内湿度，防止心脏样品干燥。将一个小型微孔板置于纸巾上方，作为载玻片的支架。
3. 使用immEdge笔在显微镜载玻片表面绘制线条或圆圈，形成约5×5 mm大小的凹槽，用于容纳心脏样品。让载玻片自然干燥。
4. 将载玻片放入加湿盒中，并在每个凹槽内加入50 µL新鲜的4%甲醛溶液。

2. 胚胎心脏的解剖

1. 将鱼胚胎置于含有0.4%三卡因的E3胚胎水⁷中麻醉约1分钟，直至鱼体运动停止但心脏仍保持正常搏动。
2. 将凹面载玻片放置在解剖显微镜的载物台上。将胚胎转移至凹面孔中。
3. 调节解剖显微镜的照明条件，以清晰显示心脏。根据个人偏好，可选用暗场或类似微分干涉（DIC）的偏振光条件。
4. 用75%乙醇清洗两支胰岛素注射器，然后晾干。
5. 将显微镜调至较高倍率并聚焦于心脏。用一根针尖插入头部附近的卵黄-体节边界处，物理固定胚胎；再用另一根针尖靠近心脏区域，迅速将心脏拉出。若心脏未完全与胚胎分离，需剪断心脏与卵黄之间残留的连接组织。
6. 将显微镜调至较低倍率，聚焦于已分离的心脏。使用10μl移液器并将体积设定为1μl。将移液器吸头接触或轻吸心脏样本，使分离的心脏位于吸头内部或附着于其表面。
7. 将移液器吸头浸入已准备好的载玻片上的4%多聚甲醛溶液中，按下活塞将心脏释放至溶液内。液面张力也有助于将心脏从移液器吸头转移至溶液中。每个孔中放置少于3个心脏。

3. 免疫染色

1. 关闭孵育室，将其置于具有轻柔摇动功能的摇床上，在室温下固定心脏样本 20 分钟。
2. 擦干载玻片背面的水分，将载玻片放置于解剖显微镜的载物台上，用于缓冲液置换。
3. 将 10 μl 移液器的吸头尖端浸入每个孔中的空白区域，使吸头尽可能远离心脏样本。操作时需小心避免心脏附着到吸头，因为当溶液被吸入吸头时，心脏可能随液体流动而移动。如有需要，可调整吸头的位置。
4. 将废液排至纸巾上，并避免在吸头中产生气泡，因为气泡的存在容易导致心脏样本丢失。短暂使心脏样本部分干燥有助于其保持附着在载玻片上。
5. 加入 50 μl PBST 以覆盖心脏样本，在湿润孵育室内以缓慢摇动方式孵育 5 分钟。重复此洗涤步骤一次。完成此步骤后，心脏样本可在 4°C 条件下的湿润孵育室内保存最多 1 周。
6. 用含 10% 羊血清的 PBST 在室温下封闭心脏样本 1 小时。
7. 在含 10% 羊血清的 PBST 中，加入一抗（如 β-catenin 抗体 1:200 稀释液和 mef2 特异性抗体 1:200 稀释液），于室温孵育 1 小时。
8. 在室温下用 PBST 洗涤心脏样本三次，每次 5 分钟。
9. 在 PBST 中加入二抗（如 Alexa 标记的抗小鼠和/或抗兔抗体 1:1000 稀释液），孵育 0.5 小时。
10. 在室温下用 PBST 洗涤心脏样本三次，每次 5 分钟。

4. 成像

1. 移除 PBST，并向每个孔中加入 10 μl 封片液，轻轻摇晃孵育盒数分钟，直至溶液变澄清。
2. 吸除大部分封片液，用一张显微镜盖玻片（24×50）覆盖同一载玻片上的所有孔。
3. 使用配备 ApoTome 的 Zeiss Axioplan 2 显微镜对斑马鱼心脏进行成像。

5. 代表性结果

图1显示了一个揭示斑马鱼所有心肌细胞膜和细胞核的图像示例。使用mef2c和β-catenin抗体共同对来自52小时受精后（hpf）斑马鱼胚胎的心脏样本进行染色。其中，mef2c抗体用于标记心肌细胞的细胞核，而β-catenin抗体则显示每个细胞的边界^8-10。通过调节复合显微镜的载物台位置，可将心脏样本的图像调整至相同的方向，从而便于观察心脏的外曲面和内曲面¹¹。随后可测量总心肌细胞数量、心肌细胞大小以及细胞圆度。

另一个揭示胚胎心脏肌节结构的示例如图2所示。我们对分离的胚胎心脏使用F59（一种肌球蛋白抗体）进行了免疫染色。在较低放大倍数下，可清晰显示整个胚胎心脏中的肌原纤维网络；而在较高放大倍数下，则可观察到粗肌丝的条纹带结构（图2）⁶。

图 1. 对斑马鱼心室中心肌细胞的细胞核（mef2，红色）和细胞轮廓（β-catenin，绿色）进行免疫染色。比例尺=10μm

图2. 对斑马鱼心室中的肌球蛋白进行免疫染色，以显示低倍（A）或高倍（B）视野下的粗肌丝。比例尺=10μm

讨论

与传统的整体免疫荧光染色方法相比，我们的方法具有以下优势。首先，由于渗透性显著改善，能够稳定获得更强的荧光信号。在整体免疫染色中，围绕心脏的致密皮肤组织显著阻碍了多种抗体的渗透，导致整个胚胎背景信号偏高，这一问题在受精后3天及以上（dpf）的胚胎中尤为严重。相比之下，分离的心脏仅由数层细胞构成，因而抗体渗透效果更好。其次，由于渗透性大幅提升，整个免疫染色过程可由1天缩短至数小时。我们已成功将某些抗体（如肌动蛋白结合蛋白（Actinin）、整合素连接激酶（Ilk）和β-catenin特异性抗体）的孵育时间从1小时缩短至30分钟。第三，能够从完整的心脏样本中稳定获取高分辨率图像，从而揭示细胞/亚细胞水平的结构信息。由于心脏位于紧邻卵黄的心包腔内，使用高倍物镜难以对完整胚胎进行成像，因此若需获取完整心脏的图像，则必须进行心脏解剖。然而，在整体染色过程中常使用Triton-X-100等去垢剂以增强渗透性，这会削弱胚胎组织强度，导致心脏在解剖过程中极易破损。相比之下，活体心脏结构更为坚固，能够更容易地从周围组织中分离，因此采用本方法更易于保持心脏的完整形态。尽管分离微小的斑马鱼心脏看似具有挑战性，但大多数人在经过数次练习后即可熟练掌握该操作。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
三卡因	Research organics	3007T
甲醛	Polysciences, Inc.	04018
胰岛素注射器	BD Biosciences	329461
吐温-100	Sigma-Aldrich	T8532
抗-β-catenin 抗体	Sigma-Aldrich	C7207
抗-Mef2c 抗体	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC313
F59	Zfin
抗-α-actinin 抗体	Sigma-Aldrich	A7811
抗-Ilk 抗体	Cell Signaling Technology	#3862
Alexa fluor 568 羊抗兔 IgG	Invitrogen	A11011
Alexa fluor 488 羊抗小鼠 IgG1	Invitrogen	A21121
荧光封片剂	Vector Laboratories	H-1200
ImmEdge 笔	Vector Laboratories	H-4000
聚-L-赖氨酸包被载玻片	Electron Microscopy Sciences	63410-01
显微镜盖玻片	Fisher Scientific	12-543-D
凹面显微镜载玻片	Fisher Scientific	7-1305-8
解剖显微镜	Leica Microsystems
复式显微镜	Carl Zeiss, Inc.	Axioplan2
ApoTome	Carl Zeiss, Inc.
PBST： 1 × PBS 0.5% Triton-X 100
25× 三卡因： 400 mg 三卡因 97.9 mL ddH2O 2.1 mL (1 M Tris pH 9) 调节 pH 至 7.0