机械力在肺发育和肺损伤中起着关键作用。本文介绍一种分离啮齿类动物胎儿肺Ⅱ型上皮细胞和成纤维细胞并利用机械刺激对其进行处理的方法 体外 系统。
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本文内容
摘要
摘要
机械力的产生 在子宫内 通过类似呼吸的重复性运动和液体扩张对正常肺发育至关重要。肺发育的一个关键环节是肺泡II型上皮细胞的分化，这类细胞是肺表面活性物质的主要来源。这些细胞还参与肺泡腔内的液体稳态、宿主防御以及损伤修复。此外，出生后机械通气期间，远端肺实质细胞可能直接暴露于过度拉伸的环境中。然而，肺细胞感知机械刺激以影响肺发育并促进肺损伤的精确分子与细胞机制尚未完全阐明。本文提供一种简单且高纯度的方法，用于从啮齿类动物胎儿肺组织中分离II型细胞和成纤维细胞。随后，我们描述了一种 体外 系统，Flexcell 应变仪，用于对胎儿细胞施加机械刺激，模拟胎儿肺发育或肺损伤过程中的机械力。该实验系统为研究暴露于牵张力下的胎儿肺细胞的分子与细胞机制提供了优良工具。利用该方法，本实验室已鉴定出多个参与胎儿肺发育及肺损伤中力传导过程的受体和信号蛋白。
方案
1. 用细胞外基质蛋白包被培养板
- 在无菌条件下，每块培养板将 120 μg 层粘连蛋白与 12 ml 冷的无菌 1X PBS 混合。
- 取 Bioflex 未处理培养板，向每个孔中加入 2 ml 上述溶液（层粘连蛋白终浓度为 2 μg/cm2）。或者，也可使用其他细胞外基质蛋白，如 I 型胶原蛋白 [10 μg/cm2]、纤连蛋白 [5 μg/cm2]、玻璃粘连蛋白 [0.5 μg/cm2] 或 弹性蛋白 [10 μg/cm2]。包被方法与层粘连蛋白包被所述方法类似。确保溶液完全覆盖各孔底部。
- 用塑料膜包裹培养板，置于 4°C 平面上过夜，以使层粘连蛋白吸附至孔底。在此条件下，培养板至少可保存一周，同时仍保持良好的细胞外基质功能。
- 次日，在无菌条件下，用 1X PBS 洗涤各孔 3 次。
- 向每个孔中加入 1 ml 含 1% BSA 的 1X PBS 溶液，37°C 孵育 1 小时，以封闭膜上的非特异性结合位点。
- 用 1X PBS 洗涤培养板 3 次，以去除未吸附的蛋白质。
- 将培养板置于 37°C 的 DMEM 中，直至完成步骤 2.14 的细胞分离。
2. 胎鼠肺II型上皮细胞的分离
分离前一日，将带有不同孔径尼龙筛网的筛杯进行高压灭菌，并准备就绪。
- 在妊娠 E17-19 天时获取定时妊娠小鼠/大鼠的胎肺组织，将组织转移至含有 DMEM 培养基的 50 ml 锥形管中，并置于冰上。
- 在 50 ml 锥形管中配制消化缓冲液（总体积 10 ml），此体积适用于约 20 只小鼠/大鼠胎肺组织：
8.5 ml DMEM
0.5 ml 500 mM pH 7.4 HEPES
5 mg 胶原酶 1（Collagenase 1）
5 mg 胶原酶 1A（Collagenase 1A）
1 ml 鸡血清（heat inactivated） - 充分混匀直至所有组分完全溶解，并在无菌操作台中使用 0.2 微米注射器滤器过滤。将含有消化缓冲液的锥形管置于 37°C 水浴中预热。
- 移除步骤 2.1 中锥形管内的 DMEM 培养基，将组织转移至无菌培养皿中。
- 使用无菌剪刀或剃刀片充分剪碎肺组织，使其成为小于 1 mm 的组织块，然后将组织转移至含有步骤 2.3 中预热消化缓冲液的锥形管中。
- 通过反复吹打进行组织消化：
使用 10 ml 移液器吹打 100 次
使用 5 ml 移液器吹打 100 次
使用巴斯德移液器吹打 100 次 - 将匀浆液在室温下以 1,300 rpm 离心 5 分钟。
- 小心吸除上清液，并将含有细胞的沉淀重悬于 15 ml DMEM 加 20% 胎牛血清（FBS）中。
- 取出带有 100、30 和 15 微米尼龙筛网的筛杯，并将其放置于无菌的 150 ml 烧杯上。
- 将步骤 2.8 得到的细胞匀浆液依次通过 100、30 和 15 微米筛网的筛杯进行过滤。
- 用含 10% FBS 的 DMEM 多次冲洗 30 和 15 微米筛网，收集未通过筛网的成团细胞，以促进非上皮细胞的去除。
- 弃去 15 微米筛网的滤过液，该部分主要含有成纤维细胞。
- 将步骤 2.11 中获得的细胞接种于 75 cm2 培养瓶中，于 37°C 孵育 30 分钟（每瓶约加入 10 ml 细胞悬液），以进一步纯化 II 型肺泡上皮细胞。
- 收集上清液，并在室温下以 1,300 rpm 离心 5 分钟，使细胞沉淀。
- 小心吸除上清液，并将含有细胞的沉淀重悬于无血清 DMEM 中。重悬体积根据处理的组织量而定。通常情况下，我们将相当于一只胎鼠来源的细胞接种至每孔（2 ml），以使次日细胞融合度达到 60–70%。
- 将细胞悬液接种至预先用层粘连蛋白（laminin）或纤连蛋白（fibronectin）包被的 Bioflex 六孔板中。
3. 胎鼠肺成纤维细胞的分离
- 按照上述第2.11步之前所述的相同步骤进行II型细胞的分离。
- 取15微米滤网的滤过液（无需预先洗涤；体积约为10–15 ml），将其接种至75 cm2培养瓶中，在37°C孵育30–60分钟，使成纤维细胞贴壁。
- 吸除上清液，更换为无血清DMEM，继续孵育过夜。
- 次日，使用含0.4 mM EDTA的0.25%（wt/vol）胰蛋白酶消化收集细胞，并将其接种至预先用纤维连接蛋白包被的Bioflex培养板上。
4. 为肺细胞提供机械刺激的实验系统
- 将细胞（约50%汇合度）接种于Bioflex培养板中，每孔加入2 ml无血清DMEM，置于培养箱中孵育至少6小时，使细胞贴壁并充分伸展，之后方可进行实验。通常情况下，本实验室在施加机械应变前会将细胞继续培养约24小时。若实验需要特定数量的细胞，在分离后，II型细胞将在无血清DMEM中于75 cm²培养瓶中维持培养2 培养瓶，次日用胰蛋白酶消化细胞，计数后接种。
- 次日，更换为新鲜的无血清DMEM（2 ml/孔），并将BioFlex板安装至Flexcell FX-5000应力加载系统。实验开始前，细胞单层汇合度不应超过80%。
- 对膜施加等双轴应变。应变方案根据机械力的模拟条件而变化 体内 （参见讨论部分）。
- 在平行培养的未拉伸膜上生长的细胞用作对照。
- 实验结束后，可对单层细胞进行处理，以通过实时荧光定量PCR分析基因表达变化（例如表面活性蛋白C），或通过蛋白质印迹法检测蛋白丰度等。此外，单层细胞也可固定后用于免疫细胞化学实验。对于该技术，固定后需将硅胶膜从培养板中取出，并使用10-20 μl 以水作为封片剂，在透化及抗体孵育前使用。上清液也可用于检测生长因子、细胞因子等成分的存在。
5. 代表性结果
图1和图2 展示了使用本文所述方法分离的E18胎鼠II型细胞的代表性相差显微照片。
图3 表明，使用表面活性蛋白C作为标志物，机械应变可诱导胎儿II型上皮细胞分化。
图1. 分离后立即拍摄的代表性相差显微照片，显示胎儿Ⅱ型细胞的成团外观。
图2. 按照本文所述方法分离E18胎鼠II型上皮细胞，并接种于包被有层粘连蛋白的BioFlex培养板上。照片拍摄于次日，细胞经多聚甲醛固定后观察非拉伸状态下的形态。通过显微镜下观察上皮细胞形态及表面活性蛋白C（SP-C）免疫染色分析，确定细胞纯度为90 ± 5%。
图 3. 胎儿Ⅱ型上皮细胞在 40 次/分钟的频率下暴露于 5% 的周期性应变，持续 16 小时。A) 表面活性蛋白 C（SP-C）mRNA 表达的 Northern 印迹结果显示，在不同细胞外基质（ECM）基底上，应变可诱导Ⅱ型细胞分化。+/- 符号分别表示是否暴露于应变。数据以均值 ± 标准误表示，n=3；* P<0.05。B) 荧光免疫细胞化学图像显示暴露于机械应变（实验组）或未暴露（对照组）的胎儿Ⅱ型细胞中 SP-C 蛋白水平（绿色）。细胞核用 DAPI 复染（蓝色）。标尺，10 μm。C) 来自三项实验的 Western 印迹结果表明，机械拉伸可增加 SP-C 蛋白水平。n=3；* P<0.05。
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讨论
本文描述了一种分离胎儿II型上皮细胞和成纤维细胞的方法，并利用Flexcell应变仪对这些细胞施加机械刺激。我们已采用该技术评估上皮细胞的分化过程1,2，并研究由牵张激活的受体及信号通路3-9。此外，该方法也可用于探究由机械损伤诱导的细胞反应10,11。该操作基于用胶原酶消化肺组织，并利用II型细胞在消化后易于聚集的特性。实施该技术的关键步骤包括：充分剪碎组织以促进肺组织的消化，以及使用30和15微米筛网对未过滤的细胞进行彻底洗涤，以利于去除非上皮细胞，从而获得更高纯度的II型细胞。
我们的实验室使用包被了胶原蛋白或层粘连蛋白的膜来模拟基底膜的细胞外基质成分。然而，当细胞受到20%的拉伸时，细胞可能在拉伸过程中从基底上脱落，因此应考虑将纤连蛋白作为替代基底。
另一个重要的考虑因素是，在拉伸前应避免细胞单层达到100%汇合度，因为这可能促进细胞与细胞之间的接触，而非细胞与基质之间的接触，从而导致细胞可能无法“感知”到实验方案所设定的伸长百分比。
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 HD052670 支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| 胶原酶1 | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| 胶原酶1A | Sigma-Aldrich | C9891 | |
| 鸡血清 | Sigma-Aldrich | C5405 | |
| 筛网杯 | Sigma-Aldrich | CD1-1KT | |
| 注射器滤器 | Fisher Scientific | 09-754-25 | |
| 100微米尼龙网 | Small Parts, Inc. | CMN-100-D | |
| 30微米滤网 | Small Parts, Inc. | CMN-30-D | |
| 15微米滤网 | Dynamic Aqua-Supply Ltd. | NTX15 | |
| 层粘连蛋白 | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| 胶原蛋白-1 | Collagen Biomed | PC0701 | |
| 纤连蛋白 | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| 玻璃粘连蛋白 | Sigma-Aldrich | V-0132 | |
| 弹性蛋白 | Sigma-Aldrich | E-6402 | |
| Bioflex培养板 | Flexcell International | BF-3001U | 未包被 |
| Flexcell应力加载装置 | Flexcell International | FX-5000 |
参考文献
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