研究胎儿肺细胞力传导机制的实验系统

摘要

机械力在肺发育和肺损伤中起着关键作用。本文介绍一种分离啮齿类动物胎儿肺Ⅱ型上皮细胞和成纤维细胞并利用机械刺激对其进行处理的方法 体外 系统。

摘要

机械力的产生 在子宫内 通过类似呼吸的重复性运动和液体扩张对正常肺发育至关重要。肺发育的一个关键环节是肺泡II型上皮细胞的分化，这类细胞是肺表面活性物质的主要来源。这些细胞还参与肺泡腔内的液体稳态、宿主防御以及损伤修复。此外，出生后机械通气期间，远端肺实质细胞可能直接暴露于过度拉伸的环境中。然而，肺细胞感知机械刺激以影响肺发育并促进肺损伤的精确分子与细胞机制尚未完全阐明。本文提供一种简单且高纯度的方法，用于从啮齿类动物胎儿肺组织中分离II型细胞和成纤维细胞。随后，我们描述了一种 体外 系统，Flexcell 应变仪，用于对胎儿细胞施加机械刺激，模拟胎儿肺发育或肺损伤过程中的机械力。该实验系统为研究暴露于牵张力下的胎儿肺细胞的分子与细胞机制提供了优良工具。利用该方法，本实验室已鉴定出多个参与胎儿肺发育及肺损伤中力传导过程的受体和信号蛋白。

方案

1. 用细胞外基质蛋白包被培养板

1. 在无菌条件下，每块培养板将 120 μg 层粘连蛋白与 12 ml 冷的无菌 1X PBS 混合。
2. 取 Bioflex 未处理培养板，向每个孔中加入 2 ml 上述溶液（层粘连蛋白终浓度为 2 μg/cm²）。或者，也可使用其他细胞外基质蛋白，如 I 型胶原蛋白 [10 μg/cm²]、纤连蛋白 [5 μg/cm²]、玻璃粘连蛋白 [0.5 μg/cm²] 或 弹性蛋白 [10 μg/cm²]。包被方法与层粘连蛋白包被所述方法类似。确保溶液完全覆盖各孔底部。
3. 用塑料膜包裹培养板，置于 4°C 平面上过夜，以使层粘连蛋白吸附至孔底。在此条件下，培养板至少可保存一周，同时仍保持良好的细胞外基质功能。
4. 次日，在无菌条件下，用 1X PBS 洗涤各孔 3 次。
5. 向每个孔中加入 1 ml 含 1% BSA 的 1X PBS 溶液，37°C 孵育 1 小时，以封闭膜上的非特异性结合位点。
6. 用 1X PBS 洗涤培养板 3 次，以去除未吸附的蛋白质。
7. 将培养板置于 37°C 的 DMEM 中，直至完成步骤 2.14 的细胞分离。

2. 胎鼠肺II型上皮细胞的分离

讨论

本文描述了一种分离胎儿II型上皮细胞和成纤维细胞的方法，并利用Flexcell应变仪对这些细胞施加机械刺激。我们已采用该技术评估上皮细胞的分化过程^1,2，并研究由牵张激活的受体及信号通路^3-9。此外，该方法也可用于探究由机械损伤诱导的细胞反应^10,11。该操作基于用胶原酶消化肺组织，并利用II型细胞在消化后易于聚集的特性。实施该技术的关键步骤包括：充分剪碎组织以促进肺组织的消化，以及使用30和15微米筛网对未过滤的细胞进行彻底洗涤，以利于去除非上皮细胞，从而获得更高纯度的II型细胞。

我们的实验室使用包被了胶原蛋白或层粘连蛋白的膜来模拟基底膜的细胞外基质成分。然而，当细胞受到20%的拉伸时，细胞可能在拉伸过程中从基底上脱落，因此应考虑将纤连蛋白作为替代基底。

另一个重要的考虑因素是，在拉伸前应避免细胞单层达到100%汇合度，因为这可能促进细胞与细胞之间的接触，而非细胞与基质之间的接触，从而导致细胞可能无法“感知”到实验方案所设定的伸长百分比。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	Sigma-Aldrich	D5648
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
胶原酶1	Sigma-Aldrich	C0130
胶原酶1A	Sigma-Aldrich	C9891
鸡血清	Sigma-Aldrich	C5405
筛网杯	Sigma-Aldrich	CD1-1KT
注射器滤器	Fisher Scientific	09-754-25
100微米尼龙网	Small Parts, Inc.	CMN-100-D
30微米滤网	Small Parts, Inc.	CMN-30-D
15微米滤网	Dynamic Aqua-Supply Ltd.	NTX15
层粘连蛋白	Sigma-Aldrich	L2020
胶原蛋白-1	Collagen Biomed	PC0701
纤连蛋白	Sigma-Aldrich	F1141
玻璃粘连蛋白	Sigma-Aldrich	V-0132
弹性蛋白	Sigma-Aldrich	E-6402
Bioflex培养板	Flexcell International	BF-3001U	未包被
Flexcell应力加载装置	Flexcell International	FX-5000