创建刚性固定的骨折模型以评估膜内成骨、牵张成骨或临界尺寸缺损的愈合

摘要

本文介绍了一种基于改良Ilizarov外固定器应用的长骨骨折稳定方法^1-3。在安装固定器并制造骨损伤后，可对骨愈合过程进行评估，实施牵张成骨，或制造骨不连或临界尺寸缺损，用于研究治疗干预措施。

摘要

评估骨骼修复模式对于开发用于临床治疗骨折的疗法至关重要。机械稳定性在骨损伤愈合过程中起着重要作用。在最不利的情况下，机械不稳定可能导致人体骨折愈合延迟或不愈合。然而，一定程度的活动也能刺激愈合过程。在存在活动的骨折中，软骨会形成以稳定骨折端，并通过重现软骨内成骨的发育过程，逐渐被骨组织替代。相反，如果骨折骨被刚性固定，则骨组织通过膜内成骨方式直接形成。临床上，软骨内成骨与膜内成骨通常同时发生。为了有效模拟这一过程，研究者按照 Bonnarens⁴ 描述的方法，将一根针插入骨折骨的髓腔中。该实验方法可提供良好的侧向稳定性，同时允许保留一定程度的旋转不稳定性。然而，通过实验手段分别隔离这两种过程，也有助于加深我们对调控这两种不同愈合机制的理解。我们已开发出一种可同时提供旋转和侧向稳定性的固定方案。在此模型中，仅观察到膜内成骨这一种愈合方式，因此可在不同遗传修饰小鼠品系之间^5-7、应用生物活性分子后^8,9、改变愈合的生理参数后¹⁰、调整固定程度或固定时间后¹¹、牵张成骨后¹²、建立骨不连模型后¹³，或创建临界尺寸骨缺损后，对愈合参数进行比较。本文中，我们展示了如何在小鼠中应用改良的 Ilizarov 外固定器研究胫骨骨折愈合及牵张成骨过程。

方案

所有实验程序均经加州大学旧金山分校（UCSF）机构动物照护与使用委员会批准，并符合国家指南。

1. 手术前固定剂的制备

1. 在创建稳定骨折模型之前，需要组装定制的外固定装置。定制的外固定架由两个铝环组成，通过三根不锈钢#0/56带螺纹杆、8个#2/56六角螺母和17个匹配的螺栓（Small Part Inc., Miami Lakes, FL³）固定。
2. 每处骨折需要两个铝环。将4个#2/56六角螺母（Small Part Inc., Miami Lakes, FL）和匹配的螺栓装入其中一个环的适当孔位中，保持松动状态，此为近端环。在远端环上安装3个螺母和螺栓，同样不要完全拧紧。

2. 麻醉、骨折造模与固定器应用

1. 根据实验需求选择小鼠（年龄、性别和体重由使用者确定），通过腹腔注射 50 mg/ml 氯胺酮和 0.5 mg/ml 美托咪啶（每只小鼠 0.03 ml）进行麻醉。
2. 在小鼠眼睛上涂抹眼用润滑剂，并用胶带横向固定其头部以保护眼睛，防止手术过程中受损。
3. 手术剩余步骤中，将动物置于加热垫上以维持体温。
4. 使用四根 0.25 mm 无菌昆虫针（Anticorro：Fine Science Tool，Foster City，CA），将其固定在 Dremel 工具上，钻穿左侧胫骨近端和远端干骺端，实现骨骼穿刺固定。
5. 针的方向应垂直于胫骨长轴，且彼此之间呈 90° 角；近端与远端固定针之间的距离至少为 10 mm。
6. 将第一个环置于近端针上方，螺母朝内面向针；将针固定于环上，确保胫骨位于铝环中央位置。
7. 将第二个环置于远端针下方，使用六角螺母如前所述将针固定于环上；再将第四个螺母-螺栓组合安装至远端固定器上。
8. 使用合适的装置通过三点弯曲法制造横断骨折。我们采用 Bonnarens 和 Einhorn 的重力系统⁴：将胫骨后外侧表面置于支撑块上，将重物沿下落臂提升至预定高度后释放，使其撞击胫骨前外侧，从而产生钝性骨折。重物下落高度需根据不同的小鼠品系预先确定，以确保仅发生单一的胫骨骨折。
9. 通过 X 射线确认骨折是否成功形成。
10. 确认骨折后，将三根不锈钢 #0/56 带螺纹杆连接至固定环上。从远端开始插入螺杆，并在远端环上拧紧螺母以固定螺杆；然后在螺杆上安装另一个螺母，近端环将位于此螺母之上。确保两个环保持等距且不会对固定针造成张力；使用第三个螺母将近端环固定在螺杆上。
11. 术后立即皮下注射布托啡诺（1.0 mg/kg）以镇痛，术后密切观察动物疼痛情况，并根据需要追加布托啡诺。
12. 通过注射阿替美唑逆转麻醉，持续监测动物直至其恢复意识并能自主活动。

3. 牵张成骨术（另见：^12,13）

将此操作流程修改以适用于牵张成骨术非常简单。环形支架由带螺纹的杆固定在适当位置，通过旋转固定杆的螺母，即可使环形支架相互分离。

1. 潜伏期：采用此模型进行标准牵张成骨时，将固定器安装于胫骨后，需静置5天的潜伏期。
2. 牵张期：牵张成骨可通过每日旋转稳定杆上的螺母¼圈（0.25 mm），持续7天完成。
3. 成熟期：牵张结束后约10天可观察到骨性连接，27天时可观察到完全骨性愈合。

4. 创建临界尺寸缺损

为了制造临界尺寸缺损，按照此前所述方法应用外固定器，并作如下修改。

1. 开始操作前，使用70%乙醇清洁皮肤。
2. 在制造骨缺损前，应完全安装固定器。
3. 将小鼠置于解剖显微镜下以观察胫骨内侧，并使用手术刀上的#10刀片做一5–7 mm的切口。
4. 轻柔地横断并分离肌肉，以暴露胫骨中段骨干。
5. 然后使用剪刀切除一段3 mm长的骨组织。通过剪刀尖端缓慢剪除骨组织，必要时用镊子移除骨碎片。操作时应小心剪刀尖端，避免施加过大的机械力导致胫骨移位。
6. 检查手术部位，确保无残留骨碎片，因为这些碎片可能促进骨愈合。
7. 将肌肉复位至胫骨钝端周围。
8. 使用2–3针6-0聚酰胺单丝缝线关闭皮肤切口。
9. 逆转麻醉，监测动物疼痛情况，并按前述方法给予镇痛药物。

5. 代表性结果

当正确应用时，外固定器可为闭合性胫骨骨折提供更坚固的稳定性，并实现良好的复位效果（图 1, 2）。然而，在某些情况下复位不充分（骨端之间存在明显且较大的间隙，或发生多处骨折）（图 3），这些小鼠将被排除在分析之外。采用此方法稳定的骨折主要通过膜内成骨方式愈合（图 4）。相比之下，如果骨折未得到稳定，骨折间隙内会形成较大的软骨痂（图 5），随后通过膜内成骨过程被骨组织替代。

图1. X线片显示用于稳定胫骨骨折的外固定装置。骨折后拍摄的X线片显示骨断端对位良好（箭头所示）。

图2. 应用固定器后的小鼠图像。

图3. 骨折后拍摄的X线片显示骨段移位且呈碎片状（箭头所示）。

图4. 稳定的骨折通过膜内成骨方式愈合。对稳定骨折进行三色染色显示骨折部位存在部分新生骨组织（b）。比例尺 = 500 μm。

图5. 未固定骨折通过软骨内成骨方式愈合。非稳定骨折的三色染色显示骨折部位存在软骨（c）和骨组织（b）。比例尺 = 500 μm。

讨论

骨骼的愈合方式根据力学稳定性不同而分为两种模式（综述见：¹⁴）。当骨折部位不稳定时，骨折间隙内会形成较大的软骨模板，随后被骨组织替代，从而连接断裂的骨端。在骨折近端和远端，骨组织通过骨膜和骨内膜内的膜内成骨方式直接形成。相反，在稳定的骨折中，愈合过程完全通过膜内成骨实现³。然而，调控这两种过程之间转换的具体机制尚不清楚。有证据表明，干细胞在力学环境刺激下的命运受到遗传调控，并可被改变。在缺乏Mmp9的小鼠中，稳定骨折部位会形成软骨，提示Mmp9参与了骨折修复过程中干细胞命运的决定⁵。此外，如果在骨折修复过程中激活骨形态发生蛋白（Bone morphogenetic protein, BMP）信号通路，也可诱导稳定骨折部位形成软骨^8,9。为了得出这些结论，在愈合早期提供刚性固定至关重要，因为干细胞命运的决定发生在损伤后的最初几天内¹¹。

正确应用我们的外固定方法可用于稳定骨骼，以评估骨折愈合过程中的膜内成骨。我们的方法可制造出伴随其他肢体损伤的骨折，类似于...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25 mm 昆虫针	Fine Science Tools	26000-25	黑色阳极氧化钢，0.25 mm 杆径，4 cm 长度
不锈钢六角螺母	Small Parts, Inc.	#2-56	1/8" 长度，每英寸 56 牙螺纹
不锈钢六角螺母	Small Parts, Inc.	#0-80	1/8" 长度，每英寸 80 牙螺纹
不锈钢机械螺钉	Small Parts, Inc.	#0-80	1/8" 长度，每英寸 80 牙螺纹
不锈钢机械切削螺纹杆	Small Parts, Inc.	#0-80	6" 长度，每英寸 80 牙螺纹
18-8 不锈钢头部机械螺钉	McMaster-Carr		2-56 螺纹，3/6" 长度
外固定装置	机加工车间	定制设计