本文介绍了一种基于改良Ilizarov外固定器应用的长骨骨折稳定方法1-3。在安装固定器并制造骨损伤后，可对骨愈合过程进行评估，实施牵张成骨，或制造骨不连或临界尺寸缺损，用于研究治疗干预措施。
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本文内容
摘要
摘要
评估骨骼修复模式对于开发用于临床治疗骨折的疗法至关重要。机械稳定性在骨损伤愈合过程中起着重要作用。在最不利的情况下，机械不稳定可能导致人体骨折愈合延迟或不愈合。然而，一定程度的活动也能刺激愈合过程。在存在活动的骨折中，软骨会形成以稳定骨折端，并通过重现软骨内成骨的发育过程，逐渐被骨组织替代。相反，如果骨折骨被刚性固定，则骨组织通过膜内成骨方式直接形成。临床上，软骨内成骨与膜内成骨通常同时发生。为了有效模拟这一过程，研究者按照 Bonnarens4 描述的方法，将一根针插入骨折骨的髓腔中。该实验方法可提供良好的侧向稳定性，同时允许保留一定程度的旋转不稳定性。然而，通过实验手段分别隔离这两种过程，也有助于加深我们对调控这两种不同愈合机制的理解。我们已开发出一种可同时提供旋转和侧向稳定性的固定方案。在此模型中，仅观察到膜内成骨这一种愈合方式，因此可在不同遗传修饰小鼠品系之间5-7、应用生物活性分子后8,9、改变愈合的生理参数后10、调整固定程度或固定时间后11、牵张成骨后12、建立骨不连模型后13，或创建临界尺寸骨缺损后，对愈合参数进行比较。本文中，我们展示了如何在小鼠中应用改良的 Ilizarov 外固定器研究胫骨骨折愈合及牵张成骨过程。
方案
所有实验程序均经加州大学旧金山分校（UCSF）机构动物照护与使用委员会批准，并符合国家指南。
1. 手术前固定剂的准备
- 在创建稳定骨折模型之前，需要组装定制的外固定装置。定制的外固定架由两个铝环组成，通过三根不锈钢#0/56螺纹杆、8个#2/56六角螺母和17个匹配的螺栓（Small Part Inc.，Miami Lakes, FL3）固定。
- 每个骨折模型需要两个铝环。将4个#2/56六角螺母（Small Part Inc.，Miami Lakes, FL）和匹配的螺栓安装到其中一个环的适当孔中，保持松动状态，此为近端环。将3个螺母和螺栓安装到远端环上，同样不要完全拧紧。
2. 麻醉、骨折造模与固定器应用
- 根据实验需求选择小鼠（年龄、性别和体重由使用者确定），通过腹腔注射 50 mg/ml 氯胺酮和 0.5 mg/ml 美托咪啶（每只小鼠 0.03 ml）进行麻醉。
- 在小鼠眼睛上涂抹眼用润滑剂，并用胶带覆盖其头部以在操作过程中保护眼睛。
- 在整个操作过程中将动物置于加热垫上。
- 使用四根 0.25 mm 无菌昆虫针（Anticorro：Fine Science Tool，Foster City，CA），将针固定在 Dremel 工具上，钻穿左侧胫骨近端和远端干骺端，实现穿刺固定。
- 针的方向应垂直于胫骨长轴，且彼此之间呈 90° 角；近端与远端针之间至少相距 10 mm。
- 将第一个环置于近端针上方，螺母朝内朝向针；将针固定于环上，确保胫骨位于铝环中央位置。
- 将第二个环置于远端针下方，使用六角螺母如前所述将针固定于环上；在远端固定器上添加第四个螺母-螺栓组合。
- 使用适当的装置通过三点弯曲法制造横断骨折。我们采用 Bonnarens 和 Einhorn 的重力系统4。将胫骨后外侧表面置于支撑块上，将重物沿下落臂提升至预定高度后释放，使其撞击胫骨前外侧，从而产生钝性骨折。重物下落的高度需根据小鼠品系预先确定，以确保仅发生单一的胫骨骨折。
- 通过 X 射线确认骨折形成。
- 确认骨折后，将三根不锈钢 #0/56 带螺纹杆连接至环上。从远端开始插入螺杆，并在远端环上拧紧螺母以固定螺杆；然后在螺杆上再套入一个螺母，近端环将位于此螺母之上。确保两个环保持等距，且不会对针产生应力。使用第三个螺母将近端环固定在螺杆上。
- 术后立即皮下注射布托啡诺（1.0 mg/kg）以镇痛，术后密切观察动物疼痛情况，并根据需要给予布托啡诺。
- 通过注射阿替美唑逆转麻醉，持续监测动物直至其恢复反应能力并能自主行走。
3. 牵张成骨术（另见：12,13）
对该手术步骤进行修改以适应牵张成骨术非常简单。环形外固定架由带螺纹的金属杆固定，通过旋转固定金属杆的螺母即可将环形架分开移动。
- 潜伏期：采用此模型进行标准牵张成骨时，将固定器安装于胫骨后静置5天，作为潜伏期。
- 牵张期：牵张成骨可通过每日旋转稳定杆上的螺母1/4圈（0.25 mm），持续7天完成。
- 成熟期：牵张结束后约10天可观察到骨性连接，27天时可观察到完全骨性愈合。
4. 创建临界尺寸缺损
为了制造临界尺寸缺损，按照此前所述方法应用外固定器，并作如下修改。
- 在开始操作前，使用70%乙醇清洁皮肤。
- 在制造骨缺损前，应先完全安装固定器。
- 将小鼠置于体视显微镜下以观察胫骨内侧，并使用手术刀上的#10刀片做一长度为5–7 mm的切口。
- 轻柔地横断并分离肌肉组织，以暴露胫骨中段骨干。
- 随后使用剪刀切除一段3 mm长的骨组织。通过剪刀尖端缓慢剪除骨组织，必要时用镊子移除骨碎片。操作时应小心剪刀尖端，避免施加过大的机械力导致胫骨移位。
- 检查手术部位，确保无残留骨碎片，因为这些碎片可能促进骨愈合。
- 将肌肉复位，覆盖胫骨的钝端。
- 使用2–3针6-0聚酰胺单丝缝线缝合皮肤切口。
- 逆转麻醉，并对动物进行疼痛监测，按先前所述给予镇痛药物。
5. 代表性结果
当正确应用时，外固定架可为闭合性胫骨骨折提供更坚固的稳定性，并实现良好的复位（图 1，2）。然而，在某些情况下会出现复位不充分（骨端之间存在明显且较大的间隙）或发生多发性骨折（图 3），这些小鼠将被排除在分析之外。采用此方法稳定的骨折主要通过膜内成骨方式愈合（图 4）。相比之下，如果骨折未得到稳定，骨折间隙内会形成较大的软骨痂（图 5），随后通过膜内成骨过程被骨组织替代。
图 1. X线影像显示用于稳定胫骨骨折的外固定装置。骨折后拍摄的X线片显示骨段对位良好（箭头所示）。
图 2. 应用固定器后小鼠的图像。
图3. 骨折后拍摄的X线片显示骨段错位且呈碎片状（箭头所示）。
图 4. 稳定性骨折通过膜内成骨方式愈合。对稳定性骨折进行三色染色，显示骨折部位存在部分新生骨组织（b）。比例尺 = 500 μm。
图 5. 未固定的骨折通过软骨内成骨方式愈合。非固定骨折的三色染色显示骨折部位存在软骨（c）和骨组织（b）。比例尺 = 500 μm。
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讨论
骨骼的愈合方式根据力学稳定性不同而分为两种模式（综述见：14）。当骨折部位不稳定时，骨折间隙内会形成较大的软骨模板，随后被骨组织替代，从而连接断裂的骨端。在骨折近端和远端，骨组织通过骨膜和骨内膜内的膜内成骨方式直接形成。相反，在稳定的骨折中，愈合过程完全通过膜内成骨实现3。然而，调控这两种过程之间转换的具体机制尚不清楚。有证据表明，干细胞在力学环境刺激下的命运受到遗传调控，并可被改变。在缺乏Mmp9的小鼠中，稳定骨折部位会形成软骨，提示Mmp9参与了骨折修复过程中干细胞命运的决定5。此外，如果在骨折修复过程中激活骨形态发生蛋白（Bone morphogenetic protein, BMP）信号通路，也可诱导稳定骨折部位形成软骨8,9。为了得出这些结论，在愈合早期提供刚性固定至关重要，因为干细胞命运的决定发生在损伤后的最初几天内11。
正确应用我们的外固定方法可用于稳定骨骼，以评估骨折愈合过程中的膜内成骨。我们的方法可制造出伴随其他肢体损伤的骨折，类似于...
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披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
本工作由NIAMS的R01-AR053645基金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.25 mm 昆虫针 | Fine Science Tools | 26000-25 | 黑色阳极氧化钢，0.25 mm 杆径，4 cm 长度 |
| 不锈钢六角螺母 | Small Parts, Inc. | #2-56 | 1/8" 长度，每英寸 56 牙螺纹 |
| 不锈钢六角螺母 | Small Parts, Inc. | #0-80 | 1/8" 长度，每英寸 80 牙螺纹 |
| 不锈钢机械螺钉 | Small Parts, Inc. | #0-80 | 1/8" 长度，每英寸 80 牙螺纹 |
| 不锈钢机械切削螺纹杆 | Small Parts, Inc. | #0-80 | 6" 长度，每英寸 80 牙螺纹 |
| 18-8 不锈钢头部机械螺钉 | McMaster-Carr | 2-56 螺纹，3/6" 长度 | |
| 外固定装置 | 机加工车间 | 定制设计 |
参考文献
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重印与许可
