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磁共振成像引导下利用经颅聚焦超声在大鼠模型中破坏血脑屏障

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DOI：

10.3791/3555

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2012年3月13日

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1Imaging Research, Sunnybrook Research Institute, 2Department of Medical Biophysics, University of Toronto, 3Department of Medical Biophysics, and Institute of Biomaterials & Biomedical Engineering (IBBME), University of Toronto

本文内容

摘要

微泡介导的聚焦超声破坏血脑屏障（BBB）是一种有前景的脑部靶向药物递送无创技术1-3。本方案概述了在大鼠模型中进行磁共振成像引导下经颅BBB破坏的实验操作流程。

摘要

聚焦超声（FUS）破坏血脑屏障（BBB）是一种日益受到关注的克服血脑屏障的技术1-5。血脑屏障是脑部疾病药物治疗的重要障碍，因为它仅允许分子量小于约500 Da的分子从血管系统进入脑组织6。FUS诱导的血脑屏障破坏（BBBD）具有暂时性和可逆性4，相较于化学方法诱导BBBD，其优势在于高度局部化。FUS诱导的BBBD为研究多种治疗剂对脑组织的影响提供了手段，这些治疗剂在常规情况下无法以足够浓度递送至脑组织。尽管已有多种超声参数被证实可有效破坏血脑屏障2,5,7，但实验过程中仍存在若干关键步骤，以确保破坏效果的成功实现并实现精确定位。本方案概述了如何在大鼠模型中实现磁共振成像（MRI）引导下的FUS诱导BBBD，重点介绍实验中关键的动物准备和微泡处理步骤。

方案

1. 超声与MRI设置

本研究使用了一套与 MRI 兼容的三轴聚焦超声系统（FUS Instruments, Inc., Toronto, Ontario, Canada）。使用了两种不同的超声换能器：一种是自制的 551.5 kHz 球面聚焦换能器（曲率半径 = 60 mm，外径 = 75 mm，内径 = 20 mm）；另一种是 1.503 MHz 的 8 扇区阵列换能器，带有集成 PZT 水听器（Imasonic Inc., Voray-sur-L'Orgnon, France），该阵列作为单个元件的球面聚焦换能器驱动使用（FN = 0.8，孔径 = 10 cm）。当使用 551.5 kHz 换能器时，采用了一种与 MRI 兼容的 PVDF 接收器8来记录声学发射信号。若使用不同的设备，建议如下：

  1. 选择一个合适且经过校准的超声换能器，其中心频率范围为 0.25 MHz -1.5 MHz，f 值（曲率半径/孔径）小于或等于 1。
  2. 在 1.5 T 或 3 T 磁共振成像（MRI）设备的扫描床上放置一个装有温热、脱气、去离子水的水浴。水浴应配备一个可承载动物的顶板。将超声换能器安装在一个与 MRI 兼容的三轴定位平台或系统9上，并置于水箱内，使其朝向水面。
  3. 将换能器电缆通过穿透面板连接至超声驱动设备。
  4. 使用函数发生器和功率放大器生成换能器驱动信号。采用外部匹配电路以最小化反射的电功率。
  5. 根据已知的换能器焦距，将换能器焦点置于水面处，并对水面进行超声辐照，以产生可见的水柱。步骤 1.6 和 1.7 描述了如何利用产生的水柱来标定焦点位置。一种更精确的定位方法涉及对吸热凝胶进行超声辐照，并利用 MRI 成像检测焦点处的温度升高，详见9。
  6. 使用在 MR 图像上可见的标记物标定焦点位置。可通过一个带有中心孔的板实现，当该板放置在焦点上方时，中心孔会充满水。该充水孔在 MRI 上可见，可在两个平面上提供焦点坐标，而沿换能器轴向的坐标则可通过水面确定。
  7. 使用三平面定位序列对焦点标记物成像，并记录焦点在 MRI 坐标系中的位置。
  8. 为监测声学发射，可在水浴中安装一个与 MRI 兼容的水听器8，用作被动空化检测器（PCD），并将其指向换能器焦点；或使用集成水听器的换能器。
  9. 将 PCD 电缆连接至足够高速的示波卡，以捕获持续时间最长为 10 ms、脉冲重复频率（PRF）最高达 2 Hz 的信号爆发（例如 ATS460, AlazarTech, Pointe-Claire, Quebec, Canada）。电缆必须接地至穿透面板或射频屏蔽层，以最小化噪声。

2. 动物准备

  1. 使用异氟烷气体麻醉动物。由于异氟烷会影响血脑屏障的通透性10，因此应在实验开始前10分钟停止供气。在麻醉开始时，向每只动物的眼睛涂抹眼用润滑软膏，以防止角膜干燥或其他损伤。
  2. 使用电动剃刀剃除动物头部和颈部的毛发，然后使用脱毛膏（例如 Nair，Church & Dwight Co.，普林斯顿，新泽西州，美国）去除残留毛发，并用温和的肥皂和水冲洗头皮。
  3. 用聚维酮碘皮肤清洁剂处理尾部，随后用碘伏冲洗。最后用酒精擦拭，以便清晰观察尾静脉。
  4. 将一根22号带三通阀的导管插入尾静脉，并用肝素/生理盐水混合液（33 U/mL）冲洗，以防止导管内形成血栓。
  5. 通过肌肉注射给予可注射麻醉剂（40–50 mg/kg 氯胺酮，10 mg/kg 赛拉嗪），并撤除异氟烷麻醉。
  6. 将麻醉后的动物仰卧置于超声定位系统上，使其头部顶部通过顶板上的孔接触水浴（图1）。可在动物头部顶部涂抹少量超声耦合凝胶，以尽量减少气泡滞留的可能性。
  7. 用胶带将动物的四肢固定在定位系统上。头部可用咬合杆固定（如有），或用胶带牢固地固定在下颌处。
  8. 用毛巾和循环水毯覆盖动物，以保持其体温。

3. 靶点选择


  1. 获取脑部基线轴向 T2-加权和 T1-加权磁共振图像。若使用 1.5 T 磁共振成像仪和专用头部尺寸射频接收表面线圈，合适的扫描参数可能为：

    T2 加权：FSE，TE = 60 ms，TR = 2000 ms
    T1 加权：FSE，TE = 10 ms，TR = 500 ms
  2. 从 T2-加权扫描图像中选择靶点，避开脑室和脑中线，并选择中脑深度位置。
  3. 将换能器焦点移至靶点位置。

4. 微泡制备

多个研究团队使用Definity微泡（Lantheus Medical Imaging，马萨诸塞州，美国）进行微泡介导的聚焦超声诱导血脑屏障开放2,5,7。其他类型微泡的合适剂量可在文献中找到11,12。

  1. 激活 Definity 微泡，使用 18 号针头缓慢吸取少量至 1 mL 注射器中。
  2. 通过轻柔地前后推动活塞排出注射器内的滞留空气。切勿敲击注射器，以免破坏微泡。
  3. 将 Definity 与生理盐水按 10:1 的比例（生理盐水:Definity）稀释，方法是将所需体积的 Definity 缓慢注入盛有生理盐水的注射器中。若采用输注给药方式，可进一步稀释至 50:1 或 100:1。
  4. 轻柔翻转注射器，充分混匀 Definity 与生理盐水，直至溶液外观均匀一致。若微泡已开始从悬浮液中上浮，注射前可再次轻柔翻转注射器以重新混匀。
  5. 根据 Definity 剂量 0.02 mL/kg 或稀释后溶液（10:1 稀释度）剂量 0.2 mL/kg，计算所需给药体积。

5. 超声递送

  1. 设置超声参数，采用低占空比脉冲模式，而非连续波超声。在0.5 MHz条件下，合适的超声参数为0.23 MPa 原位 压力，1 Hz PRF 下每次 10 ms 的脉冲，总超声时间 2 min。在 1.5 MHz 时合适 原位 压力降至约 0.45–0.5 MPa。

可使用0.46的机械指数来估算不同频率下的适当压力13。

  1. 检查动物头部是否仍与水耦合。
  2. 将微泡缓慢注入尾静脉导管，并用 0.5 mL 生理盐水冲管。注射开始的同时启动超声辐照。

6. 治疗效果的 MRI 评估

  1. 超声处理后，通过尾静脉导管注射磁共振成像对比剂（例如 0.2 ml/kg Omniscan，GE Healthcare），随后用 0.5 mL 生理盐水冲洗。
  2. 进行 T1-加权成像，直至对比剂峰值通过。成功破坏的超声处理部位将比周围组织显示出更强的增强信号。
  3. 进行 T2-加权成像以检测水肿情况。超声处理部位出现高信号提示存在水肿。

7. 典型结果

利用聚焦超声和循环微泡，可成功将磁共振成像（MRI）对比剂递送通过血脑屏障（BBB）。图2显示了聚焦超声（FUS）治疗前后典型的T1-加权图像。图2B显示了一幅对比增强（CE）T1-加权图像，其中在四个超声辐照位置出现明显的局灶性开放区域。超声辐照位置1和2显示出尤为显著的增强信号。在图3中，位置1和2同样表现为T2-加权高信号，提示存在水肿。

T2-加权水肿的范围有时在矢状面切片上更容易观察。图4显示了穿过声刺激位置1和3的对比增强T1-加权和T2-加权矢状面切片。在位置1可见水肿，而在位置3不可见。

捕获的声发射数据的频谱分析（图5）在稳定空化发生时可能显示出谐波发射和/或次谐波/超谐波发射。谐波也可能由组织的非线性引起，而次谐波和超谐波发射仅可能由气泡活动产生14。在较高压力下，可能检测到表明惯性空化的宽带发射。然而，这些现象与比无惯性空化的声照射更多的红细胞外渗和微损伤相关11。

使用较高的超声频率会因更小的焦斑尺寸而产生更局部的开孔。图6显示，较高的频率可用于创建更小的开孔区域。这使得能够在减少颅骨附近效应的情况下，研究大脑中段区域的影响。

使用 MRI、小鼠、换能器、函数发生器和三轴定位器的超声聚焦示意图。
图 1. 实验装置。

大鼠脑部 MRI 扫描图像，T1 加权，聚焦超声治疗前和治疗后，显示对比度变化及图像强度图表。
图 2。 大鼠脑部治疗前（左）和治疗后（右）的 T1-加权图像，显示四个超声照射位置的信号增强。

大鼠脑部治疗前（左）和治疗后（右）T2加权MRI图像对比，显示声照位置1和2处的T2加权水肿，医学影像分析。
图3。 同一只大鼠（与图2相同）在治疗前（左）和治疗后（右）的T2-w脑部图像，显示在声照位置1和2处出现T2-w水肿。

FUS治疗后的MRI图像；CE-T1w和T2w序列显示组织反应，用于诊断评估。
图4。 同一只大鼠脑部在治疗后获得的矢状位T1-w（左）和T2-w（右）图像，该大鼠与图2和图3相同。位置1处的开窗（左）与T2-w上的水肿信号（右）相对应。位置3显示开窗（左），但无T2-w水肿。

信号频率谱图，显示以 MHz 为单位的 0.5f₀、f₀、1.5f₀ 和 2f₀ 处的峰值。
图 5。 在单次 10 ms 脉冲期间于 551.5 kHz 采集数据所得的频率谱。可观察到基频（f0）、谐波（2f0）以及次谐波/超谐波（0.5 f0、1.5f0）。

MRI图像，FUS后CE-T1w，1.503 MHz，脑部成像，显示定向血流，医学研究。
图6。 大鼠脑组织在1.503 MHz频率下于四个位置进行超声辐照后获得的CE-T1-w轴向（左）和矢状面（右）增强MRI图像。在此频率下，血脑屏障开放区域更为局限。

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讨论

动物和微泡的准备是该操作过程中最关键的两个方面。必须完全去除动物头部的毛发，以避免超声束的衰减。血脑屏障可以在异氟烷麻醉下被破坏，但此时实现稳定且一致的开放会更加困难。

操作微泡时应始终小心谨慎，抽取时必须使用细针头、大直径的针具，以避免微泡破裂。同样，应选用可合理用于尾静脉的最小规格导管（建议使用22号导管）。如果需要更小规格的导管以实现静脉内正确置管，则在注射微泡时需格外小心。微泡注射应始终缓慢进行。

应始终采用脉冲模式进行超声处理。如果使用连续波超声，微泡将无法在换能器焦点处的血管中得到补充，从而无法实现血脑屏障破坏（BBBD）。若治疗后CE-T1-w图像未显示血脑屏障开放迹象，可重复治疗，并确保水位充足，使动物头部浸入水中，且皮肤表面无气泡残留。

较高频率可为小型动物模型提供更优的定位效果，但需要更高的频率输出 原位 压力以诱导开放。还需注意的是，颅骨造成的能量损失在较高压力下更为显著，因此在估算时必须予以考虑。

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披露

K. Hynynen 和 R. Chopra 是 FUS Instruments, Inc. 的联合创始人。R. Chopra、A. Waspe 和 K. Hynynen 持有 FUS Instruments, Inc. 的股份。K. Hynynen 收到 FUS Instruments, Inc. 提供的研究资助。

致谢

作者感谢Shawna Rideout-Gros和Alexandra Garces在动物护理方面的帮助，以及Ping Wu提供的技术支持。本研究工作得到了美国国立卫生研究院（资助号：EB003268）和加拿大研究主席计划的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
小型动物聚焦超声系统FUS Instruments, Inc.RK-100
DefinityLantheus Medical Imaging
OmniscanGE Healthcare

参考文献

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