改良的酵母双杂交系统用于鉴定与生长因子前颗粒蛋白相互作用的蛋白质

摘要

我们对传统的酵母双杂交筛选方法进行了改进，该方法是一种用于鉴定蛋白质相互作用的有效遗传学工具。这种改进显著缩短了实验周期，减轻了工作量，更重要的是减少了假阳性结果的数量。此外，该方法具有良好的可重复性和可靠性。

摘要

颗粒蛋白前体（Progranulin，PGRN），也称为颗粒蛋白上皮素前体（granulin epithelin precursor，GEP），是一种由593个氨基酸组成的自分泌生长因子。已知PGRN在多种生理和疾病过程中发挥关键作用，包括早期胚胎发生、伤口愈合¹、炎症^{2, 3}以及宿主防御⁴。PGRN还具有神经营养因子功能⁵，PGRN基因的突变导致PGRN蛋白部分缺失，可引起额颞叶痴呆^{6, 7}。我们近期的研究已将PGRN鉴定为软骨发育与降解的重要调控因子^8-11。尽管PGRN在近二十年前即被发现，并在多种生理和病理状态下具有重要作用，但由于一直未能明确其结合受体，对PGRN功能的深入探索及其作用机制的研究受到显著限制。为解决这一问题，我们基于最常用的GAL4酵母双杂交系统，开发了一种改良的酵母双杂交（modified yeast two-hybrid，MY2H）方法。与传统的酵母双杂交筛选相比，MY2H显著缩短了筛选周期，并大幅减少了假阳性克隆的数量。此外，该方法具有良好的可重复性和可靠性，我们已成功利用该系统筛选出多种“诱饵”蛋白的结合蛋白，包括离子通道¹²、细胞外基质蛋白^{10, 13}以及生长因子¹⁴。本文以PGRN为例，详细描述了该MY2H实验流程，该方法最终成功鉴定出TNFR2为首个已知的PGRN相关受体^{14, 15}。

方案

1. 背景信息

酵母双杂交系统是一种强大的遗传学技术，用于发现蛋白质-蛋白质相互作用^{16, 17}。目前已有多类双杂交系统实现商业化，例如基于lexA的系统、Sos招募系统以及基于细菌或哺乳动物细胞的双杂交系统；本文则重点介绍最常用的基于GAL4的酵母双杂交系统的改进方法。该方法的基本原理在于酵母GAL4蛋白具有可分离的DNA结合域和转录激活域。诱饵蛋白与GAL4 DNA结合域（DNA-BD）融合表达，而猎物蛋白则与GAL4激活域（AD）融合表达。当诱饵与猎物融合蛋白发生相互作用时，可激活含有GAL4结合位点的报告基因转录，这些报告基因已整合于酵母基因组中。酵母双杂交（Y2H）的原理如图1所示，其实验流程总结于图2。

2. 所需材料与溶液

1. YPD培养基（一种由蛋白胨、酵母提取物和葡萄糖按适宜比例混合而成的培养基，适用于培养大多数酵母菌） 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 菌株）。
2. 最小合成定义培养基基础（Minimal synthetic defined (SD) 培养基基础包含酵母氮源基础、硫酸铵和碳源右旋糖。可向最小合成定义培养基基础中添加缺失营养成分补充剂（DO 补充剂），以制备缺乏特定营养成分的合成定义培养基）。
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讨论

酵母双杂交筛选已被证实是鉴定蛋白质相互作用的有效工具^{16, 17}。与其他鉴定蛋白质结合伴侣的方法（如生化共纯化和蛋白质芯片）相比，酵母双杂交系统是一种灵敏的遗传学方法，可在相对简单的实验中筛选大量编码序列；此外，该方法可检测体内相互作用，且无需复杂的蛋白质纯化步骤。当然，酵母双杂交系统也存在局限性，例如缺乏必要的翻译后修饰、融合蛋白折叠不充分和/或稳定性不足，以及亚细胞定位的改变（蛋白质被带入细胞核，而这可能并非其真实的生理状态）。此外，某些能非特异性激活报告基因（如自激活蛋白）的蛋白质不能直接用作筛选猎物cDNA文库的诱饵。为了克服这一缺陷，通常使用单个功能结构域而非完整蛋白质作为诱饵，随后再通过多种方法利用完整蛋白质验证所发现的相互作用。例如，我们曾成功利用COMP的EGF样结构域作为诱饵，筛选出ADAMTS-7金属蛋白酶和前颗粒蛋白生长因子作为COMP的结合伴侣^{10, 13}。

传统的筛选过程耗时较长，因为需要先将酵母转化子涂布于第一块三缺培养基（SD-Leu-Trp-His +3AT）上以筛选His+克隆，再将这些克隆转移到第二块三.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ProQuest 双杂交系统	Invitrogen	10835
YPD 生长培养基	Clontech Laboratories	630409
YPD 琼脂培养基	Clontech Laboratories	630410
最小SD琼脂基础培养基	Clontech Laboratories	630412
-Leu DO补充剂	Clontech Laboratories	630414
-Leu/-Trp DO补充剂	Clontech Laboratories	630417
-His/-Leu/-Trp/-Ura DO补充剂	Clontech Laboratories	630425
3-氨基-1,2,4-三唑（3AT）	Sigma-Aldrich	A8056
LB培养基（Luria broth）	Sigma-Aldrich	L3022
X-Gal	Invitrogen	15520-034
超声处理的鲑精DNA	Stratagene, Agilent Technologies	201190
氨苄青霉素	AMRESCO	0339
硫酸卡那霉素	Invitrogen	11815-024
Subcloning Efficiency™ DH5α™ 感受态细胞	Invitrogen	18265-017
Trizma® 碱基	Sigma-Aldrich	T6066
乙酸锂	Sigma-Aldrich	L4158
乙二胺四乙酸	Sigma-Aldrich	ED
硝酸纤维素膜	Bio-Rad	162-0115
10 cm培养皿	ITI Scientific	CT-903
培养箱（30 °C）	ATR (Ecotron)