改良的酵母双杂交系统用于鉴定与生长因子前颗粒蛋白相互作用的蛋白质

摘要

我们对传统的酵母双杂交筛选方法进行了改进，该方法是一种用于鉴定蛋白质相互作用的有效遗传学工具。这种改进显著缩短了实验周期，减轻了工作量，更重要的是减少了假阳性结果的数量。此外，该方法具有良好的可重复性和可靠性。

摘要

颗粒蛋白前体（Progranulin，PGRN），也称为颗粒蛋白上皮素前体（granulin epithelin precursor，GEP），是一种由593个氨基酸组成的自分泌生长因子。已知PGRN在多种生理和疾病过程中发挥关键作用，包括早期胚胎发生、伤口愈合¹、炎症^{2, 3}以及宿主防御⁴。PGRN还具有神经营养因子功能⁵，PGRN基因的突变导致PGRN蛋白部分缺失，可引起额颞叶痴呆^{6, 7}。我们近期的研究已将PGRN鉴定为软骨发育与降解的重要调控因子^8-11。尽管PGRN在近二十年前即被发现，并在多种生理和病理状态下具有重要作用，但由于一直未能明确其结合受体，对PGRN功能的深入探索及其作用机制的研究受到显著限制。为解决这一问题，我们基于最常用的GAL4酵母双杂交系统，开发了一种改良的酵母双杂交（modified yeast two-hybrid，MY2H）方法。与传统的酵母双杂交筛选相比，MY2H显著缩短了筛选周期，并大幅减少了假阳性克隆的数量。此外，该方法具有良好的可重复性和可靠性，我们已成功利用该系统筛选出多种“诱饵”蛋白的结合蛋白，包括离子通道¹²、细胞外基质蛋白^{10, 13}以及生长因子¹⁴。本文以PGRN为例，详细描述了该MY2H实验流程，该方法最终成功鉴定出TNFR2为首个已知的PGRN相关受体^{14, 15}。

方案

1. 背景信息

酵母双杂交系统是一种强大的遗传学技术，用于发现蛋白质-蛋白质相互作用^{16, 17}。目前已有多类双杂交系统实现商业化，例如基于lexA的系统、Sos招募系统以及基于细菌或哺乳动物细胞的双杂交系统；本文则重点介绍最常用的基于GAL4的酵母双杂交系统的改进方法。该方法的基本原理在于酵母GAL4蛋白具有可分离的DNA结合域和转录激活域。诱饵蛋白与GAL4 DNA结合域（DNA-BD）融合表达，而猎物蛋白则与GAL4激活域（AD）融合表达。当诱饵与猎物融合蛋白发生相互作用时，可激活含有GAL4结合位点的报告基因转录，这些报告基因已整合于酵母基因组中。酵母双杂交（Y2H）的原理如图1所示，其实验流程总结于图2。

2. 所需材料与溶液

1. YPD培养基（一种由蛋白胨、酵母提取物和葡萄糖按适宜比例混合而成的培养基，适用于培养大多数酵母菌） 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 菌株）。
2. 最小合成定义培养基基础（Minimal synthetic defined (SD) 培养基基础包含酵母氮源基础、硫酸铵和碳源右旋糖。可向最小合成定义培养基基础中添加缺失营养成分补充剂（DO 补充剂），以制备缺乏特定营养成分的合成定义培养基）。
3. 亮氨酸/色氨酸缺陷型（DO）补充剂（包含除亮氨酸和色氨酸外的所有必需氨基酸）
4. -组氨酸/-亮氨酸/-色氨酸/-尿嘧啶 缺失（DO）补充剂（含有除亮氨酸、色氨酸、组氨酸和尿嘧啶外的所有必需氨基酸）
5. LB培养基（胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L，NaCl 5 g/L）
6. X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃苷）溶液：用N,N-二甲基甲酰胺配制成20 mg/ml的储存液
7. 10X TE（100 mM Tris-HCl (pH 7.5)，10 mM EDTA，经高压灭菌）
8. 超声处理的鲱鱼或鲑鱼精子DNA，煮沸（10 mg/ml）
9. 10X LiAc（1 M 醋酸锂，经高压灭菌）
10. 50% PEG-3350 溶液，滤膜除菌
11. 3-氨基-1,2,4-三唑（3AT）
12. 卡那霉素
13. 氨苄青霉素
14. ELECTROMAX DH5α 细胞
15. Z缓冲液：将16.1 g Na2HPO4·7H2O（或8.52 g无水物）、5.5 g NaH2PO4·H2O（或4.8 g无水物）、0.75 g KCl、0.246 g MgSO4·7H2O（或0.12 g无水物）溶于1 L经高压灭菌的蒸馏水中，调节pH至7.0。

3. 钓饵质粒构建（pDBLeu-PGRN）

将编码缺乏信号肽（氨基酸21-588）的PGRN的cDNA片段定向克隆至pDBLeu载体（ProQuest双杂交系统，Invitrogen）的Sal I-Not I位点，保持与GAL4 DNA结合域相同的翻译阅读框，以构建pDBLeu-PGRN。

1. 使用设计好的寡核苷酸引物，通过 PCR 扩增上述 PGRN 的 cDNA 片段，引物中包含限制性酶切位点（5′端为 Sal I，3′端为 Not I），以实现同框融合。
2. 对 PCR 产物进行琼脂糖凝胶纯化，随后用限制性内切酶 Sal I 和 Not I 进行酶切消化。
   同时，使用相同的限制性内切酶对 DB 载体 pDBLeu 进行双酶切，以制备线性化载体。
3. 将经限制性酶切的 PGRN 片段连接至线性化的 pDBLeu 载体中，并转化至 DH5α 感受态细胞，于含有卡那霉素（25 μg/ml）的 LB 培养基中进行筛选。
4. 通过 DNA 测序验证构建质粒的正确性。

4. 诱饵质粒的小规模转化

1. 取一株Mav203（Invitrogen）菌落接种于5 ml YPD培养基中，30°C振荡培养过夜。
2. 将过夜培养物按1:10比例稀释至50 ml YPD培养基中，继续培养2-4小时。
3. 室温下3000 rpm离心5分钟收集菌体，用40 ml灭菌蒸馏水重悬菌体沉淀。
4. 再次离心收集菌体，用2 ml溶液I重悬，室温孵育10分钟。
   溶液I：0.5 ml 10xLiAc，0.5 ml 10xTE，4 ml H₂O
5. 向各离心管中加入DNA：2-3 μl pDBLeu-PGRN（0.25 μg/μl）和10 μl变性剪切的鲑鱼精DNA（10 μg/μl）。加入100 μl酵母细胞，充分混匀。
6. 加入700 μl溶液II，充分混匀，30°C孵育30分钟。溶液II：0.2 ml 10xLiAc，0.2 ml 10xTE，1.6 ml 50% PEG3350。
7. 42°C热激15分钟。
8. 2分钟离心，弃上清，用200 μl灭菌蒸馏水重悬菌体沉淀。
9. 将菌液进行系列稀释后涂布于SD-Leu平板，30°C培养2-3天。

5. 钓饵验证

在进行酵母双杂交筛选之前，需检测 pDBLeu-PGRN 是否存在自激活现象，并确定 HIS3 报告基因的基础表达水平。该检测可判断诱饵蛋白是否能够激活转录，以及自激活是否可通过抑制剂消除。3-氨基-1,2,4-三唑（3-AT）是 HIS3 基因产物的竞争性抑制剂，可用于滴定在组氨酸缺陷培养基上生长所需的最低 HIS3 表达水平。

1. 将 pDBLeu-PGRN 转化至酵母 Mav203 菌株中，将转化产物涂布于 SD-Leu 平板上，并在 30°C 下培养 48–72 小时。
2. 使用灭菌牙签从每次转化的菌落中取样，点种到含有不同浓度（10 mM、25 mM、50 mM、75 mM 和 100 mM）3-AT 的 SD-Leu-His 平板上。3-AT 是 HIS3 酶的竞争性抑制剂，只有表现出自激活效应的诱饵才能在 3-AT 存在下生长。
3. 在含 100 mM 3-AT 的平板上仍能生长的诱饵菌株不适合用于双杂交筛选。对于可用的诱饵菌株，应选用能够抑制细胞生长的最低 3-AT 浓度。在多数情况下，筛选时使用 25 mM 的 3-AT。

6. cDNA 文库筛选

将pDBLeu-PGRN质粒通过小规模转化方法导入MaV203中，具体操作如上所述。为将pPC86文库（Invitrogen）导入MaV203（pDBLeu-PGRN）中，以下所述步骤通常在使用0.5 μg质粒文库DNA时可获得约4 × 10⁴个菌落。因此，获得2.5 × 10⁶个酵母转化子需要约30.0 μg的pPC86-cDNA文库质粒DNA、25次转化反应以及50块10 cm培养板（SD-Leu-Trp-His-Ura+3AT）。

1. 准备适当数量的 10-cm SD-Leu-Trp-His-Ura+3AT 平板（以下操作需准备 50 个）。同时准备至少四个 10-cm SD-Leu 平板，用于估算转化子数量。
2. 按照下述步骤，将文库转化至含有 pDBLeu-PGRN 的 MaV203 菌株中。
   1. 取 MaV203 (pDBLeu-PGRN) 的数个单菌落，悬浮于约 100 μl 经高压灭菌的去离子水中，均匀涂布于一个 10-cm SD-Leu 平板上。对第二个 SD-Leu 平板重复相同操作。将两个平板于 30°C 培养 18–24 小时。
   2. 用刮菌铲收集菌体，并将其完全重悬于 10 ml 高压灭菌的去离子水中。取适量菌液加入锥形瓶中的 500 ml 液体 YPD 培养基，使 OD₆₀₀ 约为 0.1。
   3. 接种后确认 OD 值约为 0.1。
   4. 于 30°C 摇床培养，直至 OD₆₀₀ 达到约 0.4。
   5. 新鲜配制以下溶液：
      1. 通过混合 11 ml 10X TE、11 ml 10X LiAc 和 88 ml 高压灭菌水，配制 110 ml 1X TE/LiAc 溶液。
      2. 通过混合 1.6 ml 10X TE、1.6 ml 10X LiAc 和 12.8 ml 50% PEG-3350，配制 16 ml PEG/LiAc 溶液。
   6. 于室温下以 3000 g 离心 5 分钟，收集菌体。
   7. 弃去上清液，用移液器反复吹打，将沉淀轻轻重悬于 100 ml 室温高压灭菌的去离子水中。
   8. 于室温下以 3000 g 离心 5 分钟。
   9. 弃去上清液，将菌体沉淀重悬于 50 ml 1X TE/LiAc 溶液中。
   10. 于室温下以 3000 g 离心 5 分钟。
   11. 弃去上清液，将沉淀最终重悬于 2.5 ml 1X TE/LiAc 溶液中。
   12. 进行 25 次转化反应。将 2.5 ml 菌液、125 μl（10 μg/μl）变性并剪切的鲑鱼精 DNA 以及 30 μg cDNA 文库混合，通过移液器轻柔吹打混匀。加入 15 ml PEG/LiAc 溶液，再次轻柔混匀。将混合物分装至 25 个已灭菌的 1.5-ml 微量离心管中，每管 700 μl。
   13. 于 30°C 水浴中孵育 30 分钟。
   14. 于 42°C 水浴中热激 15 分钟。
   15. 于室温下以 6,000 g 离心 1 分钟。小心弃去上清液，用移液器反复吹打，将每管沉淀轻轻重悬于 400 μl 高压灭菌的去离子水中。
3. 使用涂布棒将每次转化反应的 200 μl 混合物分别涂布于单个 10-cm SD-Leu-Trp-His-Ura+3AT 平板（3AT 浓度：25 mM）上，25 个已灭菌的 1.5-ml 微量离心管可制备 50 个平板（SD-Leu-Trp-His-Ura +3AT）。
4. 于 30°C 培养 5–10 天。
5. 为评估转化效率，将其中一次转化反应液进行系列稀释（1:40；1:400 和 1:4000），并涂布于 SD-Leu-Trp 平板。于 30°C 培养 3 天后，计数菌落数并计算转化子总数。

7. X-gal 检测

1. 将菌落转移至YPD平板，30°C过夜培养。
2. 将圆形硝酸纤维素膜放置于YPD平板上，确保膜与平板之间无气泡。1-2分钟后，确认所有菌落均已转移至膜上（硝酸纤维素膜）。
3. 将膜菌落面朝上置于铝箔纸制成的舟形容器中。
4. 将膜放入液氮中，等待20秒，再完全浸入液氮中数分钟。
5. 取出膜使其解冻。
6. 同时配制以下试剂：
   1.5 ml Z缓冲液
   20 μl X-gal（20 mg/ml）
7. 在培养皿中加入Z缓冲液/X-gal混合液，其上放置一张Whatman滤纸。
8. 小心地将硝酸纤维素膜置于Whatman滤纸上。
9. 37°C孵育，直至出现蓝色菌落。

8. 重新转化实验

从文库筛选中获得的猎物融合蛋白（AD-Y）应保留与诱饵融合蛋白（DB-X）的相互作用，以激活报告基因；将猎物克隆和诱饵质粒重新转化至酵母中，可进一步消除假阳性结果，并有助于后续分析。

1. 从可能含有相互作用蛋白的酵母菌株中分离质粒DNA。
2. 将DNA转化至E. coli DH5α细胞中，将转化产物涂布于LB+100 μg/ml氨苄青霉素平板上，以选择性分离pPC86-cDNA文库，并在37°C下过夜培养。
3. 从平板上挑取数个菌落，接种至LB+100 μg/ml氨苄青霉素液体培养基中。
4. 制备质粒小量提取DNA，并使用Sal I和Not I进行双酶切限制性分析鉴定。
5. 将猎物质粒和诱饵质粒共转化至MaV203酵母菌株中，将转化混合物涂布于SC-Leu-Trp平板上，在30°C下培养2-3天。
6. 从SC-Leu-Trp平板上挑取三个不同的菌落，进行X-gal显色检测。

9. 测序与生物信息学分析

对从可能的真阳性克隆中分离得到的质粒DNA进行测序，利用BLAST程序将这些序列与GenBank中的序列进行比对，并鉴定出对应于已知基因的双杂交克隆。测序结果表明，上述获得的12个阳性克隆中有两个为细胞表面TNFR2（TNFRSF1B/CD120b；登录号 #NM_130426）。此外，PGRN与TNFR之间的相互作用通过多种蛋白质-蛋白质相互作用实验得到了验证，包括体外固相结合实验、免疫共沉淀、表面等离子共振分析以及流式细胞术检测¹⁴。

10. 代表性结果

筛选流程图如图3所示。通常在此步骤可获得50-100个阳性克隆候选株。我们在250万个以PGRN为诱饵筛选的转化子中，最初分离出54个阳性克隆候选株。随后通过X-gal检测对阳性克隆候选株进行验证。通常，约50%的假阳性克隆可通过X-gal检测被剔除。在此步骤中，我们获得了23个针对PGRN诱饵的阳性克隆候选株（图4）。将捕获克隆与诱饵载体重新共转化至酵母中，可进一步消除假阳性克隆；仍能激活报告基因的克隆很可能为真阳性。通常约有50%的阳性克隆候选株将被排除。最终，我们分离出12个在酵母中与PGRN发生相互作用的阳性克隆。

图1. 酵母双杂交系统原理

图 2. 利用酵母双杂交系统鉴定蛋白质结合伴侣的实验流程

图 3. 酵母双杂交文库筛选流程图。点击此处查看该图像的完整尺寸版本。

图 4. 阳性克隆候选子的β-半乳糖苷酶检测。A，从文库筛选中获得的阳性克隆被转移至YPD平板，并在30°C下过夜培养；B，YPD平板上的所有菌落被转移至硝酸纤维素膜，并进行β-半乳糖苷酶活性检测。

讨论

酵母双杂交筛选已被证实是鉴定蛋白质相互作用的有效工具^{16, 17}。与其他鉴定蛋白质结合伴侣的方法（如生化共纯化和蛋白质芯片）相比，酵母双杂交系统是一种灵敏的遗传学方法，可在相对简单的实验中筛选大量编码序列；此外，该方法可检测体内相互作用，且无需复杂的蛋白质纯化步骤。当然，酵母双杂交系统也存在局限性，例如缺乏必要的翻译后修饰、融合蛋白折叠不充分和/或稳定性不足，以及亚细胞定位的改变（蛋白质被带入细胞核，而这可能并非其真实的生理状态）。此外，某些能非特异性激活报告基因（如自激活蛋白）的蛋白质不能直接用作筛选猎物cDNA文库的诱饵。为了克服这一缺陷，通常使用单个功能结构域而非完整蛋白质作为诱饵，随后再通过多种方法利用完整蛋白质验证所发现的相互作用。例如，我们曾成功利用COMP的EGF样结构域作为诱饵，筛选出ADAMTS-7金属蛋白酶和前颗粒蛋白生长因子作为COMP的结合伴侣^{10, 13}。

传统的筛选过程耗时较长，因为需要先将酵母转化子涂布于第一块三缺培养基（SD-Leu-Trp-His +3AT）上以筛选His+克隆，再将这些克隆转移到第二块三...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ProQuest 双杂交系统	Invitrogen	10835
YPD 生长培养基	Clontech Laboratories	630409
YPD 琼脂培养基	Clontech Laboratories	630410
最小SD琼脂基础培养基	Clontech Laboratories	630412
-Leu DO补充剂	Clontech Laboratories	630414
-Leu/-Trp DO补充剂	Clontech Laboratories	630417
-His/-Leu/-Trp/-Ura DO补充剂	Clontech Laboratories	630425
3-氨基-1,2,4-三唑（3AT）	Sigma-Aldrich	A8056
LB培养基（Luria broth）	Sigma-Aldrich	L3022
X-Gal	Invitrogen	15520-034
超声处理的鲑精DNA	Stratagene, Agilent Technologies	201190
氨苄青霉素	AMRESCO	0339
硫酸卡那霉素	Invitrogen	11815-024
Subcloning Efficiency™ DH5α™ 感受态细胞	Invitrogen	18265-017
Trizma® 碱基	Sigma-Aldrich	T6066
乙酸锂	Sigma-Aldrich	L4158
乙二胺四乙酸	Sigma-Aldrich	ED
硝酸纤维素膜	Bio-Rad	162-0115
10 cm培养皿	ITI Scientific	CT-903
培养箱（30 °C）	ATR (Ecotron)