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小鼠肺树突状细胞的分离

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DOI：

10.3791/3563

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2011年11月22日

 , 
1Pathobiological Sciences, Louisiana State University

本文内容

摘要

本文介绍了一种高度纯化的小鼠肺树突状细胞的制备方法。重点在于分离传统的树突状细胞亚群。

摘要

肺树突状细胞（DC）在感知入侵病原体1,2以及调控呼吸道耐受性免疫应答3中发挥关键作用。在小鼠中，至少已鉴定出三种主要的肺树突状细胞亚群：传统树突状细胞（cDC）4、浆细胞样树突状细胞（pDC）5和干扰素产生型杀伤性树突状细胞（IKDC）6,7。其中，cDC亚群是肺中数量最多的树突状细胞亚群8。

已知用于鉴定树突状细胞亚群的共同标志物是CD11c，这是一种I型跨膜整合素（β2），也在单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞以及部分B细胞上表达。 9在某些组织中，使用 CD11c 作为标记物来鉴定小鼠树突状细胞是可行的，例如在脾脏中，大多数 CD11c+ 细胞代表表达高水平主要组织相容性复合物II类（MHC-II）的cDC亚群。然而，肺是一种更为异质性的组织，除树突状细胞（DC）亚群外，还存在大量表型独特的细胞群体，其表达高水平的CD11c但低水平的MHC-II。根据其表型特征，尤其是对F4/80（一种脾巨噬细胞标志物）的表达，该CD11c⁺细胞群体被鉴定为肺泡巨噬细胞。你好MHC-IIlo 肺细胞群体已被鉴定为肺泡巨噬细胞10，最近还被认为是潜在的树突状细胞前体 11.

与小鼠浆细胞样树突状细胞（pDC）不同，由于缺乏可用于分离这些细胞的特异性标记物，目前对经典树突状细胞（cDC）在肺部免疫反应中特定作用的研究仍然有限。因此，本研究描述了一种用于分离高纯度小鼠肺部cDC的方法。肺树突状细胞亚群的分离是研究这些细胞在应对呼吸道病原体以及可触发肺部宿主免疫反应的环境因素时功能的重要工具。

方案

1. 肺灌注与单细胞悬液制备

  1. 通过腹腔注射戊巴比妥/甲苯噻嗪麻醉混合物（每只小鼠注射剂量为：戊巴比妥 1.8 mg，甲苯噻嗪 0.19 mg）实施安乐死，并通过股静脉放血。
  2. 剪开并轻轻向后剥离腹膜外层皮肤，暴露胸腔。剪开肋骨以打开膈肌，暴露心脏和肺组织。
  3. 使用装有 EDTA-HBSS（含 1 mM EDTA 的无钙/无镁 HBSS）的 5 ml 注射器轻柔灌注肺组织。连接 25 G 针头，并将其插入右心室。为防止注射过程中液体泄漏，使用镊子夹住针头周围的肌性心肌组织。在保持恒定压力的同时缓慢注入溶液。充分灌注后，肺组织将膨胀并变为粉白色。
  4. 移除引流淋巴结，以避免该组织可能带来的污染。
  5. 收集肺组织，转移至冰上培养皿中，使用刀片将其切成小块。
  6. 将切碎的组织转移至 gentleMACS C 管中，每只肺加入 5 ml 胶原酶消化液（HBSS 中含 0.5 mg/ml I 型胶原酶 A、20 μg/ml IV 型牛胰 DN 酶、5% FBS、100 U/ml 青霉素和 100 μg/ml 链霉素）。
  7. 使用 gentleMACS 组织解离仪制备单细胞悬液。选择程序：m_lung_01。将样品在 37 °C 下孵育 30 分钟，每 5 分钟振荡一次以重悬组织碎片。随后运行程序 m_lung_02。
  8. 将样品转移至 15 ml 圆底离心管中，在 4 °C 下以 335 x g 离心 10 分钟。此后所有试剂和离心步骤均需在 4 °C 下进行，以防止细胞活力下降。
  9. 弃去上清液，加入 2 ml ACK 裂解缓冲液，在室温下裂解残留红细胞 1 分钟。用 13 ml 冷 PBS/0.5% BSA 洗涤细胞，并在 4°C 下以 335 x g 离心 10 分钟。
  10. 弃去上清液，将总细胞重悬于 5 ml 冷 PBS/0.5% BSA 中，并通过 100 μm 尼龙滤网过滤。
  11. 使用台盼蓝排斥染色法测定总细胞数量。

2. 磁珠分离与CD11c+细胞富集

  1. 将单细胞悬液在 4 °C 条件下以 200 x g 离心 10 分钟，弃去上清液。
  2. 每 108 个总细胞用 400 μl 分离缓冲液（PBS、0.5% BSA 和 2 mM EDTA）重悬细胞沉淀。加入抗 CD16/CD32 抗体（0.5 μg/106 个细胞）于 4 °C 孵育 30 分钟，以阻断 Fc 受体介导的非特异性抗体结合。
  3. 用 10 ml 冷分离缓冲液洗涤细胞，在 4 °C 条件下以 200 x g 离心 10 分钟。将细胞重悬于 400 μl 分离缓冲液中。
  4. 每 108 个总细胞加入 100 μl CD11c MicroBeads。充分混匀后于冰箱（2–8 °C）孵育 15 分钟。
  5. 用 10 ml 冷分离缓冲液洗涤细胞，在 4 °C 条件下以 200 x g 离心 10 分钟，弃去上清液。
  6. 将细胞沉淀重悬于 3 ml 冷分离缓冲液中。
  7. 使用 autoMACS ProTM 分离仪，选择 posseld 程序进行磁性分离，收集阳性组分（0.5 ml）。

3. 传统树突状细胞（cDC）的分离

  1. 将富集的CD11c阳性细胞悬液与抗CD11c PE-Cy7和抗I-A/I-E（MHC-II）-FITC抗体在4 °C下孵育30分钟。抗体的最佳浓度为每106个细胞使用0.5 μg。
  2. 用冷的PBS/0.5% BSA洗涤细胞，并在4 °C下以335 x g离心10分钟。将细胞重悬于0.5 ml PBS/0.5% BSA中，并通过40 μm尼龙滤网过滤。
  3. 使用FACS Aria细胞分选仪在纯度模式下进行细胞分选。在收集管中加入100 μl PBS/0.5% BSA，以防止纯化后的细胞受损。在整个细胞分选过程中保持细胞处于冷藏温度。

4. 获得单细胞悬液和富集CD11c+细胞的替代方案

  1. 可使用15 ml锥形管替代gentleMACS解离仪，将步骤1.5中研磨后的肺组织转移至含5 ml胶原酶溶液（每肺组织一份）的15 ml锥形管中，于37 °C孵育1小时。每隔15分钟涡旋振荡一次，以重悬组织碎片。将样本通过连接20 G针头的3 ml注射器反复推注6–8次，以机械方式解离组织。操作过程中应避免产生气泡，否则将影响细胞活力。获得单细胞悬液后，继续进行步骤1.8。
  2. 可使用两根MACS柱手动操作，替代AutoMACSProTM分选仪，以实现CD11c细胞的磁珠分离富集。所选用的MACS柱类型需根据样本量进行适当选择。

5. 代表性结果：

肺部cDC被鉴定为CD11chi/MHC-IIhi细胞群体。如图1所示，与其他组织（如脾脏，占4.8%）相比，cDC所占比例较小，仅为1.4%。然而，与脾脏不同的是，肺部CD11c阳性细胞表达不同水平的MHC-II，其中包括一个不同于cDC的细胞群体。单细胞制备后，每只肺获得的总肺细胞数量约为3.0至3.8 x 107个细胞，细胞活力为60–70%，其中cDC亚群约占略高于1%。经CD11c磁珠分选后，cDC的比例较原始制备样本提高了约10倍（>16%）（图2A）。然而，表达低水平MHC-II的CD11c细胞（CD11chi/MHC-IIlo，即巨噬细胞）构成了一个高比例的污染细胞群体（>70%），并与肺cDC亚群混合存在。如图2B所示，在细胞分选步骤后，这些污染细胞被有效去除，cDC纯度达到>96%。整个实验流程结束后，每只肺通常可获得约5 x 104个cDC细胞。显微照片显示cDC具有典型的形态学特征，表现为具有典型树突状突起的圆形细胞（上图）。另一方面，CD11chi/MHC-IIlo细胞则代表了一个形态学上不同的亚群，其具有典型的巨噬细胞（MΦ）样细胞突起（下图）12。

显示肺和脾脏cDC分析中CD11c与MHC-II表达的流式细胞术散点图。
图1. 小鼠肺和脾脏中树突状细胞频率的差异。收集C57BL/6小鼠的肺和脾组织，并用胶原酶处理。胶原酶消化后，细胞用抗小鼠CD11c-PE-Cy7和抗小鼠I-A/I-E-FITC染色。代表性流式细胞术图显示肺和脾中cDC（CD11chi/MHC-IIhi）的百分比。

磁分离示意图，CD11c/MHC-II 流式细胞术图谱、细胞分选结果、cDC 形态学。
图 2. 从小鼠肺组织中分离cDC。 将小鼠肺单细胞悬液用抗CD11c磁珠标记后，通过自动细胞分选仪进行分离。A) 典型图显示在CD11c富集后cDC（CD11chi/MHC-IIhi）和巨噬细胞（MΦ，CD11chi/MHC-IIlo）群体的百分比。对富集后的细胞进一步使用抗小鼠CD11c-PE-Cy7和抗小鼠I-A/I-E-FITC抗体染色，分选双阳性细胞并进行流式细胞术分析。为鉴定其形态，将细胞进行细胞离心涂片，并采用改良的瑞氏-吉姆萨染色法染色。B) 代表性图谱显示细胞分选后cDC与MΦ的百分比。显微照片展示肺cDC和肺MΦ的典型图像。比例尺 = 20 μm。

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讨论

从小鼠肺部分离树突状细胞是研究多种呼吸道刺激物的重要技术。获取这些细胞的过程包含若干关键步骤，以防止细胞丢失，并确保细胞的活力和纯度。在收集前对肺组织进行灌注，有助于清除外周血细胞并减少红细胞污染。当处理大量肺组织时，可采用自动化组织解离系统；否则可选择替代方案，但需注意在手动操作时，胶原酶消化后的组织分散过程应轻柔进行。肺组织在胶原酶溶液中的孵育时间不应超过规定时长。此步骤之后，所有操作必须使用预冷缓冲液并在冷藏离心机中进行，以减少细胞死亡。去除污染性红细胞的裂解步骤在整个过程中不应重复超过两次。在指定步骤中将细胞悬液通过尼龙筛网过滤，对于防止细胞分选仪堵塞以及减少细胞团块至关重要，后者会影响细胞纯度。若需进一步培养 体外 由于涉及分离细胞的操作，所有步骤必须在生物安全柜中进行，以防止任何污染。细胞分选步骤不会影响样品的无菌性。

树突状细胞对于研究先天免疫与适应性免疫的相互作用至关重要。如果在磁性分离和细胞分选过程中使用适当的抗体，所述方法有望应用于其他树突状细胞亚群的分离。 8此外，肺泡巨噬细胞（CD11c你好/M...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者谨此感谢路易斯安那州立大学流式细胞术核心设施的Marilyn Dietrich在细胞分选方面的帮助，以及Peter Mottram在显微摄影方面的协助。本研究由飞行乘务员医学研究基金会、路易斯安那州立大学竞争性研究计划奖以及美国国立卫生研究院/过敏与传染病研究所资助，资助编号分别为P20 RR020159和R03AI081171。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
ACK 裂解缓冲液InvitrogenD6-0005DG
抗小鼠 CD11c（HL3）BD Biosciences5580979PE-Cy7 标记
抗小鼠 I-A/I-E（269）BD Biosciences553623FITC 标记
胶原酶 I 型 ASigma-Aldrich9891-500MG
细胞滤筛BD Biosciences352340, 352360
CD11c（N418）微珠Miltenyi Biotec130-052-001
脱氧核糖核酸酶 I（DNase I）Sigma-AldrichD5025-150KU
Hank’s 平衡盐溶液Invitrogen14170
HEPES 缓冲液Invitrogen15630
60 mm 培养皿BD Biosciences351016
GentleMACS™ C 管Miltenyi Biotec130-093-237
Gentle MACS 组织解离仪Miltenyi Biotec130-093-235
AutoMACS-Pro™Miltenyi Biotec130-092-545
FACS AriaBD Biosciences

参考文献

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CD11c MHC II

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