小鼠肺树突状细胞的分离

摘要

本文介绍了一种高度纯化的小鼠肺树突状细胞的制备方法。重点在于分离传统的树突状细胞亚群。

摘要

肺树突状细胞（DC）在感知入侵病原体^1,2以及调控呼吸道耐受性免疫应答³中发挥关键作用。在小鼠中，至少已鉴定出三种主要的肺树突状细胞亚群：传统树突状细胞（cDC）⁴、浆细胞样树突状细胞（pDC）⁵和干扰素产生型杀伤性树突状细胞（IKDC）^6,7。其中，cDC亚群是肺中数量最多的树突状细胞亚群⁸。

已知用于鉴定树突状细胞亚群的共同标志物是CD11c，这是一种I型跨膜整合素（β2），也在单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞以及部分B细胞上表达。 ⁹在某些组织中，使用 CD11c 作为标记物来鉴定小鼠树突状细胞是可行的，例如在脾脏中，大多数 CD11c⁺ 细胞代表表达高水平主要组织相容性复合物II类（MHC-II）的cDC亚群。然而，肺是一种更为异质性的组织，除树突状细胞（DC）亚群外，还存在大量表型独特的细胞群体，其表达高水平的CD11c但低水平的MHC-II。根据其表型特征，尤其是对F4/80（一种脾巨噬细胞标志物）的表达，该CD11c⁺细胞群体被鉴定为肺泡巨噬细胞。^你好MHC-II^lo 肺细胞群体已被鉴定为肺泡巨噬细胞10，最近还被认为是潜在的树突状细胞前体 ¹¹.

与小鼠浆细胞样树突状细胞（pDC）不同，由于缺乏可用于分离这些细胞的特异性标记物，目前对经典树突状细胞（cDC）在肺部免疫反应中特定作用的研究仍然有限。因此，本研究描述了一种用于分离高纯度小鼠肺部cDC的方法。肺树突状细胞亚群的分离是研究这些细胞在应对呼吸道病原体以及可触发肺部宿主免疫反应的环境因素时功能的重要工具。

方案

1. 肺灌注与单细胞悬液制备

1. 通过腹腔注射戊巴比妥/甲苯噻嗪麻醉混合物（每只小鼠注射剂量为：戊巴比妥 1.8 mg，甲苯噻嗪 0.19 mg）实施安乐死，并通过股静脉放血。
2. 剪开并轻轻向后剥离腹膜外层皮肤，暴露胸腔。剪开肋骨以打开膈肌，暴露心脏和肺组织。
3. 使用装有 EDTA-HBSS（含 1 mM EDTA 的无钙/无镁 HBSS）的 5 ml 注射器轻柔灌注肺组织。连接 25 G 针头，并将其插入右心室。为防止注射过程中液体泄漏，使用镊子夹住针头周围的肌性心肌组织。在保持恒定压力的同时缓慢注入溶液。充分灌注后，肺组织将膨胀并变为粉白色。
4. 移除引流淋巴结，以避免该组织可能带来的污染。
5. 收集肺组织，转移至冰上培养皿中，使用刀片将其切成小块。
6. 将切碎的组织转移至 gentleMACS C 管中，每只肺加入 5 ml 胶原酶消化液（HBSS 中含 0.5 mg/ml I 型胶原酶 A、20 μg/ml IV 型牛胰 DN 酶、5% FBS、100 U/ml 青霉素和 100 μg/ml 链霉素）。
7. 使用 gentleMACS 组织解离仪制备单细胞悬液。选择程序：m_lung_01。将样品在 37 °C 下孵育 30 分钟，每 5 分钟振荡一次以重悬组织碎片。随后运行程序 m_lung_02。
8. 将样品转移至 15 ml 圆底离心管中，在 4 ....

讨论

从小鼠肺部分离树突状细胞是研究多种呼吸道刺激物的重要技术。获取这些细胞的过程包含若干关键步骤，以防止细胞丢失，并确保细胞的活力和纯度。在收集前对肺组织进行灌注，有助于清除外周血细胞并减少红细胞污染。当处理大量肺组织时，可采用自动化组织解离系统；否则可选择替代方案，但需注意在手动操作时，胶原酶消化后的组织分散过程应轻柔进行。肺组织在胶原酶溶液中的孵育时间不应超过规定时长。此步骤之后，所有操作必须使用预冷缓冲液并在冷藏离心机中进行，以减少细胞死亡。去除污染性红细胞的裂解步骤在整个过程中不应重复超过两次。在指定步骤中将细胞悬液通过尼龙筛网过滤，对于防止细胞分选仪堵塞以及减少细胞团块至关重要，后者会影响细胞纯度。若需进一步培养 体外 由于涉及分离细胞的操作，所有步骤必须在生物安全柜中进行，以防止任何污染。细胞分选步骤不会影响样品的无菌性。

树突状细胞对于研究先天免疫与适应性免疫的相互作用至关重要。如果在磁性分离和细胞分选过程中使用适当的抗体，所述方法有望应用于其他树突状细胞亚群的分离。 ⁸此外，肺泡巨噬细胞（CD11c^你好/M.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ACK 裂解缓冲液	Invitrogen	D6-0005DG
抗小鼠 CD11c（HL3）	BD Biosciences	5580979	PE-Cy7 标记
抗小鼠 I-A/I-E（269）	BD Biosciences	553623	FITC 标记
胶原酶 I 型 A	Sigma-Aldrich	9891-500MG
细胞滤筛	BD Biosciences	352340, 352360
CD11c（N418）微珠	Miltenyi Biotec	130-052-001
脱氧核糖核酸酶 I（DNase I）	Sigma-Aldrich	D5025-150KU
Hank’s 平衡盐溶液	Invitrogen	14170
HEPES 缓冲液	Invitrogen	15630
60 mm 培养皿	BD Biosciences	351016
GentleMACS™ C 管	Miltenyi Biotec	130-093-237
Gentle MACS 组织解离仪	Miltenyi Biotec	130-093-235
AutoMACS-Pro™	Miltenyi Biotec	130-092-545
FACS Aria	BD Biosciences