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测量肽在大单层囊泡中的转位

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DOI：

10.3791/3571

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2012年1月27日

 ,  , 
1Department of Chemistry, Wellesley College

本文内容

摘要

本方案详细描述了一种定量测定肽进入大型单层脂质体的实验方法。该方法还可提供关于膜转位速率的信息，并可用于鉴定能够高效且自发穿过脂质双层的肽。

摘要

目前，人们对那些无需细胞膜受体协助即可轻易穿过细胞膜的肽类具有浓厚的研究兴趣1。其中许多肽被称为细胞穿透肽，因其在药物递送载体方面的潜力而备受关注1-3。此外，针对通过非膜裂解机制发挥作用的抗菌肽，研究兴趣也日益增长4,5，特别是那些能够穿过细菌膜而不引起细胞裂解，并通过干扰细胞内过程杀死细胞的肽6,7。事实上，越来越多的研究者指出了细胞穿透肽与抗菌肽之间的关联1,8。要深入理解膜转位过程以及肽结构与其转位能力之间的关系，需要具备高效且可重复的转位检测方法。已有多个研究团队提出了用于测定肽进入大单层脂质体（LUVs）的实验方法9-13。LUVs 可作为细菌和真核细胞膜的有效模型，常被用于肽的荧光研究14,15。本文中，我们描述了对 Matsuzaki 及其同事首次建立的方法的应用，用于研究诸如 magainin 和 buforin II 等抗菌肽16,17。除了提供该方法的详细实验方案外，我们还介绍了一种简明的数据分析方法，可用于在此检测中定量评估肽的转位能力。与其他转位检测方法相比，该检测的优势在于其能够提供有关膜转位速率的信息，并且对于含色氨酸的肽，无需额外添加可能改变肽性质的荧光标记18。简而言之，当肽与 LUV 外膜结合时，其进入脂质体的转位能力通过内源性色氨酸残基与丹磺酰磷脂酰乙醇胺之间的荧光共振能量转移（FRET）进行测定（图1）。当细胞穿透肽进入含有未抑制胰蛋白酶的 LUVs 时会被切割，从而脱离 LUV 膜，导致 FRET 信号下降。对于具有转位能力的肽，其 FRET 信号的下降程度显著高于在 LUVs 同时含有胰蛋白酶和胰蛋白酶抑制剂的情况下，或当不能自发穿过脂质膜的肽暴露于含胰蛋白酶的 LUVs 时所观察到的信号下降。这种荧光信号的变化可直接量化肽随时间发生的转位过程。

方案

1. 大型单层脂质体（LUVs）的制备

  1. 制备大单层囊泡（LUVs），作为检测中模拟细胞膜的模型19。
  2. 将氯仿中的磷脂酰胆碱（POPC, 760.10 g/mol）、磷脂酰甘油（POPG, 770.99 g/mol）和5-二甲基氨基萘-1-磺酰基磷脂酰乙醇胺（DNS-POPE, 994.350 g/mol）（Avanti Polar Lipids）按50:45:5的比例混合。由于每次检测均需分别制备实验组和对照组LUVs，应准备两个脂质薄膜样品。通常，0.376 mg总脂质（0.188 mg POPC、0.169 mg POPG和0.019 mg DNS-POPE）足以制备一次转运实验所需的囊泡量。
  3. 使用氮气（N2）气流蒸发除去氯仿。
  4. 将脂质薄膜在真空干燥器中干燥9–14小时。
  5. 配制10 mM HEPES缓冲液储备液（10 mM HEPES, 238.3 g/mol, 45 mM NaCl, 58.44 g/mol, 1 mM EDTA, 372.24 g/mol，pH 7.4）。HEPES缓冲液储存于4°C。
  6. 用上述配制的10 mM HEPES缓冲液配制0.4 mM猪胰蛋白酶（23.3 kg/mol）的储备液。胰蛋白酶储存于-20°C，在本实验操作中，通常在使用前冻融次数不超过2次。
  7. 用10 mM HEPES缓冲液配制4.0 mM Bowman-Birk胰蛋白酶抑制剂（8 kg/mol）的储备液，并储存于-20°C。在本实验中，该储备液每月更新一次，通常在重新配制前冻融次数不超过3次。
  8. 通过向干燥的脂质薄膜中加入等体积的0.4 mM胰蛋白酶储备液和10 mM HEPES缓冲液，将实验组多层囊泡（MLVs）在0.2 mM胰蛋白酶溶液中重悬。对于0.376 mg总脂质的单个样品，150 μL胰蛋白酶溶液与150 μL HEPES缓冲液的混合液已足够。
  9. 通过向干燥的脂质薄膜中加入等体积的0.4 mM胰蛋白酶储备液和4.0 mM胰蛋白酶抑制剂溶液，将对照组MLVs在含0.2 mM胰蛋白酶和2.0 mM Bowman-Birk胰蛋白酶抑制剂的溶液中重悬。对于0.376 mg总脂质的单个样品，150 μL胰蛋白酶溶液与150 μL胰蛋白酶抑制剂溶液的混合液已足够。
  10. 将MLV溶液从玻璃小瓶转移至1.7 ml微量离心管中。
  11. 将MLV溶液在液氮中进行5次冻融循环处理。
  12. 准备脂质挤出器（Avanti Polar Lipids）：将两个经HEPES缓冲液润湿的滤膜支撑架分别置于每个聚四氟乙烯（Teflon）挤出器部件上；将一张孔径为0.1 μm的核孔膜（Whatman，英国）置于两个Teflon部件之间，然后将部件插入金属挤出器筒体内；在拧紧金属顶部前，将环形间隔垫圈套在两个挤出器部件上，随后将整个装置放入支架中。
  13. 使用250 μL玻璃注射器向挤出器内腔加入500 μL 10 mM HEPES缓冲液，以防止囊泡样品损失。
  14. 将每个MLV样品装入挤出器中，并至少推动21次，使样品通过膜，以确保获得大小均一的单层囊泡。挤出后即得到LUVs。
  15. 将LUVs储存于4°C，并在48小时内使用。

2. 量化LUV浓度

  1. 通过测定样品中的总磷含量来定量LUV浓度20。
  2. 在纳米纯水中配制8.9 N H2SO4，并在室温下保存。
  3. 在纳米纯水中配制2.5% w/v的六水合钼酸铵（588.04 g/mol）溶液。在纳米纯水中配制10% w/v的抗坏血酸（176.1 g/mol）溶液。用铝箔包裹试管以避免抗坏血酸溶液暴露于光线下。两种溶液均在4 °C下保存，最长可保存2个月。
  4. 配制0.65 mM磷酸盐缓冲液（无水磷酸二氢钠，120 g/mol）。
  5. 准备六个标准管。标准管中应分别含有0.0 μL、50 μL（0.0325 μmol）、100 μL（0.065 μmol）、175 μL（0.114 μmol）、250 μL（0.163 μmol）或350 μL（0.228 μmol）的磷溶液。
  6. 每个LUV样品管设三个重复。每个样品管应含有约0.1 μmol的LUV。实验组和对照组的LUV浓度必须分别测定。
  7. 为校正Bowman-Birk抑制剂粉末中可能存在的干燥磷盐，必须制备对照LUV空白管。空白管中应加入与对照LUV样品管中相同体积的0.2 mM胰蛋白酶/2.0 mM Bowman-Birk抑制剂溶液。
  8. 向每个样品管、标准管和空白管中加入450 μL的8.9 N H2SO4。
  9. 将样品、标准品和空白管在175–210 °C的烘箱中加热25分钟。
  10. 取出所有试管并使其冷却。向每个试管中加入150 μL的30% H2O2。
  11. 将样品、标准品和空白管在175–210 °C下继续加热30分钟。
  12. 将样品、标准品和空白管从加热环境中取出。若任何溶液尚未变为无色，则向所有试管中加入50 μL H2O2，并在175–210 °C下额外加热15分钟。
  13. 向每个试管中加入3.9 mL纳米纯H2O、0.5 mL钼酸铵溶液和0.5 mL抗坏血酸溶液。
  14. 将所有试管在沸水浴中加热5–7分钟。
  15. 使用Agilent 8453紫外-可见分光光度计在820 nm处测定每个标准品和样品的吸光度。含0.0 mmol磷的试管应作为所有标准品和实验LUV样品的空白对照。含0.2 mM胰蛋白酶/2.0 mM Bowman-Birk抑制剂溶液的试管应作为对照LUV样品的空白对照。
  16. 可绘制吸光度与磷含量的标准曲线，并用于计算样品的总磷含量及LUV浓度。

3. 肽溶液的制备

  1. 将多肽溶解于纳米纯 H2O 中。本实验所用多肽必须含有一个色氨酸残基。
  2. 在 282 nm 处测定多肽溶液的吸光度，重复三次。使用色氨酸的摩尔消光系数 5700 M-1cm-1 计算多肽浓度。
  3. 用纳米纯水将多肽稀释至终浓度为 30 μM。于 -20°C 保存。

4. 转位定量分析

  1. 在1.7 mL微量离心管中制备实验组和对照组样品。向每种溶液中加入足量的大单层脂质体（LUVs），使其终浓度达到 250 μM加入足够的 Bowman-Birk 抑制剂溶液，使抑制剂的终浓度比胰蛋白酶浓度高 10 倍。加入足够的 10 mM HEPES 缓冲液，使最终溶液体积达到 450 μL.
  2. 位置 50 μL 将肽溶液加入Starna微型石英荧光池中。大单层囊泡（LUVs）与肽的比例足够高，可确保几乎所有完整的肽都与丹磺酰基团足够接近，从而产生FRET信号，即使没有肽转位进入囊泡内。这与对照条件下观察到的结果一致，即无论肽是否转位进入囊泡，其FRET信号相似。
  3. 将实验组或对照组样品加入比色皿中的肽溶液中，使终浓度达到 3 μM.
  4. 开始一个25分钟的荧光动力学实验 立即 加入实验组或对照组LUV溶液后，每秒至少采集一次荧光读数。激发波长设为280 nm，发射波长设为525 nm，温度设为 25 °C使用Cary Eclipse荧光分光光度计，将PMT灵敏度设为高。

5. 生成定量转位比率

  1. 将初始荧光（Fo）定义为数据采集开始后十五秒时的荧光读数。在我们的仪器设置中，我们发现由于样品加入后产生的混合、关闭样品室以及其他系统扰动，实验最初十五秒内采集的荧光数据不可靠。将后续每个时间点的荧光读数除以 Fo，以获得各时间点的相对荧光值（F/F0）。
  2. 取实验最后一分钟内所有相对荧光读数的平均值，得到最终的平均相对荧光值 用于光学研究中发射分析的荧光比值公式 [F/F0]avg。
  3. 将对照样品的 用于光学研究中发射分析的荧光比值公式 [F/F0]avg 除以实验样品的 用于光学研究中发射分析的荧光比值公式 [F/F0]avg，以获得校正后的最终荧光值。

6. 代表性结果

图2展示了该实验中一种具有显著转位能力的代表性多肽的结果。本实验中的信号（黑色轨迹）显示，随时间推移，FRET信号显著下降。然而，必须排除由于胰蛋白酶抑制不完全或其他与转位能力无关因素导致的FRET信号丢失的可能性。为此，我们始终同时测量多肽与含有胰蛋白酶和弓形蛋白酶抑制剂（Bowman-Birk trypsin inhibitor）的LUVs之间的FRET信号（灰色轨迹，图2）。据我们的经验，每次实验对每种多肽均进行此对照至关重要。这使我们能够明确校正因脂质囊泡制备差异或仪器噪声引起的任何信号变化，因为在这些浓度下通常观察到的荧光信号相对较弱，上述干扰可能较为显著。

图3所示数据凸显了使用含有胰蛋白酶抑制剂的LUVs作为对照实验的重要性。在此情况下，实验样品（黑色迹线）中的肽信号下降程度与图2相似。然而，对照样品中该肽的信号下降更为迅速，因此其净转位量较低。

本方案的第5部分介绍了一种用于量化本实验中转位效率的简单方法。较高的转位比值表明肽具有高效的转位能力；图2所示的穿膜肽的转位比值为1.16，而转位能力较弱的肽其转位比值接近于1。根据我们的经验，使用不同囊泡制备物进行三次独立实验的标准误差范围为0.01至0.06。

病毒基因组编辑示意图，CRISPR-Cas9，分子相互作用过程分析。
图1. 易位实验示意图。 实验用大单层脂质体（LUV）样品（A）中掺入了荧光丹磺酰基标记的POPE（黑色条带），并包封了胰蛋白酶（剪刀符号）。在LUV外部使用胰蛋白酶抑制剂（红色圆圈）以抑制胰蛋白酶活性。将LUV暴露于肽（紫色）中。肽与LUV膜结合后产生FRET信号（绿色），当易位肽进入LUV内部并接触到未被抑制的胰蛋白酶时，FRET信号随之降低。在对照LUV样品（B）中，同时包封胰蛋白酶和胰蛋白酶抑制剂，用于检测与易位无关的FRET信号下降情况。

荧光强度（F/F₀）随时间变化的曲线图；对照组与实验组数据分析。
图2. 细胞穿透肽的代表性数据。 一种具有代表性的穿膜抗菌肽相较于其对照组显示出明显的FRET信号下降。

荧光衰减图；对照组与实验组；时间 vs. F/F₀；数据分析比较。
图3. 代表性数据突出显示对照的重要性。 在实验组和对照组的LUV溶液中，非转位肽的胰蛋白酶消化不完全，导致随时间推移FRET信号下降。由于对照组与实验组曲线之间的差异相对较小，该突变体被归类为弱转位肽。

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讨论

本文所述方案可用于评估肽在脂质囊泡内外浓度的相对变化。这些变化与转位能力相关。该方案可用于鉴定具有作为药物递送载体潜力的细胞穿透肽。随着人们对细胞穿透肽的兴趣日益增加，值得关注的是，能够直接定量测量转位事件的方法将如何被开发和应用。

在我们的实验中，通过仔细监控实验的若干关键环节，发现该检测方法的一致性可得到显著改善。首先，对实验组和对照组囊泡进行定量，有助于提高本方案所得结果的重复性。该检测还依赖于在蛋白质转位和消化开始之前，准确检测初始荧光信号的能力。因此，在蛋白质或肽段暴露于大单层囊泡（LUV）溶液后，必须立即开始采集荧光信号。该检测对所使用的特定胰蛋白酶抑制剂较为敏感；迄今为止，我们使用博伊丁-伯克胰蛋白酶抑制剂（Sigma T-9777）获得了最一致的结果。重要的是，在对照条件下观察到的降解程度在不同肽段之间（如图2和图3所示）存在显著差异，有时甚至在同一肽段的不同囊泡制备样品之间也存在差异。这进一步强调了每次实验重复都必须设置对照的必要性。作为额外对照，也可检测肽段暴露于不含胰蛋白酶及胰蛋白酶抑制剂的囊泡样品时的FRET反应。然而，该对照并不能提供评估肽段转位数据所必...

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

作者感谢Eleanor Fleming和Jessica Chen的有益讨论。本研究由美国国家过敏与传染病研究所（NIH-NIAID）资助项目R15AI079685以及Research Corporation Cottrell College Science Award资助。额外的学生支持由霍华德·休斯医学研究所和Staley基金提供。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
16:0-18:1 PGAvanti Polar Lipid, Inc840457C
1:18 Dansyl PEAvanti Polar Lipid, Inc810330C
16:0-18:1 PCAvanti Polar Lipid, Inc850457C
猪胰蛋白酶Sigma-AldrichT-0303
Bowman-Birk 胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶抑制剂Sigma-AldrichT-9777
微型挤出器Avanti Polar Lipid, Inc610000
钼酸铵（对位）Alfa Aesar10811
L-抗坏血酸Sigma-AldrichA1417
过氧化氢，30% 溶液Mallinckrodt Baker Inc.5240-05
HEPESSigma-AldrichH-3375
NaClSigma-AldrichS-9625
EDTASigma-AldrichE5134
NaH2PO4Sigma-AldrichS-0751

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