本方案详细描述了一种定量测定肽进入大型单层脂质体的实验方法。该方法还可提供关于膜转位速率的信息，并可用于鉴定能够高效且自发穿过脂质双层的肽。
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本文内容
摘要
摘要
目前，人们对那些无需细胞膜受体协助即可轻易穿过细胞膜的肽类具有浓厚的研究兴趣1。其中许多肽被称为细胞穿透肽，因其在药物递送载体方面的潜力而备受关注1-3。此外，针对通过非膜裂解机制发挥作用的抗菌肽，研究兴趣也日益增长4,5，特别是那些能够穿过细菌膜而不引起细胞裂解，并通过干扰细胞内过程杀死细胞的肽6,7。事实上，越来越多的研究者指出了细胞穿透肽与抗菌肽之间的关联1,8。要深入理解膜转位过程以及肽结构与其转位能力之间的关系，需要具备高效且可重复的转位检测方法。已有多个研究团队提出了用于测定肽进入大单层脂质体（LUVs）的实验方法9-13。LUVs 可作为细菌和真核细胞膜的有效模型，常被用于肽的荧光研究14,15。本文中，我们描述了对 Matsuzaki 及其同事首次建立的方法的应用，用于研究诸如 magainin 和 buforin II 等抗菌肽16,17。除了提供该方法的详细实验方案外，我们还介绍了一种简明的数据分析方法，可用于在此检测中定量评估肽的转位能力。与其他转位检测方法相比，该检测的优势在于其能够提供有关膜转位速率的信息，并且对于含色氨酸的肽，无需额外添加可能改变肽性质的荧光标记18。简而言之，当肽与 LUV 外膜结合时，其进入脂质体的转位能力通过内源性色氨酸残基与丹磺酰磷脂酰乙醇胺之间的荧光共振能量转移（FRET）进行测定（图1）。当细胞穿透肽进入含有未抑制胰蛋白酶的 LUVs 时会被切割，从而脱离 LUV 膜，导致 FRET 信号下降。对于具有转位能力的肽，其 FRET 信号的下降程度显著高于在 LUVs 同时含有胰蛋白酶和胰蛋白酶抑制剂的情况下，或当不能自发穿过脂质膜的肽暴露于含胰蛋白酶的 LUVs 时所观察到的信号下降。这种荧光信号的变化可直接量化肽随时间发生的转位过程。
方案
1. 大型单层脂质体（LUVs）的制备
- 制备大单层囊泡（LUVs），作为检测中模拟细胞膜的模型19。
- 将氯仿中的磷脂酰胆碱（POPC, 760.10 g/mol）、磷脂酰甘油（POPG, 770.99 g/mol）和5-二甲基氨基萘-1-磺酰基磷脂酰乙醇胺（DNS-POPE, 994.350 g/mol）（Avanti Polar Lipids）按50:45:5的比例混合。由于每次检测均需分别制备实验组和对照组LUVs，应准备两个脂质薄膜样品。通常，0.376 mg总脂质（0.188 mg POPC、0.169 mg POPG和0.019 mg DNS-POPE）足以制备一次转运实验所需的囊泡量。
- 使用氮气（N2）气流蒸发除去氯仿。
- 将脂质薄膜在真空干燥器中干燥9–14小时。
- 配制10 mM HEPES缓冲液储备液（10 mM HEPES, 238.3 g/mol, 45 mM NaCl, 58.44 g/mol, 1 mM EDTA, 372.24 g/mol，pH 7.4）。HEPES缓冲液储存于4°C。
- 用上述配制的10 mM HEPES缓冲液配制0.4 mM猪胰蛋白酶（23.3 kg/mol）的储备液。胰蛋白酶储存于-20°C，在本实验操作中，通常在使用前冻融次数不超过2次。
- 用10 mM HEPES缓冲液配制4.0 mM Bowman-....
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讨论
本文所述方案可用于评估肽在脂质囊泡内外浓度的相对变化。这些变化与转位能力相关。该方案可用于鉴定具有作为药物递送载体潜力的细胞穿透肽。随着人们对细胞穿透肽的兴趣日益增加，值得关注的是，能够直接定量测量转位事件的方法将如何被开发和应用。
在我们的实验中，通过仔细监控实验的若干关键环节，发现该检测方法的一致性可得到显著改善。首先，对实验组和对照组囊泡进行定量，有助于提高本方案所得结果的重复性。该检测还依赖于在蛋白质转位和消化开始之前，准确检测初始荧光信号的能力。因此，在蛋白质或肽段暴露于大单层囊泡（LUV）溶液后，必须立即开始采集荧光信号。该检测对所使用的特定胰蛋白酶抑制剂较为敏感；迄今为止，我们使用博伊丁-伯克胰蛋白酶抑制剂（Sigma T-9777）获得了最一致的结果。重要的是，在对照条件下观察到的降解程度在不同肽段之间（如图2和图3所示）存在显著差异，有时甚至在同一肽段的不同囊泡制备样品之间也存在差异。这进一步强调了每次实验重复都必须设置对照的必要性。作为额外对照，也可检测肽段暴露于不含胰蛋白酶及胰蛋白酶抑制剂的囊泡样品时的FRET反应。然而，该对照并不能提供评估肽段转位数据所必.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
作者感谢Eleanor Fleming和Jessica Chen的有益讨论。本研究由美国国家过敏与传染病研究所（NIH-NIAID）资助项目R15AI079685以及Research Corporation Cottrell College Science Award资助。额外的学生支持由霍华德·休斯医学研究所和Staley基金提供。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 16:0-18:1 PG | Avanti Polar Lipid, Inc | 840457C | |
| 1:18 Dansyl PE | Avanti Polar Lipid, Inc | 810330C | |
| 16:0-18:1 PC | Avanti Polar Lipid, Inc | 850457C | |
| 猪胰蛋白酶 | Sigma-Aldrich | T-0303 | |
| Bowman-Birk 胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶抑制剂 | Sigma-Aldrich | T-9777 | |
| 微型挤出器 | Avanti Polar Lipid, Inc | 610000 | |
| 钼酸铵（对位） | Alfa Aesar | 10811 | |
| L-抗坏血酸 | Sigma-Aldrich | A1417 | |
| 过氧化氢，30% 溶液 | Mallinckrodt Baker Inc. | 5240-05 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-3375 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S-9625 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S-0751 |
参考文献
- Henriques, S. T., Melo, M. N., Castanho, M. A. Cell-penetrating peptides and antimicrobial peptides: how different are they? Biochem. J. 399 (1), 1-1 (2006).
- Trehin, R., Merkle, H. P. Chances and pitfalls of cell penetrating peptides for cellular drug....
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