MALDI-TOF 质谱技术已成功用于监测蛋白激酶 Pak2 活化过程中的酰胺氢/氘交换。
本文内容
摘要
摘要
酰胺氢/氘交换（H/D交换）与质谱联用技术已被广泛用于分析蛋白质-蛋白质相互作用界面、蛋白质构象变化、蛋白质动力学以及蛋白质-配体相互作用。通过质谱检测主链酰胺位点的H/D交换，可测量蛋白质中微区的氘代速率1,2,3。该方法的分辨率依赖于将氘代后的目标蛋白用胃蛋白酶消化为通常长度为3-20个残基的肽段。尽管质谱法测定H/D交换的分辨率低于核磁共振中的异核单量子相干（HSQC）方法所达到的单残基分辨率，但质谱法在H/D交换分析中不受蛋白质大小的限制4。H/D交换在维持蛋白质构象的水溶液中进行。我们提供一种利用MALDI-TOF进行检测的方法2，而非使用高效液相色谱/电喷雾电离（HPLC/ESI）-质谱系统5,6。MALDI-TOF可为消化后蛋白的肽段提供精确的质量强度数据，在本例中为蛋白激酶Pak2（亦称γ-Pak）。Pak2的蛋白水解在离线条件下通过胃蛋白酶消化完成。当用户无法获得连接至质谱系统的HPLC及胃蛋白酶柱，或HPLC上的胃蛋白酶柱无法产生理想的消化图谱时（例如富含二硫键的分泌型磷脂酶A2（sPLA2）），该替代方法尤为适用。利用此方法，我们成功监测了Pak2在caspase 3剪切及自磷酸化激活过程中氘代水平的变化7,8,9。
方案
1. Pak2 激活
- 将适当预测试量的半胱天冬酶3（caspase 3）加入到20 μl含12 mg/ml Pak2的缓冲液A（50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl和2 mM DTT，pH 7.5）中，于34 °C孵育30分钟，以充分切割并激活Pak2。
- 通过SDS-PAGE（10%）及考马斯亮蓝染色分析切割产物。
- 将切割后的Pak2加入20 μl激活缓冲液B（50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、15 mM MgCl2、10 mM ATP，pH 7.5），使Pak2终浓度达到10 mg/ml，并于34 °C孵育30分钟，通过在8个位点的自磷酸化实现Pak2的完全激活。
- 通过SDS-PAGE10检测p34和p27片段的迁移情况，确认Pak2的完全切割。自磷酸化条件的正确性验证需在另一实验中通过放射自显影法使用(32P)ATP或质谱法检测磷酸化肽段来完成。
2. 鉰蛋白酶消化的 Pak2 片段的鉴定
- 使用前，加入 1 ml 的 0.1 % 三氟乙酸（TFA）（pH 2.5）洗涤琼脂糖珠两次。然后在 2,000 × g 条件下离心 15 秒，以去除珠子。
- 将 Pak2（20 μg 溶于 2 μl 含 150 mM NaCl、50 mM Tris-HCl 和 2 mM DTT 的溶液中，pH 7.5）加入 100 μl 的 0.1 % TFA 中，并与 30 μl 胰蛋白酶偶联的琼脂糖珠在室温下孵育 5 分钟。
- 用含 0.1 % TFA（pH 2.5）的流动相平衡反相高效液相色谱 C18 柱。采用流速为 0.2 ml/min 的线性梯度洗脱（0–80 % 乙腈，含 0.1 % TFA），梯度时间为 100 分钟，上样量为 50 μl 胰蛋白酶消化产物。每 2 分钟收集一个组分。
- 使用真空浓缩仪（speed-vac）干燥 HPLC 各组分（3 小时），并将样品重悬于 5 μl 乙腈和 5 μl 0.1 % TFA（pH 2.5）的混合溶液中。
- 首先使用 MALDI-TOF 质谱仪（PerSeptive Biosystems Voyager DE STR，PE Biosystems，Foster City, CA, USA）对每个组分进行肽段筛选。
- 将含有肽段的 16 个组分进行串联质谱分析，使用 Q-TOF 质谱仪和 QSTAR XL oMALDI MS/MS 鉴定碎片离子。
- 通过串联质谱产生的碎片离子验证各肽段序列，并结合 Pak2 的一级序列，利用 Protein Prospector 网站（http://prospector.ucsf.edu/）11 计算理论 m/z 比值进行比对确认。
3. 酰胺氢氘交换的测定
- 将进行氢/氘交换所需的所有溶液和试剂置于 25 °C 在水浴中。ATP 溶于水，并在使用前将 pH 调至 7.0。D 中额外添加的 4 mM ATP2O缓冲液用于防止Pak2稀释后ATP解离。
- 通过添加启动氢/氘交换 18 μl 缓冲液D2O（50 mM MOPS pH 6.98，125 mM NaCl）至 2 μl (20 μg) 含150 mM NaCl、50 mM Tris-HCl (pH 7.5) 和2 mM DTT的缓冲液中，使Pak2浓度达到10 mg/ml，pH为7.0 0°C.
- 将样品在氢/氘交换体系中孵育，每个时间点设三个重复，孵育时间分别为 0、0.5、1、3、5 和 10 分钟，或 24 小时。
- 通过加入淬灭剂终止氢/氘交换过程 180 μl pH 2.2 的冰冻 0.1 % TFA，最终体积中的 pH 值为 2.5 200 μl对于含有ATP的样品， 180 μl 使用冰浴条件下、pH 2.2 的 0.11% 三氟乙酸（TFA）将淬灭条件下的 pH 维持在 2.5。
- 加入一份等量体积（ aliquot ）（100 μl) 每个淬灭样品的 30 μl 活化胃蛋白酶偶联琼脂糖微珠的处理。将样品置于冰上消化5分钟，每30秒涡旋一次。
- 通过在5,000 x g离心15秒终止消化反应 4 °C 以去除胃蛋白酶。
- 在液氮中快速冷冻样品2 并储存于 -80 °C 在进行MALDI-TOF分析前，保存时间不得超过2天。
- MALDI基质为5 mg/ml的α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA），溶于乙腈、乙醇和0.1%三氟乙酸（TFA）按1:1:1比例配制、pH为2.5的溶液中，并保存于 0 °C.
- 快速部分解冻每个样品并混匀 1 μl 每个样本的 1 μl 基质与点样位置 4 °C MALDI靶板
- 对样品板施加适度真空，使斑点在进行MALDI-TOF分析前30秒内干燥。从样品解冻到获得质谱图的时间约为3分钟。
- 使用 PerSeptive Biosystems Voyager DE STR 获取 MALDI-TOF 质谱数据。以 2 GHz 采样率、100,000 数据通道、20,000 V 加速电压、65% 网格电压进行检测，采用延迟提取技术，脉冲延迟时间为 180 ns。在 2 分钟内累积平均 100 次扫描。MALDI-TOF 仪器不限定特定品牌或专用软件。
- 使用 Data Explorer 4.0 计算机程序计算各片段的氘代程度。
- 根据24小时氢/氘交换过程中实际掺入的氘原子数与所有可交换位点数的比值计算回交换率，可交换位点为除N端酰胺外的所有主链酰胺图1).
4. 代表性结果：
通过SDS-PAGE考马斯亮蓝染色验证caspase切割和自磷酸化。非活性Pak2为一条58 kDa的单一条带。Pak2的caspase切割完全，产生两个片段p27和p34，二者在凝胶中分别迁移。由于完全磷酸化的p27片段迁移受阻，自磷酸化的p27与p34在凝胶上的迁移出现重叠（图2）。
在0至10分钟之间多次进行氢/氘交换实验（图3）。例如，非活性Pak2在m/z 1697.85峰中氘掺入的动力学过程由多个同位素峰组成，表现为质谱峰包随时间发生的位移。
图1. 氘代率计算公式。
图2. Pak2的自磷酸化及caspase切割。通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分析caspase切割的Pak2（左泳道）、完整非活性Pak2（中泳道）以及caspase切割后发生自磷酸化的Pak2（右泳道）。改编自Hsu, YH et al2。
图3. 无活性Pak2在不同时间点的氘代并入质谱图。将无活性Pak2进行0-10分钟的氢/氘交换，并通过MALDI-TOF分析。图中显示了在氢/氘交换时间过程中，m/z为1697.85峰的MALDI-TOF同位素分布扩展示例。红色虚线表示质谱峰包络的平均值，质谱峰包络的位移反映了肽段的氘代程度。
讨论
鉴定胃蛋白酶消化片段是氢/氘交换实验中的关键步骤。若对肽段的鉴定错误，可能导致错误结论。在实验中，将胃蛋白酶消化后的Pak2通过反相高效液相色谱C18柱洗脱，以获得干净的背景。我们共收集了40个组分，并对每个组分进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）分析。每个组分中可鉴定出多个肽段。随后对这些肽段进行串联质谱分析（Q-TOF MS/MS 和 oMALDI MS/MS），以确定其序列。一个肽段的MS/MS谱图应至少包含三个产物离子，方可确认该肽段的鉴定结果。
Data Explorer 4.0 计算机程序（Applied Biosystems）执行初始的基线校正和噪声滤除。每个质谱图必须基于两个已测序的峰进行校准。我们通过未氘代 m/z 的理论质量值（分别为 923.45 和 1697.84）来校准质谱图。校准后的质量精度可达 10 ppm。发生氘代后，单一同位素峰可能向更高质量偏移。这些 m/z 比值的单位阶跃增加对应于与氘代相关的增强质量。质谱峰簇的峰强度不会影响氘代水平。然而，特定质谱峰簇中同位素峰的峰强度对于平均质量的计算至关重要。计算掺入氘原子的第一步是将氘代样品的肽段质量减去非氘代样品的肽段质量。在计算中还需进一步考虑另外三个因素：D2O 稀释、侧链中残留的氘原子以及回交（back exchange）（图 1）。D2O 稀释是指样品与 D2O 缓冲液混合以启动氢/氘交换后，D2O 的稀释因子。胃蛋白酶消化后的肽段侧链中存在的残留氘（4.5%）需要扣除。回交是指在质谱检测过程中，所有氘代且经胃蛋白酶消化的肽段不可避免地发生氘代丢失的现象。
在24小时氢/氘交换后，溶剂可及性最高的肽段（m/z = 1105.60）代表完全氘代区域。每种肽段掺入的氘原子数目，为氘代与非氘代Pak2胃蛋白酶肽段质心质量之间的差值。当Pak2进行24小时氢/氘交换时，选择m/z为1105的氘代程度最高的肽段作为完全氘代的代表。回交换比率通过24小时氢/氘交换时实际掺入的氘原子数除以m/z 1105肽段上所有可交换位点的总数计算得出。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作部分由美国国立卫生研究院资助项目 GM-26738（资助予 J.A.T.）支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| D2O | 西格玛-奥德里奇 | 7789-20-0 | |
| α-氰基-4-羟基肉桂酸 | 西格玛-奥德里奇 | 28166-41-8 | |
| MALDI-TOF | PE 生物系统公司 | Voyager DE STR | |
| Q-TOF 质谱仪 | Q-TOF Ultima-Global | ||
| QSTAR XL oMALDI MS/MS | 应用生物系统公司 | ||
| Data Explorer 4.0 计算机程序 | 应用生物系统公司 |
参考文献
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