培养的肌细胞作为模拟神经支配肌肉的模型存在不足 体内一个功能性的运动单位可以被复制 体外 通过大鼠胚胎脊髓外植体对分化的人原代肌细胞进行神经支配。本文描述了脊髓外植体与肌细胞共培养体系的建立方法。
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摘要
摘要
人原代肌细胞在无神经条件下单层培养时很少会自发收缩，因为缺乏神经成分，细胞分化受限，且缺少运动神经元的刺激1这些局限性阻碍了 体外 研究多种神经肌肉疾病在培养的肌肉细胞中的表现。重要的是，通过在共培养系统中利用脊髓外植体对肌纤维进行功能性神经支配，可以克服单层培养肌肉细胞的实验局限性。
在此，我们展示实现人原代肌细胞有效且适当神经支配所需的不同步骤，该方法可诱导肌细胞完全分化并出现纤维收缩，依据的是Askanas2建立的方法。具体操作是将肌细胞与妊娠13.5天（ED 13.5）大鼠胚胎的脊髓组织外植体共培养，背根神经节仍附着于脊髓切片上。数天后，肌纤维开始收缩，并通过来自脊髓外植体的功能性神经突与肌细胞连接，实现神经支配，最终形成横纹结构。通过定期更换培养基，该共培养体系可维持数月之久。
这种宝贵工具的应用十分广泛，因为它为人类肌肉发育和神经支配的多学科分析提供了一个功能性模型。事实上，在培养皿中可实现完全的从头神经肌肉接头组装，从而能够在基础且符合生理条件的环境中，对每个步骤的多种参数进行简便测量。
仅举几例，可直接在共培养体系中进行基因组学和/或蛋白质组学研究。此外，由于神经肌肉接头的突触前和突触后成分分别来源于不同物种（分别为大鼠和人类），因此可对这两部分的作用进行特异性且独立的评估。神经-肌肉共培养还可使用从患有肌肉或神经肌肉疾病患者中分离的人类肌细胞3进行，因此可作为候选药物的筛选工具。最后，仅需常规的BSL2实验室设施，无需特殊设备，即可在培养皿中重建功能性运动单位。因此，该方法在正常和疾病状态下，对肌肉及神经肌肉研究领域的科研人员开展神经肌肉功能的生理学和机制性研究均具有重要价值。
方案
1. 原代人肌肉细胞培养的制备
- 根据组织块-再组织块技术建立人肌肉细胞培养体系4。首先，从活检组织中去除非肌肉组织。然后，将1 mm3大小的肌肉组织块包埋于血浆凝块中，以允许成纤维细胞从组织块中迁移出来。
- 将包埋的组织块转移至经血浆-明胶包被的培养皿中，并在正常生长培养基（MEM添加25%的Medium 199、10%胎牛血清[FBS]、1%青霉素/链霉素、10 μg/ml胰岛素、10 ng/ml人表皮生长因子[EGF]、12.5 ng/ml人成纤维细胞生长因子[FGF]）中以单层形式培养。在此条件下从组织块中迁移出的细胞为肌肉细胞。去除组织块后，这些细胞将继续以单层形式生长。
- 在0.1%明胶包被的培养板上，使用正常生长培养基对细胞进行无神经培养。可根据需要对细胞进行无神经培养和扩增。建议使用第3至第8代的肌肉细胞进行共培养。关键在于需在肌管尚处于年轻阶段时进行神经支配；超过此阶段，共培养体系失败的风险显著增加。此外，肌管不应过大或过厚。
- 计划进行神经支配前两天，以每皿500,000个细胞的密度，将肌肉细胞接种于35 mm组织培养皿（或6孔板）中，使用正常生长培养基。在此密度下，细胞于次日可达到适宜融合的汇合度，并于再下一日进行神经支配。在此条件下，肌管将处于最适合神经支配的阶段，从而实现后续肌纤维的有效收缩。
- 次日，将正常生长培养基更换为融合培养基，该培养基由MEM添加25% Medium 199、5% FBS、10 μg/ml胰岛素及1%青霉素/链霉素组成。
2. 大鼠胚胎脊髓外植体的分离
在体视显微镜下，使用含10%胎牛血清（FBS）的汉克斯平衡盐溶液（HBSS，Gibco/Invitrogen，货号14170）进行脊髓组织块的分离全过程。
- 大鼠胚胎的发育阶段必须处于胚胎发育第13至14天之间，因为不同的发育阶段会危及整个实验操作。使用CO2处死怀孕雌鼠，并在HBSS培养基中取出完整的胚胎链。分离每个胚胎并将其断头以实施安乐死。
- 将胚胎脊髓从身体其余部分完整解剖下来，并去除周围的肌肉和结缔组织。操作时需格外小心，确保背根神经节（DRGs）仍附着在脊髓上，以保证功能性的神经支配。
- 将每段脊髓进行横向切片，使每个外植块至少包含2个附着的DRG（外植块大小约为1 mm3）。
3. 人肌细胞与胚胎大鼠脊髓外植体的神经支配
- 移除肌细胞培养中的融合培养基，仅在单层细胞上保留一层薄薄的培养基。
- 将组织块小心地放置在肌细胞层上，每个35 mm培养皿中均匀放置五个组织块。
- 缓慢逐滴加入融合培养基，每块组织上都要加。为保证肌细胞存活需要添加培养基，但初期不宜过多，以便组织块先附着并接触细胞。若添加方式不当（流速过快或量过多），组织块会漂浮，无法成功支配肌细胞。
- 待组织块开始附着后，将融合培养基补充至每个35 mm培养皿2 ml，并将培养皿极其小心地放回培养箱中。
4. 异源神经-肌肉共培养的维持
- 每周更换两次融合培养基。
5. 典型结果
在神经支配后的第2天，即可观察到神经突从每个外植体中延伸出来，并与肌细胞建立接触，这些接触表现为纽扣状结构（图1）。
在神经支配后的第4至6天，少数单个纤维便开始收缩。
这种收缩活动可持续数月，只需每周更换两次培养基即可维持。
大约2周后，脊髓外植体本身会发生退化，但神经支配得以保留。这是正常现象。一层细密的神经成分会停留在肌细胞层表面。这种神经网络足以维持运动单位的功能。
如果在神经支配后的第二天，外植体在培养基中漂浮，则其将无法贴壁。这种情况通常发生在肌细胞层未充分融合，或培养基添加过快时。有时外植体虽能贴壁，但无神经突长出，这可能是由于外植体上未附着背根神经节（DRG）。此种情况下，神经支配也无法建立。在培养的第一周内需极其小心地操作培养皿，因为外植体仍容易脱落。更换融合培养基时，应以极慢的速度逐滴加入液体，以避免细胞脱落。
图1. 脊髓外植体与肌细胞共培养，从第1天至第15天。
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讨论
生理的 体外 研究正常和病理条件下肌细胞功能的工具对肌病学研究者具有极高价值，因为肌细胞培养通常无法重现多种细胞及细胞类型间相互作用的重要性。将纯化的运动神经元添加至肌细胞中仍不足以形成功能性运动单位，因为有效的神经支配需要施万细胞的参与。5 并且在拓扑学上（三维结构及特殊分布）无相关性。本文所述方案已成功用于建立受神经支配的肌细胞 体外 并导致神经肌肉接头完全成熟，且易于评估。
目前已有多种神经肌肉疾病的啮齿类动物模型。然而，其中许多模型在向人类患者疾病转化方面存在局限性，例如脊髓性肌萎缩症、杜氏肌营养不良症或肌萎缩侧索硬化症的小鼠模型。脊髓性肌萎缩症是由SMN1基因突变引起的，这种突变在一定程度上可由人类基因组中第二个SMN基因的存在而缓解6。相比之下，小鼠基因组中仅含有一个SMN基因，其缺失会导致胚胎期致死7。因此，为了建立小鼠脊髓性肌萎缩症模型，研究人员将一个人源SMN2基因人工导入Smn基因敲除的小...
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披露
我们无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由瑞士国家科学基金会（SNF）、瑞士系统生物学计划（SystemsX.ch）、美国肌肉萎缩症协会（MDA）、法国肌肉疾病协会（AFM）、联合线粒体病基金会（UMDF）、格伯特-吕夫基金会罕见病项目（GRF）、瑞士肌肉疾病研究学会（SSEM/FSRMM）、瑞士人寿“全民健康与医学研究纪念基金会”、罗氏研究基金会以及巴塞尔大学资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14170 | |
| MEM | GIBCO, by Life Technologies | 31095 | |
| Medium 199 | GIBCO, by Life Technologies | 31153 | |
| 胎牛血清 | Fetal Clone Perbio | SH30066.03 | |
| 胰岛素 | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| 人表皮生长因子 | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| 人成纤维细胞生长因子 | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| 青霉素/链霉素溶液 | GIBCO, by Life Technologies | 15140 |
参考文献
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