一种新型荧光 原位 一种荧光原位杂交（FISH）方法，可在单次杂交反应中利用单一装置同时检测全部24条人类染色体的数目和结构异常，特别是与白血病和淋巴瘤相关的特异性染色体易位。
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方法文章
染色体组学：利用新型OctoChrome FISH检测技术同时检测全部24条人类染色体的数目与结构异常 染色体组学, 染色体异常, FISH检测, OctoChrome, 人类染色体, 数目变异, 结构重排, 分子细胞遗传学, 染色体分析, 荧光原位杂交
本文内容
摘要
摘要
荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH）是一种可在细胞核的有丝分裂中期或间期染色体上特异性检测DNA序列的技术1。该技术利用具有独特序列的DNA探针，与整条染色体或特定染色体区域发生杂交，是对经典细胞遗传学方法的有力补充。例如，许多早期研究通过经典细胞遗传学分析发现，在苯暴露的白血病患者、苯中毒患者以及接触苯的健康工人中，染色体畸变的发生频率显著升高2。而利用FISH技术，已在明显健康的苯暴露工人中观察到白血病特异性染色体改变的增加3-6，表明细胞遗传学改变在苯诱导的白血病发生中具有关键作用。
通常，单次FISH检测仅针对每张载玻片上的一个或少数几个完整染色体或特定基因位点，因此需要在多张载玻片上进行多次杂交，才能覆盖全部人类染色体。光谱核型分析（SKY）能够同时可视化整个基因组，但其对特殊软件和设备的要求限制了其应用7。本文中，我们描述了一种新型FISH检测方法——OctoChrome-FISH，可用于染色体组学（Chromosomics），我们将其定义为在人类研究中于单张载玻片上同时分析全部24条人类染色体，例如染色体组范围非整倍体研究（CWAS）8。该方法的基础是Cytocell公司以Chromoprobe Multiprobe System商品名销售的OctoChrome装置，该装置被划分为8个方格，每个方格携带三种不同的全染色体涂染探针（图1）。这三种探针分别直接标记了不同颜色的荧光素：绿色（FITC）、红色（Texas Red）和蓝色（Coumarin）。OctoChrome装置上染色体组合的排列设计有助于识别在最常见白血病和淋巴瘤中出现的非随机结构性染色体改变（易位），例如t(9;22)、t(15;17)、t(8;21)、t(14;18)9。此外，还可同时检测染色体的数目变化（非整倍体）。相应的模板载玻片同样被划分为8个方格，用于固定中期 spreads（图2），并置于OctoChrome装置之上。探针与靶DNA经高温变性后，在湿化 chamber 中进行杂交，随后即可同时观察全部24条人类染色体。
OctoChrome FISH 是一种有前景的技术，可用于白血病和淋巴瘤的临床诊断，以及所有染色体非整倍体的检测。我们已将这种新的Chromosomic方法应用于一项针对苯暴露的中国工人队列的CWAS研究8,10。
方案
1. 样本玻片制备
- OctoChrome FISH 旨在检测人类细胞中期分裂相中的染色体变化，适用样本包括但不限于培养的外周血细胞、干细胞/祖细胞及细胞系。样品应按照标准中期分裂相收获流程进行制备3,11-13：使用秋水仙胺处理使细胞停滞于中期，低渗处理使细胞膨胀，并用 Carnoy 固定液将细胞固定于悬浮液中，细胞浓度约为 0.5–1 × 106 个细胞/毫升。
- 将 8 方格载玻片（OctoChrome 试剂盒提供，目录号：PMP 803，Cytocell Ltd，英国剑桥，图 2）浸入纯乙醇中 2 分钟以清洁。
- 在制备样本载玻片前，先滴加少量细胞悬液至载玻片上检查细胞密度。若细胞密度过高（重叠细胞过多），则用新鲜固定液稀释悬液；若细胞密度过低（载玻片上细胞过少），则离心收集细胞并重悬于较小体积的新鲜固定液中。用移液器将 5–10 μl 细胞悬液依次滴加至模板载玻片的 8 个区域，顺序为交替的方格 1/7 - 2/8 - 3/5 - 4/6。待前两个方格自然干燥后，再以相同方式滴加剩余方格，以避免细胞铺展相互干扰。
- 干燥后的载玻片可在 -20°C 氮气环境中保存超过 5 年，再进行杂交实验。
2. 使用自动化系统定位中期细胞
- 在载玻片每半部分的中央加入 20 μl 的 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（0.2 μg/ml），然后加盖盖玻片。
- 使用 Metafer 软件（MetaSystems，Altlussheim，德国）对样本载玻片进行自动扫描，以定位中期细胞。此步骤有助于发现所有中期细胞，并便于日后对所有细胞图像进行重新评估。
- 手动查看扫描结果，并删除非中期细胞的伪影。
3. 杂交
- 样本玻片和OctoChrome装置的准备
- 将样本玻片在室温下浸入2x SSC缓冲液中30分钟，以洗去DAPI。
- 通过一系列乙醇洗涤（分别在70%、85%和100%乙醇中各2分钟）对样本玻片进行脱水，晾干后置于37°C加热板上5分钟。
- 将OctoChrome试剂盒中提供的Chromoprobe多重探针杂交室放入37°C水浴中，使其平衡至37°C（±1°C）。
- 通过反复吹打混合杂交液（来自OctoChrome试剂盒），并将每套OctoChrome装置所需的25 μl等分试样预热至37°C。
- 将每套OctoChrome装置（来自OctoChrome试剂盒，见图2）标签面朝下放置于加热板上，预热至37°C。切勿触碰OctoChrome装置的浮雕表面，因其含有探针。
- 将样本玻片定位在OctoChrome装置上方（图2）
- 当预热后的OctoChrome装置仍保持在37°C时，向其八个区域中的每一个加入2 μl预热的杂交液。
- 小心地将模板玻片倒置覆盖在OctoChrome装置上，使编号1（此时为倒置）位于OctoChrome装置的右上区域。为便于定位方格1，其在装置上的位置已用橙色标记。
- 确保模板玻片与OctoChrome装置上的对应区域精确对齐。小心地将玻片放下，使杂交液液滴与玻片接触。施加轻柔且均匀的压力，确保杂交液扩散至OctoChrome装置每个凸起区域的边缘。
- 提起玻片/OctoChrome装置，小心握住玻片的磨砂端，并将其翻转，使玻片位于OctoChrome装置下方。注意装置不要在模板玻片上滑动，以免导致探针交叉污染。
- 将其置于37°C（±1°C）加热板上10分钟。
- 变性
- 转移样本玻片/OctoChrome装置至加热板时需特别注意保持水平。确保样本玻片均匀接触加热板表面。
- 在75°C（±1°C）加热板上变性5分钟。
- 杂交
- 将样本玻片/OctoChrome装置放入Chromoprobe多重探针杂交室中。
- 盖上盖子，将杂交室漂浮于37°C（±1°C）水浴（非搅拌状态）中过夜。请注意：切勿密封杂交室的盖子；切勿密封水浴容器的盖子；切勿在培养箱中进行杂交。这些步骤对于控制湿度至关重要。
- 杂交后洗涤
- 洗涤液的配制
溶液1：准备一个含0.4x SSC的考普林瓶/赫伦达尔瓶。在水浴中平衡至72°C（±1°C），并调节pH至7.0。
溶液2：准备一个含2x SSC和0.05% Tween 20的考普林瓶/赫伦达尔瓶。室温静置备用。 - 小心地将OctoChrome装置从玻片上取下，将玻片放入溶液1中2分钟。
- 将玻片放入溶液2中30秒。
- 洗涤液的配制
4. 结果的封片与观察
- 在载玻片每半部分的中央加入 20 μl DAPI，并加盖盖玻片。
- 室温下避光孵育 10 分钟，然后通过荧光显微镜观察。
5. 代表性结果
图3A显示了2号方格中的一个正常中期细胞。（1）-（3）：染色体8、21和12分别用红色、绿色和蓝色标记，通过Texas Red、FITC和DEAC滤光片进行观察；（4）：通过DAPI/FITC/Texas Red三色滤光片观察。通常情况下，蓝色标记的染色体在三色滤光片下显示不清，需在特定的DEAC滤光片下观察。
图3B显示了具有白血病特异性染色体易位和非整倍体的代表性异常细胞。（1）：t(8;21)，急性髓系白血病中常见的染色体易位；（2）：21三体，即21号染色体有三个拷贝，是白血病中常见的非整倍体。
图1. OctoChrome装置上染色体组合的排列及预期的染色体涂染结果。
图2. 将样本载玻片置于OctoChrome装置上方的位置。
图3. OctoChrome FISH（方格2）获得的代表性结果。
图3A. 正常细胞，其中8、12、21号染色体在方格2中显示。
图3B. 2号方格中具有白血病特异性染色体易位和非整倍体的代表性异常细胞。
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讨论
这种新型的OctoChrome-FISH检测方法能够在一张载玻片上通过一次杂交同时检测全部24条人类染色体。8个方格中染色体组合的排列方式经过专门设计，有助于识别最常见白血病和淋巴瘤中的非随机性染色体重排。因此，该检测可同时发现染色体数目异常（非整倍体）和结构异常（易位）的改变。
该实验中最关键的步骤是在水浴中的漂浮室里进行过夜杂交时控制湿度。如果湿度过低，FISH 探针和杂交缓冲液容易干燥；如果湿度过高，则可能因吸收过多水分而过度稀释。这两种情况均可能对实验结果产生不利影响。为克服这一挑战，可采用的一种改进方法是用胶带将 OctoChrome 装置和样本载玻片密封，然后在 37°C 的加热板上避光过夜杂交。
存放时间过长的样本切片可能不适用于本实验直接使用。虽然用胃蛋白酶消化此类样本可改善杂交效果，但强烈建议将制备好的样本切片于-20°C氮气环境中保存，以尽量减少老化。
OctoChrome-FISH 是一种用于白血病和淋巴瘤临床诊断的有前景的技术。该技术还可用于检测...
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披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
作者感谢 Cliona M. McHale 博士对稿件的审阅和编辑。本研究由美国国立环境卫生科学研究所、美国国立卫生研究院资助，项目编号 R01ES017452，授予 L Zhang。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| OctoChrome 试剂盒 | Cytocell Ltd. | PMP 803 | |
| 植物血凝素（PHA） | Invitrogen | 10576-015 | |
| 秋水仙胺（Colcemid） | Invitrogen | 15212-012 | |
| 卡诺氏固定液（Carnoy’s fixative） | 甲醇 : 冰醋酸 = 3:1 | ||
| 荧光显微镜 | 配备可分别观察 DAPI、Texas Red、FITC 和香豆素光谱的滤光片，以及 DAPI/FITC/Texas Red 三色滤光片，用于同时观察不同荧光信号 | ||
| Metafer 软件 | MetaSystems, Altlussheim, 德国 | 有助于定位所有中期分裂相，并重新评估染色体异常 |
参考文献
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