人类蛋白质图谱中组织微阵列的制备、免疫组织化学染色及数字化

摘要

组织芯片提供了一种高效的方法，可同时获取大量组织的并行信息。将代表性组织区域组装到一个石蜡块中，从该石蜡块切片后用于免疫组织化学染色及蛋白质表达模式分析。通过数字扫描生成相应的图像，用于数据的分发与共享。

摘要

组织微阵列（TMA）技术为多种组织和细胞的高通量分析提供了手段。该技术被用于“人类蛋白质图谱”项目中，以对正常人体组织、癌症及细胞系中的蛋白质表达模式进行全局分析。本文介绍了将从显微镜下挑选的代表性组织中获取的1毫米组织芯，组装至单个受体TMA蜡块的过程。一个TMA蜡块中包含的组织芯数量和大小可灵活调整，范围大约从40个2毫米的组织芯到数百个0.6毫米的组织芯。使用TMA技术的优势在于，仅需一次免疫染色实验即可快速获得大量数据，从而避免实验间的变异性。更重要的是，该方法仅需极少量珍贵的组织样本，因而能够对大规模的患者队列进行分析^{1 2}。一个TMA蜡块可连续切出约250张切片（厚度为4 μm），用于免疫组织化学染色，以检测250种不同抗体的特异性蛋白质表达模式。在“人类蛋白质图谱”项目中，研究人员针对所有人源蛋白质生成抗体，并利用这些抗体获取来自144名个体的正常人体组织以及来自216名不同患者的癌症组织（涵盖20种最常见的人类癌症类型）中的相应蛋白质表达谱。经免疫组织化学染色的TMA切片被置于载玻片上并进行扫描，生成高分辨率图像，供病理学家解读并标注免疫组织化学结果。这些图像及其相应的基于病理学的注释数据，通过“人类蛋白质图谱”门户网站（www.proteinatlas.org）向科研界公开发布（图1）^{3 4}。“人类蛋白质图谱”提供了一幅图谱，展示蛋白质在人体内的分布及相对丰度。当前版本包含超过1100万张图像，涵盖了12,238种独特蛋白质的表达数据，对应人类基因组所编码蛋白质总数的61%以上。

方案

1. 如何为组织芯片制备准备组织（动画1）

1. 选择相关的福尔马林固定石蜡包埋材料（组织或细胞样本），包括相应的苏木精染色组织切片。
2. 在组织切片上标记相关区域。建议使用与石蜡块对应的 freshly cut 苏木精染色切片。
3. 设计用于组织芯片（TMA）制作的模板。在模板内对样本进行随机排列，以避免因技术问题（如抗体在整个TMA切片上的覆盖不均或切片问题）导致的假象。在模板中添加额外的定位标记以辅助定位。
4. 按照模板排列组织样本。

2. 手动组织芯片制备（拍摄必需）

1. 为获得标准化长度的组织芯，需在穿刺针芯上标记特定长度，例如 4.5 mm（图2）样品中心间距的指导原则：
   核心尺寸 0.6 mm – 0.8-1.0 mm
   核心尺寸 1.0 mm – 1.8-2.0 mm
   核心尺寸 1.5 mm – 2.0-3.0 mm
   核心尺寸 2.0 mm – 2.5-4.0 mm
   建议在石蜡包埋块的每侧保留2.5–3.0 mm的边缘，以避免石蜡开裂。
   
2. 1. 安装选定的冲孔工具。首先松开固定冲头的内六角螺钉。当冲头轮毂上的凹槽紧贴塑料V型块中的金属杆时，冲头即处于正确位置。拧紧螺钉，并确保金属夹边缘保持水平。
   2. 受体冲头（绿色和红色标记，特定于分配商）应置于左侧。供体冲头（绿色和蓝色标记，特定于分配商），其直径略大，应置于右侧。图3).
3. 1. 使用XY调节旋钮沿x轴和y轴移动冲头。右侧调节旋钮用于沿x轴移动冲头，左侧调节旋钮用于沿y轴移动冲头。
      两个调节旋钮上均配有数字千分表读数装置，旋转旋钮时可激活读数。
   2. 复位 → 按下 ZERO/ABS 按钮。
      在英寸和毫米之间切换 → 按下 IN/mm 按钮。
      使用1 mm打孔器制作9x8模板时，孔间距应为2.0 mm（以孔中心之间距离测量）。
4. 1. 为确保不会将穿孔针过度推入模块而撞击到包埋盒并损坏穿孔针，请将一个不含石蜡的包埋盒放入 holder 中，并通过调节 Z 向导左上角的深度限位螺丝，将受体穿孔针的底部位置设定在包埋盒底部上方 1 mm 处。图3).
   2. 将受体蜡块放入持架中，使用最小的螺丝刀拧紧螺丝。切勿过度拧紧，以免石蜡从包埋盒中松脱。
   3. 将受体打孔器向下推入受体模块约5 mm，然后利用打孔器上的手柄前后旋转一次图3）。当将冲孔器尽可能向下推入块体时，孔深为5 mm。
   4. 缓慢释放向下的推压力，使弹簧能够将冲头向上移动。使用穿刺针芯清空冲头，并丢弃石蜡核心。
5. 移动炮塔以切换至供体 punch（图3).
6. 将供体组织块连同供体块桥一起置于受体块夹持器上方（图3).
7. 1. 将取样针插入供体组织块的选定区域。使用相应的苏木精和伊红染色切片，根据已标记的兴趣区域定位待取样的组织。用左手手动固定供体组织块位置，右手推动取样针。注意不要用力按压针芯。由于深度限位装置无法在供体组织块的合适位置自动停止取样针的推进，因此当针芯上第二条刻度线可见时，应立即停止推进。
   2. 旋转打孔器手柄一周（图3). 缓慢释放向下的压力，同时继续将供体组织块固定在供体组织块桥上。
   3. 供体组织最好比受体组织芯短0.5 mm。此操作可确保受体蜡块表面组织芯的可调节对位，避免丢失有价值的代表性组织。
8. 移除桥接部分和供体组织块。确保供体打孔针与先前制备的孔位对齐（步骤4）。如果供体打孔针与受体组织块上的孔位未对齐，必须使用定位螺钉调整打孔针的位置。
9. 小心地将打孔针向下推进，直至其尖端到达受体块孔洞的顶部。保持此位置，使用针芯将组织芯推入孔中。组织芯的表面应与受体块表面齐平。
10. 将炮塔移回受体冲头。
11. 使用XY调节旋钮移动到下一个位置。
12. 重复上述第4c步，直至阵列构建完成。
13. 当完成整个受体蜡块后，松开受体蜡块夹具上的螺丝。将蜡块置于42 °C烘箱中加热40分钟。将蜡块切面朝下放置于载玻片上。将载有蜡块的载玻片置于试管架（或其他适当装置）上，再放入烘箱中。烘烤结束后，从烘箱中取出试管架，轻轻滑动载玻片以压平蜡块表面。
14. 将带有玻片的组织块置于冷却板上冷却10分钟。
    为确保组织芯片（TMA）中组织的代表性，需对每个50^th 进行切片。

3. 如何切片组织微阵列（动画 2）

1. 使用带有切片转移系统的切片机（HM 355S，Microm）切割 4 μm 厚的切片。该系统可与所有现有的旋转式切片机配合使用。系统由集成转移桥的刀片架、加热的水浴槽和控制单元组成。切片从刀片上通过转移桥沿湿润的转移表面滑入水浴槽中。
2. 切片在水中充分伸展后应立即从水浴中取出，以避免敏感组织区域（如富含脂质的乳腺和脑组织）发生融化。将切片转移至防脱载玻片（superfrost 玻片）上。切片在水中停留的时间取决于所使用的石蜡类型和水温。本实验室使用 HistoLab Products AB 的石蜡，其熔点为 56–58 °C，建议水浴温度为 37–39 °C。
3. 将载玻片置于载玻片架中，在室温（RT）下过夜干燥。
4. 将载玻片在 50 °C 下烘烤 12–24 小时。若使用无 STS 系统的切片机，则需借助毛刷等工具手动将切片从刀片转移至水浴中。

4. 免疫组织化学检测与滴定程序（动画 3）

每种抗体均采用专门设计的组织芯片（TMA）进行标准化测试，这些芯片包含多种组织和不同类型的细胞。目的是为每种抗体评估个体化且优化的免疫染色方案。首先根据一抗的储存浓度选择一个稀释比例进行测试。该初步染色结果将用于指导后续的稀释梯度设置及实验方案的优化。

1. 免疫染色前，需使用二甲苯和梯度乙醇进行脱蜡和水化处理，最终至蒸馏水中。
2. 使用含0.3% H₂O₂的95%乙醇溶液孵育5分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性。
3. 采用pH 6的修复缓冲液进行热诱导表位修复（HIER），以压力锅（Decloaking chamber, Biocare Medical）作为热源，在125 °C下处理4分钟。煮沸完成后，载玻片保留在压力锅中自然冷却至90 °C。HIER的总处理时间约为45分钟。
4. 若初次检测未能获得明确结果，则根据观察到的染色模式进一步开展其他检测^{5 6}。在人类蛋白质图谱（HPA）高通量实验体系中的一项预实验表明，最有效的抗原修复方法为HIER pH 6，但当然也可采用其他修复方式，如蛋白酶预孵育、微波处理或在pH更高或更低的缓冲液中煮沸。通过调整免疫组化条件，例如改变一抗孵育时间、抗体稀释比例以及二氨基联苯胺（DAB）孵育时间，可获得更具诊断意义的染色结果。

5. 染色程序，Autostainer 480（Thermo Fisher Scientific）

所有孵育步骤均在室温下进行，本方案也可使用相同试剂手动操作。

1. 用洗涤缓冲液冲洗。
2. 加入Ultra V封闭液，孵育5分钟。
3. 用洗涤缓冲液冲洗。
4. 加入一抗，孵育30分钟。
5. 用洗涤缓冲液冲洗（重复两次）。
6. 加入标记的辣根过氧化物酶聚合物，孵育30分钟。
7. 用洗涤缓冲液冲洗（重复两次）。
8. 用DAB溶液显色10分钟。
9. 用洗涤缓冲液冲洗（重复两次）。
10. 用Mayers苏木精复染5分钟*。当使用渐进性染色法（如Mayers苏木精）时，染色强度取决于时间，无需进行分化处理。而使用退行性染色法（如Harris苏木精）时，则需进行分化处理，以去除组织中多余的染料，从而突出目标结构。
11. 用自来水冲洗*。
12. 用饱和溶液稀释1:5的碳酸锂水溶液冲洗1分钟*。
13. 用自来水冲洗5分钟*。
14. 切片经梯度乙醇脱水，并用中性树胶（PERTEX, Histolab）封片。

所有试剂均以每张载玻片300 μl的体积加入。
* 步骤10-14在组织染色仪（Autostainer XL，Leica）中进行，封片步骤 additionally 在封片系统（Automated glass coverslipper CV5030，Leica）中完成。

6. 如何扫描载玻片

扫描玻片的方法取决于所使用的数字扫描仪，本方案仅定义如何使用 Aperio XT（Aperio Technologies）自动扫描系统扫描玻片。在人类蛋白质图谱（Human Protein Atlas）的设置中，组织采用 20 倍放大，细胞采用 40 倍放大。由于组织的异质性以及组织微阵列（TMA）中包含的不同组织种类较多，自动扫描可能会遇到聚焦问题。

1. 清除玻片上的污物和胶水，并检查盖玻片与组织切片之间是否存在气泡。若存在气泡，需重新封片。
2. 将玻片放入支架中，并将支架置于数字扫描仪内。以20倍放大倍率扫描组织芯片（TMA）所需时间约为6分钟。使用Aperio公司的软件选择感兴趣区域。对焦点由软件自动选定，也可手动选择扫描区域和对焦点。
3. 图像生成后，可用于评估和标注免疫组化（IHC）染色结果。图像作为实验结果文件保存，可分享给同事用于讨论，并可用于后续数据发表。图像可通过Aperio公司提供的免费软件进行查看。

7. 如何在人类蛋白质图谱中搜索您感兴趣的蛋白质

1. 访问 www.proteinatlas.org。
2. 输入您感兴趣的蛋白质名称、Ensembl ID、UniProt 登录号或 HGNC 名称，例如胰岛素（insulin）。
3. 进入摘要页面，向下滚动至“正常组织与器官摘要”部分。该概览显示该蛋白质在胰腺中的表达情况。
4. 点击“更多组织数据”，进入正常组织视图，在此可查看按器官分类的所有包含的组织数据。
5. 点击胰腺以查看针对同一蛋白质的三种抗体的免疫组化（IHC）结果。如需查看胰腺的高分辨率图像，请点击相应图像。
6. 有关该蛋白质在癌组织、细胞中的表达情况以及人类蛋白质图谱中的进一步验证数据，可通过浏览人类蛋白质图谱（Human Protein Atlas）网站获取。

8. 代表性结果

动画 1. 如何制备组织微阵列生产所需的组织。 点击此处查看动画 1。

动画 2. 如何切片组织微阵列（TMA）。点击此处查看动画 2。

动画 3. 此处介绍了免疫组织化学技术。点击此处查看动画 3。

图 1. 人类蛋白质图谱乌普萨拉中心内整个流程的总体示意图。

图 2. 供体穿刺针芯标记出组织芯的标准长度，例如 4.5 mm。

图 3. 手动组织芯片仪。

图 4. 不同质量的组织微阵列（TMA）示例。（A）一个笔直且排列整齐的TMA，行与列之间以及与石蜡边缘之间均有足够的间距。（B）一个部分芯样过于靠近边缘的TMA，可能导致切片时出现困难。（C）一个烘烤时间过长的TMA，导致结构塌陷，失去正确的模板形态。

图 5. 经苏木精和伊红染色的组织微阵列。（A）切片良好，行列整齐对齐的切片。（B）使用劣质或污染的刀片可能导致切片分裂，（C）或切片压缩。

图6. 抗体滴定。（A）淋巴结中的生发中心细胞显示经优化滴定的抗体，产生特异性的胞质染色（呈棕色），无背景染色。（B）该组织切片显示染色较弱。当一抗浓度过低，或靶蛋白在免疫染色组织中不存在时，会出现阴性或弱染色。（C）该组织切片因使用了一抗过高浓度而导致过度染色。深色染色导致因溢出、交叉反应和假阳性而难以确定亚细胞定位。

讨论

免疫组织化学是目前组织芯片（TMA）应用最为广泛的技术。将免疫组织化学与组织芯片相结合，可用于多种不同场景，例如对组织^{7 8}和细胞^{9 10}中蛋白质表达模式的高通量筛选、基于大样本量患者队列组织样本的生物标志物发现研究^{11 12}，以及更基础的肿瘤生物学研究，包括不同表型/基因型、分化阶段、进展过程及转移机制等¹³。使用组织芯片的一个优势在于，可同时分析来自大样本队列的组织材料，既节省了宝贵的生物样本，又提高了实验的可重复性。此外，组织芯片技术还能显著降低试剂成本和实验室处理时间。由于组织芯片所含组织量有限，组织异质性成为一个需要关注的问题。根据组织类型及研究目的的不同，可能需要从同一标本中取多个样本。对于肿瘤组织，建议每个标本取2至4个组织芯，因为已有研究表明，这种做法能够高度准确地代表整张组织切片的特征^{13 14}。根据组织构成的不同，打孔直径（范围从0.6 mm到2 mm）可作相应调整。组织结构复杂，包含多种不同类型的细胞、结构以及细胞外基质。每种不同类型组织的组成成分（如脂肪、血管、结缔组织、软骨等含量各异）会影响打孔和获取独立组织芯所需的压力。因此，在利用具有明确研究目的的组织制备正式的组织芯片之前，务必先使用无研究价值的材料对操作流程中的各个步骤进行充分练习。

在同一个组织芯片（TMA）蜡块中包埋多种不同组织时，蜡块的组成可能会影响获得高质量切片的能力。某些组织（如皮肤、骨髓、脂肪、脑和乳腺）由于质地差异，会影响切片在水浴中展开的程度以及刀片切割时的难易程度，从而导致TMA蜡块切片困难。因此，建议在可行的情况下，将具有相似特征的组织（例如富含脂质的组织）归入同一个TMA中。大多数癌组织在此方面具有较高的均一性，有利于癌症TMA的切片。当处理包含多种异质性组织类型的TMA时，可采用一种替代切片方法以稳定芯片中的组织微柱。使用粘附胶带有助于防止组织微柱丢失或脱落。但使用胶带时需谨慎，因为胶带可能影响切片微柱的厚度，进而影响免疫组化（IHC）染色的结果¹⁵。在人类蛋白质图谱（Human Protein Atlas）的实验设置中，采用9×8（不含标记位点）的TMA排列模板。为获得尽可能多的切片并确保蜡块中所有组织在整个切片过程中均被保留，通常在一张玻片上放置两个切片，从而实现最大9×8的排列模板，以节省试剂和扫描时间。

蛋白质信息的主要数据库——通用蛋白质资源¹⁶包含约20,300条经过审阅的人类蛋白质条目，其中仅有约66%具有蛋白质水平的实验证据。此外，对于大多数在蛋白质水平上已有存在证据的基因，其蛋白质功能及表达分布的信息仍十分有限或缺失。未来的一个重要挑战是分析这些未知蛋白质在各类人体组织中的分布模式和相对丰度。可利用Uniprot、ENSEMBL等数据库以及PubMed中已发表的数据作为指导，判断针对未知蛋白质的抗体在免疫组织化学染色中所呈现的染色模式是否真实反映了目标蛋白质的实际表达谱。此外，还需采用多种其他验证策略以确保抗体的功能性，例如在蛋白质芯片、Western印迹、免疫荧光、免疫沉淀和下拉实验中验证抗体的功能性。其中，验证抗体功能性的最重要工具之一可能是使用配对抗体，即针对同一目标蛋白质上两个不同且不重叠的表位所产生的两种不同抗体，比较其在特定检测中的结果一致性¹⁷。

根据汇总的信息，抗体的检测和滴定遵循免疫组化（IHC）标准，并结合了人类蛋白质图谱项目中对超过35,000种抗体进行测试与验证的经验。对于超过20%的具有蛋白质表达谱的基因，已采用成对抗体（即针对同一蛋白质上非重叠表位的两种或多种抗体）的数据，以确定相应蛋白质表达模式的最佳估计值。成对抗体为验证基于免疫组化的特异性蛋白质表达模式提供了最可靠的策略。该策略具有重要价值，因为在基础筛选中包含大量不同组织，增加了交叉反应的风险。还应注意，某些组织通常更容易出现背景染色，例如巨噬细胞、平滑肌、肾脏的远端小管以及肝脏中的肝细胞。其他需要考虑的问题包括：对来自存档材料的组织，其组织处理技术随时间可能发生的变化，这可能导致免疫组化出现假阴性或不适当的阳性染色结果。这一现象在大组织切片分析中同样存在。阴性对照和阳性对照均至关重要，应尽可能使用。对于包含功能分析的深入研究，可利用相应转录本强制表达或特异性敲低（siRNA技术）的细胞系来构建对照。为了在免疫组化中获得最佳结果，测试并使用抗原修复系统十分关键，因为甲醛固定会引发多种化学修饰，例如交联反应以及席夫碱的水解，从而掩盖抗原表位¹⁸。

综上所述，采用组织微阵列（TMA）技术和免疫组化（IHC）的基于抗体的蛋白质组学是一种大规模生成蛋白质表达数据的强大策略。人类蛋白质图谱计划旨在建立正常人体组织和癌症中人类蛋白质表达的图谱。该计划的目标是在2015年前发布综合性人类蛋白质图谱的初步草图。除了提供正常器官和组织中的蛋白质表达谱外，这一工作还为包括临床生物标志物发现在内的生物医学研究项目提供了起点。最终目标是在人类基因组序列的基础上增加一层新的信息，这对于深入理解各种疾病状态背后的生物学机制至关重要，并为开发新型诊断和治疗工具奠定基础。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
洗涤缓冲液	Thermo Fisher Scientific, Inc.	TA-999-TT
柠檬酸盐缓冲液 pH6	Thermo Fisher Scientific, Inc.	TA-250-Pm1X
抗体稀释液	Thermo Fisher Scientific, Inc.	TA-125-UD
UltraVision LP HRP 聚合物	Thermo Fisher Scientific, Inc.	TL-125-HL
DAB Plus 底物系统	Thermo Fisher Scientific, Inc.	TA-125-HDX
Ultra V 封闭剂	Thermo Fisher Scientific, Inc.	TA-125-UB
一抗增强剂	Thermo Fisher Scientific, Inc.	TL-125-PB
迈耶苏木精	Histolab	01820
PERTEX	Histolab	00871.0500
手动组织芯片仪	Estigen, Beecher Instrument	MTA-1
瀑布式切片机	Thermo Fisher Scientific, Inc.	Microm HM 355S
全自动图像扫描仪	Aperio Technologies	XT
全自动切片染色系统	Thermo Fisher Scientific, Inc.	Autostainer 480S-2D
用于脱蜡和脱水的全自动切片染色系统	Leica Microsystems	Autostainer XL
全自动玻片封片机	Leica Microsystems	CV5030
去封闭室	Biocare Medical	DC2008INTEL