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神经元形态发生研究方法 离体 胚胎小鼠大脑皮层中的RNAi电穿孔技术

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DOI：

10.3791/3621

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2012年5月18日

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1Department of Molecular, Cellular Biology and Biochemistry, Brown University , 2Institute for Brain Science, Brown University , 3Department of Psychiatry and Human Behavior, Warren Alpert School of Medicine, Brown University

本文内容

摘要

为了快速评估基因在大脑皮层发育过程中的功能，我们描述了涉及以下内容的方法 离体 在小鼠胚胎皮层中电穿孔导入共表达抑制性RNA（RNAi）和GFP的质粒。该方案适用于研究神经发育的多个方面，包括神经发生、神经元迁移以及神经元形态发生（如树突和轴突的生长）。

摘要

大脑皮层负责调控高级认知功能。这种六层结构以“由内向外”的方式形成，即最早生成的神经元靠近脑室，而随后生成的神经元则迁移越过早期神经元，向大脑表面移动1。除了神经元迁移2之外，调控神经元形态发生是维持正常皮层功能的关键过程之一3。尽管神经元形态发生可在原代培养细胞中进行体外（in vitro）研究，但这些过程在组织环境中的调控机制仍有待深入探索。

我们描述了在大脑皮层器官型切片中分析神经元迁移和/或形态发生的技术4,6使用一种经过修饰的pSilencer载体，该载体包含一个由U6启动子驱动双链发夹RNA的表达单元，以及另一个由CMV启动子驱动GFP蛋白表达的独立表达盒。7-9我们的方法能够快速评估候选基因特异性敲降后神经突生长缺陷，并已成功应用于神经突生长调控因子的筛选。8由于仅有部分细胞会表达RNAi载体，该类器官型切片可实现对潜在表型的嵌合体分析。此外，由于该分析是在接近真实 体内 环境，它为功能未知的皮层基因提供了一种低成本且快速的转基因或基因敲除动物制备替代方案。最后，与 体内 电穿孔技术，其成功与否取决于 离体 电穿孔实验不依赖于熟练的手术技能培养，可在较短的培训时间和较低的技术要求下完成。

方案

1. 准备培养液和培养基（视频中未包含）

  1. 配制1升含1×HBSS、2.5 mM Hepes（pH 7.4）、30 mM D-葡萄糖、1 mM CaCl2、1 mM MgSO4和4 mM NaHCO3的完全Hank's平衡盐溶液（HBSS）。加入双蒸水（ddH2O），用0.2-μm滤器过滤除菌，4 °C保存。
  2. 使用35 mL基础Eagle培养基（Basal Medium Eagle media）、12.9 mL完全HBSS、20 mM D-葡萄糖（1.35 mL 1 M溶液）、1 mM Glutamax（0.25 mL 200 mM溶液）和0.5 mL青霉素-链霉素100×储备液配制切片培养基。用0.2-μm滤器过滤除菌，然后加入热灭活马血清至终浓度为5%。
  3. 用无菌去离子水配制1 mg/mL层粘连蛋白（Laminin）储备液，制备100 μL分装液于0.5 mL离心管中，-80 °C冻存。
  4. 将5 mg聚-L-赖氨酸溶于5 mL无菌H2O中，配制成1 mg/mL的储备液，分装为1 mL每份，-20 °C冻存。
  5. 使用无菌水将1 mL聚-L-赖氨酸和100 μL层粘连蛋白稀释至终体积12 mL，配制包被溶液。每次使用前新鲜配制。

2. 准备器官型切片插件（不在视频....

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讨论

这些涉及的方法 离体 质粒电穿孔转染编码双链RNA发夹结构 8 并进行器官型切片的培养4 具有多项显著优势。首先，这些方法能够快速评估由RNAi产生的表型。在同一pSilencer载体中包含由U6启动子驱动双链RNA发夹结构的同时，还整合了编码GFP的表达盒，从而可快速识别并鉴定成功转染RNAi载体的电穿孔细胞。除了节省时间外，与构建多个基因敲除细胞系相比，该方法还具有极高的成本效益。其次，与存活电穿孔技术相比12 这需要更长的训练和技能培养，以确保动物存活和电穿孔实验的成功；而本文所述方法可在较短的培训时间内完成，且对操作技能要求较低。 体内 生存手术还存在一定的基础失败率，可能与动物（母体和幼崽）的发病率相关。这些动物通常需要由动物设施中具备相应技能的工作人员和/或兽医进行评估。第三，由于这些样本培养时间可长达5天或更久 体外它们使我们能够研究与神经元增殖、细胞命运决定、神经元迁移以及神经元早期成熟阶段（神经突起生长）相关的多种科学问题。第四，由于我们在体外培养体系中进行操作，因此可以添加外源性因子，以检测生长因子.......

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披露

我们没有需要披露的内容。

致谢

我们感谢 Shirin Bonni 博士提供 pSil-GFP 载体，Alper Uzun 博士为图1提供的示意图，以及 Leduc 生物成像中心在共聚焦显微镜方面的支持。EMM 获得伯纳德·马歇尔·韦尔科姆基金会（Burroughs Wellcome Fund）医学科学职业奖、NARSAD 青年研究者奖以及美国国立卫生研究院（NIH）国家研究中心资源中心（NCRR）COBRE 项目 P20 RR018728-01 的资助。SBL 由 NIH NCRR COBRE P20 RR018728-01 项目支持，并获得 PHS NRSA 5T32MH019118-20 项目的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
汉密尔顿注射器 Hamilton Co8000831 号针头，0.5 英寸长，PT-4（针尖斜面等级），10μl 容量
铂金镊子电极BTX Technologies45-0489 5 mm 规格
ECM830 电穿孔仪BTX Technologies45-0002
BTX 脚踏开关BTX Technologies45-0208与 ECM830 电穿孔仪配合使用
振动切片机Leica MicrosystemsVT1000 S
6 孔板（用于插入式培养插件）Falcon BD353502带缺口，可匹配插入式培养插件
组织培养插入式插件Falcon BD3530900.4 微米孔径
快绿染料Sigma-AldrichF7252
低熔点琼脂糖Fisher ScientificBP165-25DNA 级别
层粘连蛋白Sigma-AldrichL2020
聚-L-赖氨酸Sigma-AldrichP5899
基础伊格尔培养基Sigma-AldrichB-1522
不含钙和镁的 10 倍 HBSS 溶液GIBCO, by Life Technologies14180-046
HEPES 游离酸Sigma-AldrichH4034

参考文献

  1. Angevine, J. B. Jr, Sidman, R. L. Autoradiographic study of cell migration during histogenesis of cerebral cortex in the mouse. Nature. 192, 766-766 (1961).
  2. Kriegstein, A. R., Noctor, S. C. Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex. Trends Neurosci....

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标签

RNAi GFP

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