为了快速评估基因在大脑皮层发育过程中的功能，我们描述了涉及以下内容的方法 离体 在小鼠胚胎皮层中电穿孔导入共表达抑制性RNA（RNAi）和GFP的质粒。该方案适用于研究神经发育的多个方面，包括神经发生、神经元迁移以及神经元形态发生（如树突和轴突的生长）。
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摘要
摘要
大脑皮层负责调控高级认知功能。这种六层结构以“由内向外”的方式形成，即最早生成的神经元靠近脑室，而随后生成的神经元则迁移越过早期神经元，向大脑表面移动1。除了神经元迁移2之外，调控神经元形态发生是维持正常皮层功能的关键过程之一3。尽管神经元形态发生可在原代培养细胞中进行体外（in vitro）研究，但这些过程在组织环境中的调控机制仍有待深入探索。
我们描述了在大脑皮层器官型切片中分析神经元迁移和/或形态发生的技术4,6使用一种经过修饰的pSilencer载体，该载体包含一个由U6启动子驱动双链发夹RNA的表达单元，以及另一个由CMV启动子驱动GFP蛋白表达的独立表达盒。7-9我们的方法能够快速评估候选基因特异性敲降后神经突生长缺陷，并已成功应用于神经突生长调控因子的筛选。8由于仅有部分细胞会表达RNAi载体，该类器官型切片可实现对潜在表型的嵌合体分析。此外，由于该分析是在接近真实 体内 环境，它为功能未知的皮层基因提供了一种低成本且快速的转基因或基因敲除动物制备替代方案。最后，与 体内 电穿孔技术，其成功与否取决于 离体 电穿孔实验不依赖于熟练的手术技能培养，可在较短的培训时间和较低的技术要求下完成。
方案
1. 准备培养液和培养基（视频中未包含）
- 配制1升含1×HBSS、2.5 mM Hepes（pH 7.4）、30 mM D-葡萄糖、1 mM CaCl2、1 mM MgSO4和4 mM NaHCO3的完全Hank's平衡盐溶液（HBSS）。加入双蒸水（ddH2O），用0.2-μm滤器过滤除菌，4 °C保存。
- 使用35 mL基础Eagle培养基（Basal Medium Eagle media）、12.9 mL完全HBSS、20 mM D-葡萄糖（1.35 mL 1 M溶液）、1 mM Glutamax（0.25 mL 200 mM溶液）和0.5 mL青霉素-链霉素100×储备液配制切片培养基。用0.2-μm滤器过滤除菌，然后加入热灭活马血清至终浓度为5%。
- 用无菌去离子水配制1 mg/mL层粘连蛋白（Laminin）储备液，制备100 μL分装液于0.5 mL离心管中，-80 °C冻存。
- 将5 mg聚-L-赖氨酸溶于5 mL无菌H2O中，配制成1 mg/mL的储备液，分装为1 mL每份，-20 °C冻存。
- 使用无菌水将1 mL聚-L-赖氨酸和100 μL层粘连蛋白稀释至终体积12 mL，配制包被溶液。每次使用前新鲜配制。
2. 准备器官型切片插件（不在视频中）
- 使用无菌镊子将两个六孔板分别装入一个培养插件，并在培养插件下方加入 2 mL 无菌 ddH2O。
- 小心地将 1 mL 包被液加至膜表面，注意避免刺破膜。在 37 °C、5% CO2 的湿化培养箱中孵育过夜。
- 去除包被液，用无菌 H2O 洗涤膜三次。让插件干燥后备用。加入 1.8 mL 组织切片培养基，置于 37 °C 培养箱中。将未使用的板用封口膜包裹，于 4 °C 保存，最长可保存 4 周。
3. 电穿孔前的准备（视频中未包含）
- 准备用于电穿孔的RNAi载体。将双链RNA发夹结构插入片段克隆至pSilencer载体中。该质粒包含：1）由U6启动子驱动双链RNA的生成；2）由CMV启动子驱动的GFP表达盒8,9。该质粒此前已被Konishi及其同事9以及其他研究者7,8报道过。质粒使用Qiagen大提试剂盒进行纯化，并以1 mg/mL的浓度使用。
- 为在注射过程中可视化DNA，配制0.5%的快绿染料溶液，并以1:20的比例与待注射的DNA混合使用（通常为20 μL DNA加入1 μL快绿）。剩余的DNA-快绿染料混合液可于-20 °C保存，最多可保存一周。
- 使用70%乙醇清洁解剖区域、解剖工具及振动切片机容器。将完全配制的HBSS冷却至冰冻状态。通过在振动切片机内用冰块包围容器并加入少量水以实现快速降温，从而冷却振动切片机容器。使用完全配制的HBSS配制3%低熔点琼脂糖，微波加热1分钟，避免过度沸腾。使用前置于42 °C水浴中保温。
- 电穿孔参数设置如下：对于E15胚胎，使用35 V电压，5次脉冲，每次脉冲持续100 ms，脉冲间隔900 ms。对于较年长的动物，为确保电穿孔效率，可使用高达50 V的电压，或将脉冲次数增加至8次。对于较年轻的动物，为防止组织损伤，可减少脉冲次数至最多2次，并降低电压至最多25 V。这些参数可根据动物年龄进行调整，并通过实验经验确定。
4. 解剖与电穿孔（视频中）
- 处死怀孕雌鼠后，将胚胎分离至冰上预冷的完全HBSS溶液中。每个胚胎需保留在其独立的胎盘囊内。
- 从胎盘囊中取出胚胎，于第一椎骨后方切断头部，并继续置于冰上预冷的完全HBSS溶液中。
- 进行注射时，将头部置于培养皿中的Parafilm膜上。使用定制的Hamilton注射器（见表 I），将约6至8 μL的DNA与快绿染料混合液经由第三脑室注入，以填充皮质泡中的两个侧脑室。也可选择直接向每个侧脑室分别注射。
- 进行ex vivo电穿孔时，使用BTX镊状铂电极。将正极电极置于拟电穿孔的皮层一侧，例如若需转染背侧皮层，则将正极置于头部顶端。
- 电穿孔完成后，将头部置于冰上孵育至少5分钟，再进行后续解剖操作。
- 在冰上预冷的HBSS溶液中解剖脑组织：先在头部侧面做一小切口，剥离头部两侧皮肤；随后用精细镊子轻轻剥离脑表面的软脑膜。小心从颅骨中取出完整脑组织，注意避免损伤皮层。
5. 电穿孔皮层的包埋与切片（视频中）
- 将3%低熔点琼脂糖转移至置于冰上的大模具中。模具底部会较快开始凝固，从而防止脑组织沉入模具底部。用Kimwipe纸或滤纸吸去多余缓冲液后，用精细镊子逐个轻柔转移脑组织。使用10 μL移液器吸头在模具内轻轻搅动脑组织，以确保琼脂糖与脑组织之间达到最大接触面积。
- 调整脑组织的方向，确保所有脑组织在琼脂糖中的朝向一致且处于相近水平位置。让琼脂糖静置约5分钟使其完全凝固。使用粘合胶（万能胶）将琼脂糖块固定，使嗅球朝上直立。琼脂糖块固定后，立即加入冰冻HBSS，并修整琼脂糖，确保每个脑组织可获得独立的切片。
- 进行切片时，将振动切片机的速度设为低速（约为最大值的一半），并将刀片振动频率设为最高。制备厚度为250-μm的冠状切片。使用弯曲的精细铲刀收集切片，并用细毛刷或镊子将其转移至组织培养板孔中。
- 在组织培养超净台内，将切片转移至包被过的插入式培养小室中。每个小室加入500 μL切片培养基，以方便转移操作。每个小室最多可放置5片切片。去除切片表面多余的培养基后，置于37 °C恒温湿润培养箱中孵育。
6. 器官型切片的培养与分析（视频中）
- 为了保持切片的健康状态，应每隔一天至少更换一次膜下方的培养基，每次更换一半的培养基。
- 为了在培养所需天数后分析切片，需将切片固定在膜上。用37 °C的1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤三次，每次10分钟。接着在4 °C下用4%多聚甲醛（PFA）固定过夜，或在室温下固定1小时。
- 可使用不同的细胞标记物对切片进行分析，或仅用Hoechst染色以区分电转染和非电转染的细胞。在室温下用含10%山羊血清和0.1% Triton的1× PBS轻柔振荡孵育2小时，以对切片进行通透和封闭处理。
- 在室温下用Hoechst染色1小时，然后用1× PBS轻柔振荡洗涤三次，每次10分钟。
- 为封片，用手术刀将膜切下，用精细镊子将含有切片的膜转移至水浴室中的磨砂玻片上。每张玻片最多可放置5个切片。去除多余水分后，向每个脑切片滴加一滴Fluoromount封片液。轻轻盖上盖玻片，并除去所有气泡。使用共聚焦显微镜观察切片。
7. 类器官切片的替代性石蜡包埋法（视频中未包含）
- 也可将组织切片包埋于石蜡中，以进行更精细的形态学分析。为此，可将含有组织切片的膜按照上述方法用4%多聚甲醛（PFA）固定。
- 固定后的切片嵌入预热至37 °C的1%琼脂糖中，并在冰上凝固30分钟。随后可将琼脂糖块在4 °C条件下用4% PFA再固定30分钟。
- 含有组织切片的琼脂糖块随后将被包埋于石蜡中，并按照先前所述方法进行免疫荧光处理10。
8. 代表性结果
小鼠大脑皮层电穿孔及脑片组织培养的示意图见图1。该方法是快速评估参与神经元发育相关基因功能的有效策略11。根据电穿孔时DNA的用量以及胚胎所处的发育阶段，转染效率会有所差异。电穿孔后至少8小时，脑片开始表达GFP，细胞在培养过程中将经历正常的神经发生过程（包括增殖、迁移和早期神经元分化）。图2展示了一张电穿孔后表达对照质粒pSilencer-GFP的脑片，可见其中包含神经前体细胞、迁移中的神经元以及已分化的神经元。只要脑片在膜上维持良好的培养基-空气界面，其形态结构可长期保持，在培养中至少可使用5天。
图1. 示意图 离体 电穿孔与器官型脑片培养实验 E14.5 胚胎被分离出来，每个胚胎单独注射与快绿染料混合的 DNA，以便观察注射部位。DNA 可注射至侧脑室（如图所示），也可注射至第三脑室以填充侧脑室。注射后，使用方波电穿孔仪对脑组织进行电穿孔，正极电极置于脑部目标侧。脑组织包埋于 3% 低熔点琼脂糖中，使用振动切片机进行切片。 250 μm 脑切片置于 0.4 μm 插入物并培养长达一周。转染后8小时即可观察到GFP。
图 2. 电穿孔脑切片的分析。 电穿孔后的脑切片经Hoescht染色。背侧皮层显示位于脑室区（vz）的电穿孔神经前体细胞。皮层板（cp）中的神经元由边缘区（mz）界定。白色箭头指示迁移中的神经元。本实验中，胚胎在E15.5时期注射并电穿孔转入pSilencer GFP对照载体。切片为电穿孔后4天的皮层外植体。比例尺：100 μm。
问题排查：
- 转染效率低：将所用DNA的浓度调整至至少1 μg/μL。务必使用高纯度DNA，必要时可采用无内毒素的Quiagen试剂盒进行DNA纯化。
- 细胞在非目标脑区被转染：确保电极位置正确，正极应朝向需要进行电穿孔的脑区一侧。
- 组织切片形态退化：每天更换培养基，并确保切片未漂浮在培养基中。
- 在振动切片机中切割时切片从琼脂糖上脱落：包埋脑组织于低熔点琼脂糖时，应确保形成良好的界面。
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讨论
这些涉及的方法 离体 质粒电穿孔转染编码双链RNA发夹结构 8 并进行器官型切片的培养4 具有多项显著优势。首先，这些方法能够快速评估由RNAi产生的表型。在同一pSilencer载体中包含由U6启动子驱动双链RNA发夹结构的同时，还整合了编码GFP的表达盒，从而可快速识别并鉴定成功转染RNAi载体的电穿孔细胞。除了节省时间外，与构建多个基因敲除细胞系相比，该方法还具有极高的成本效益。其次，与存活电穿孔技术相比12 这需要更长的训练和技能培养，以确保动物存活和电穿孔实验的成功；而本文所述方法可在较短的培训时间内完成，且对操作技能要求较低。 体内 生存手术还存在一定的基础失败率，可能与动物（母体和幼崽）的发病率相关。这些动物通常需要由动物设施中具备相应技能的工作人员和/或兽医进行评估。第三，由于这些样本培养时间可长达5天或更久 体外它们使我们能够研究与神经元增殖、细胞命运决定、神经元迁移以及神经元早期成熟阶段（神经突起生长）相关的多种科学问题。第四，由于我们在体外培养体系中进行操作，因此可以添加外源性因子，以检测生长因子...
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披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
我们感谢 Shirin Bonni 博士提供 pSil-GFP 载体，Alper Uzun 博士为图1提供的示意图，以及 Leduc 生物成像中心在共聚焦显微镜方面的支持。EMM 获得伯纳德·马歇尔·韦尔科姆基金会（Burroughs Wellcome Fund）医学科学职业奖、NARSAD 青年研究者奖以及美国国立卫生研究院（NIH）国家研究中心资源中心（NCRR）COBRE 项目 P20 RR018728-01 的资助。SBL 由 NIH NCRR COBRE P20 RR018728-01 项目支持，并获得 PHS NRSA 5T32MH019118-20 项目的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 汉密尔顿注射器 | Hamilton Co | 80008 | 31 号针头，0.5 英寸长，PT-4（针尖斜面等级），10μl 容量 |
| 铂金镊子电极 | BTX Technologies | 45-0489 | 5 mm 规格 |
| ECM830 电穿孔仪 | BTX Technologies | 45-0002 | |
| BTX 脚踏开关 | BTX Technologies | 45-0208 | 与 ECM830 电穿孔仪配合使用 |
| 振动切片机 | Leica Microsystems | VT1000 S | |
| 6 孔板（用于插入式培养插件） | Falcon BD | 353502 | 带缺口，可匹配插入式培养插件 |
| 组织培养插入式插件 | Falcon BD | 353090 | 0.4 微米孔径 |
| 快绿染料 | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| 低熔点琼脂糖 | Fisher Scientific | BP165-25 | DNA 级别 |
| 层粘连蛋白 | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| 聚-L-赖氨酸 | Sigma-Aldrich | P5899 | |
| 基础伊格尔培养基 | Sigma-Aldrich | B-1522 | |
| 不含钙和镁的 10 倍 HBSS 溶液 | GIBCO, by Life Technologies | 14180-046 | |
| HEPES 游离酸 | Sigma-Aldrich | H4034 |
参考文献
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