通过跨物种移植分析神经嵴细胞的迁移与分化

摘要

本文描述了一种用于分析鹌鹑-鸡嵌合胚胎中鸟类神经嵴细胞迁移及其最终命运的研究方法。该方法是一种简单直接的技术，可用于追踪神经嵴细胞在迁移和分化过程中的动态，而在未经操作的鸡胚胎中，这些细胞通常难以被区分。

摘要

禽类胚胎因其在蛋内易于接触，为研究多种脊椎动物的发育过程提供了独特的平台。in ovo 将鹌鹑供体组织移植到鸡胚胎中所形成的嵌合禽类胚胎，结合了细胞群体不可磨灭的遗传标记能力与禽类胚胎易于操作的优势。

鹌鹑-鸡嵌合体是追踪迁移性神经嵴细胞（NCCs）的经典工具^1-3。神经嵴细胞是一类在胚胎发育过程中短暂存在的迁移性细胞群体，起源于发育中神经管的背侧区域⁴。这些细胞经历上皮-间质转化后，迁移到胚胎的其他区域，并分化为多种细胞类型，包括软骨细胞^5-13、黑色素细胞^11,14-20、神经元和胶质细胞^21-32。神经嵴细胞具有多能性，其最终命运受以下因素影响：1）在胚胎头尾轴方向上神经管中的起源位置^11,33-37；2）迁移过程中邻近细胞提供的信号^38-44；以及 3）在胚胎内最终定居位置的微环境^45,46。追踪这些细胞从神经管起源处到其在胚胎内最终位置及分化命运的全过程，对于理解调控模式形成和器官发生的发育过程具有重要意义。

移植供体神经管的同源区域（同位移植）或不同区域（异位移植），可以揭示神经嵴细胞（NCCs）在头尾轴方向上的预先特化差异^2,47。该技术还可进一步改进，用于移植神经管的单侧部分，使胚胎一侧来源于供体组织，而对侧在宿主胚胎中保持未受干扰状态，从而在同一标本内实现内部对照^2,47。此外，该方法也可适用于孵化后HH10阶段以后胚胎的脑段移植，此时前部神经管已经闭合⁴⁷。

本文报道了通过神经管移植生成鹌鹑-鸡嵌合体的技术，该技术可用于示踪起源于神经管特定节段的迁移性神经嵴细胞（NCCs）。利用鹌鹑特异性的QCPN抗体对供体来源的细胞进行物种特异性标记^48-56，研究人员可在实验终点明确区分供体细胞与宿主细胞。该技术操作简便、成本低廉，具有多种应用，包括命运图谱绘制、细胞谱系追踪以及鉴定头尾轴方向上的预先模式化事件⁴⁵。由于鸟类胚胎易于操作，鹌鹑-鸡移植技术可与其他实验手段联合使用，包括但不限于晶状体切除⁴⁰、抑制性分子注射^57,58，或通过电穿孔导入表达质粒进行遗传操作^59-61，以研究特定迁移路径的NCCs对胚胎发育程序扰动的响应。此外，该移植技术还可用于构建其他种间嵌合胚胎，例如鹌鹑-鸭嵌合体，以研究NCC在颅面形态发生中的作用，或小鼠-鸡嵌合体，以结合小鼠遗传学的强大优势与鸟类胚胎操作的便利性⁶²。

方案

1. 将鸡和鹌鹑卵孵化至所需阶段

对于HH9期胚胎，在38 °C条件下典型的孵育时间为29至33小时。⁶³

1. 用温水清洗卵上的碎屑。
2. 将鸡蛋水平放置在托盘上，用铅笔标记朝上的一侧；该侧对应胚胎将定位的区域。鹌鹑蛋则需钝端朝上放置进行孵化。
3. 放入38 °C的加湿培养箱中，并启动摇摆功能。

2. 准备用于开窗和解剖的卵

1. 从孵育箱中取出鸡蛋，用70%乙醇对蛋壳顶部进行消毒。最好将乙醇喷洒在蛋壳上，并迅速用纸巾或Kimwipe擦拭干净，以避免乙醇通过蛋壳被吸收。
2. 将鸡胚蛋放置在单独的蛋托上（我们使用内衬折叠纸巾（如“Kimwipes”）的培养皿）。使用AA镊子，在蛋的尖端上方蛋壳表面轻敲一个小孔。
3. 使用18½ G皮下注射针头和5 mL注射器，从鸡胚蛋中移除1.5–3 mL的稀蛋白。建议将针头垂直插入孔中，针尖斜面朝向蛋的尖端（见图2A）。这样在抽吸蛋白时，可最大程度避免因负压损伤蛋黄。弃去所移除的蛋白。此步骤可使蛋黄和胚胎下沉，便于在蛋壳上开窗。
4. 按上述方法用70%乙醇擦拭小孔，并用透明胶带（Scotch tape）密封。必须确保小孔周围的蛋壳完全无蛋白残留且干燥，否则胶带无法有效粘合。
5. 使用AA镊子，在水平放置的蛋的上表面标记位....

讨论

本文所述的将鹌鹑神经管移植到宿主鸡胚中的方法是一种简单且经济的技术，可用于追踪沿头尾轴不同区域迁移的特定神经嵴细胞（NCC）亚群^21,67-69。该技术利用了禽类胚胎易于操作的优势（相较于哺乳动物胚胎），并可与其他技术结合使用，例如组织消融、抑制性分子注射，或通过电穿孔导入表达质粒进行遗传操作，从而在实验中研究特定迁移性NCC群体对胚胎内不同发育信号的响应^47,69。

鹌鹑-鸡嵌合体是研究神经嵴细胞（NCC）迁移与分化的有力工具，该技术也可进一步改进，用于移植除神经管以外的其他组织。将鹌鹑组织移植至鸡胚胎是一种成熟的技术^13,21,70-76，但由于神经管微小区域的显微解剖需要极为精细的操作技巧，因此通过直观演示学习该技术效果最佳。

由于可以通过QCPN（一种针对鹌鹑细胞的特异性抗体）进行免疫染色，从而将来源于鹌鹑的细胞与宿主鸡胚细胞明确区分开来，因此可以通过实验终点时供体（鹌鹑）细胞的分化情况，推断来自神经管特定区域的神经嵴细胞（NCCs）的发育潜能；例如.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
鸡胚蛋	各种
鹌鹑蛋	各种
数码显示1502型运动者孵化箱（带湿度控制，110-120伏交流电）	家禽供应	1502
Dumont AA 镊子，Inox 环氧树脂涂层	Fine Science Tools	11210-10
透明胶带	任何供应商
弯曲虹膜镊	Fine Science Tools	11065-07
印度墨水	任何供应商
青霉素/链霉素（Penicillin, Streptomycin）溶液	VWR 国际公司	101447-068
透明胶带	任何供应商
针头牵引装置	Narishige International	PE-21
用1.5-1.8 × 100 mm 硼硅酸盐玻璃毛细管拉制的玻璃针	Kimble Chase	34500 99
拉制玻璃移液管，由5制成¾巴斯德移液管	Fisher Scientific	13-678-6A
口吸移液装置（带刻度微毛细移液管用吸管管组件）	Sigma-Aldrich	A5177-52A
Dumont #5 镊子	Fine Science Tools	11251-30
直径0.1 mm的钨丝	VWR 国际公司	AA10404-H2
持针器（镀镍针座）	Fine Science Tools	26018-17
QCPN 抗血清	发育研究杂交瘤库	QCPN
Alexa Fluor 二抗（例如 Alexa Fluor 594 山羊抗小鼠 IgG1）	Invitrogen	A21125
林格氏液’s 溶液（2 L）： 14.4 g NaCl <李>0.34g CaCl2 <李>0.74 g KCl <李>0.230 g Na2HPO4 <李>0.04 g KH2PO4 <李>ddH₂O2O 至 2 L <李>过滤并高压灭菌	Fisher Scientific	<李>7647-14-5 <李>10043-52-4 <李>7447-40-7 <李>7558-79-4 <李>7778-77-0