通过跨物种移植分析神经嵴细胞的迁移与分化

摘要

本文描述了一种用于分析鹌鹑-鸡嵌合胚胎中鸟类神经嵴细胞迁移及其最终命运的研究方法。该方法是一种简单直接的技术，可用于追踪神经嵴细胞在迁移和分化过程中的动态，而在未经操作的鸡胚胎中，这些细胞通常难以被区分。

摘要

禽类胚胎因其在蛋内易于接触，为研究多种脊椎动物的发育过程提供了独特的平台。in ovo 将鹌鹑供体组织移植到鸡胚胎中所形成的嵌合禽类胚胎，结合了细胞群体不可磨灭的遗传标记能力与禽类胚胎易于操作的优势。

鹌鹑-鸡嵌合体是追踪迁移性神经嵴细胞（NCCs）的经典工具^1-3。神经嵴细胞是一类在胚胎发育过程中短暂存在的迁移性细胞群体，起源于发育中神经管的背侧区域⁴。这些细胞经历上皮-间质转化后，迁移到胚胎的其他区域，并分化为多种细胞类型，包括软骨细胞^5-13、黑色素细胞^11,14-20、神经元和胶质细胞^21-32。神经嵴细胞具有多能性，其最终命运受以下因素影响：1）在胚胎头尾轴方向上神经管中的起源位置^11,33-37；2）迁移过程中邻近细胞提供的信号^38-44；以及 3）在胚胎内最终定居位置的微环境^45,46。追踪这些细胞从神经管起源处到其在胚胎内最终位置及分化命运的全过程，对于理解调控模式形成和器官发生的发育过程具有重要意义。

移植供体神经管的同源区域（同位移植）或不同区域（异位移植），可以揭示神经嵴细胞（NCCs）在头尾轴方向上的预先特化差异^2,47。该技术还可进一步改进，用于移植神经管的单侧部分，使胚胎一侧来源于供体组织，而对侧在宿主胚胎中保持未受干扰状态，从而在同一标本内实现内部对照^2,47。此外，该方法也可适用于孵化后HH10阶段以后胚胎的脑段移植，此时前部神经管已经闭合⁴⁷。

本文报道了通过神经管移植生成鹌鹑-鸡嵌合体的技术，该技术可用于示踪起源于神经管特定节段的迁移性神经嵴细胞（NCCs）。利用鹌鹑特异性的QCPN抗体对供体来源的细胞进行物种特异性标记^48-56，研究人员可在实验终点明确区分供体细胞与宿主细胞。该技术操作简便、成本低廉，具有多种应用，包括命运图谱绘制、细胞谱系追踪以及鉴定头尾轴方向上的预先模式化事件⁴⁵。由于鸟类胚胎易于操作，鹌鹑-鸡移植技术可与其他实验手段联合使用，包括但不限于晶状体切除⁴⁰、抑制性分子注射^57,58，或通过电穿孔导入表达质粒进行遗传操作^59-61，以研究特定迁移路径的NCCs对胚胎发育程序扰动的响应。此外，该移植技术还可用于构建其他种间嵌合胚胎，例如鹌鹑-鸭嵌合体，以研究NCC在颅面形态发生中的作用，或小鼠-鸡嵌合体，以结合小鼠遗传学的强大优势与鸟类胚胎操作的便利性⁶²。

方案

1. 将鸡和鹌鹑卵孵育至所需阶段

对于HH9期胚胎，在38 °C条件下典型的孵育时间为29至33小时。⁶³

1. 用温水清洗卵上的碎屑。
2. 将鸡蛋水平放置在托盘上，用铅笔标记朝上的一侧；该侧对应胚胎将定位的区域。鹌鹑蛋则需钝端朝上放置进行孵化。
3. 放入38 °C的加湿培养箱中，并启动摇动功能。

2. 准备用于开窗和解剖的鸡胚蛋

1. 从培养箱中取出鸡蛋，用70%乙醇对蛋壳顶部进行消毒。最好将乙醇喷洒在蛋壳表面，并迅速用纸巾或Kimwipe擦拭干净，以避免乙醇通过蛋壳被吸收。
2. 将鸡胚蛋放置于单独的蛋托上（我们使用内衬折叠纸巾（如“Kimwipes”）的培养皿）。使用AA镊子，在蛋的尖端上方蛋壳表面轻敲一个小孔。
3. 使用18½ G皮下注射针头和5 mL注射器，从鸡胚蛋中移除1.5–3 mL稀薄蛋白。建议将针头垂直插入孔中，针尖斜面朝向蛋的尖端（图2A）。这样在抽取蛋白时，可最大程度避免因负压损伤卵黄。弃去抽出的蛋白。此步骤可使卵黄和胚胎在蛋内下沉，便于在蛋壳上开窗。
4. 按上述方法用70%乙醇擦拭小孔，并用透明胶带密封。必须确保小孔周围的蛋壳无蛋白残留且完全干燥，否则胶带无法有效粘合。
5. 使用AA镊子，在水平放置的蛋之顶部标记区域再轻敲一个孔，位置略偏离顶端最高点。操作时注意镊子不可深入蛋壳过深，以免损伤卵黄或胚胎。
6. 将弯曲虹膜镊的一侧平行插入孔中，紧贴蛋壳边缘，以旋转方式夹碎直径约2 cm的窗口，移除蛋壳碎片并弃去。或者，可在蛋的上表面覆盖封箱胶带，再用剪刀剪出窗口，以减少蛋壳碎屑落入蛋内的风险。胚胎应呈现为卵黄表面的一个不透明圆盘。弃去未受精的蛋（表现为卵黄表面有微小白点或缺乏胚盘）。
7. 在胚盘下方注射少量印度墨汁（用含“青霉素/链霉素”抗生素的无菌林格液稀释10倍：终浓度为100 μg/mL青霉素和100 μg/mL链霉素），以辅助胚胎分期。使用1 mL注射器和26½ G皮下注射针头，针头基部弯成45°角，斜面朝上；也可使用拉制的玻璃巴斯德移液管配合口吸装置（弯针或折断玻璃针时需佩戴护目镜）。在胚盘边缘外刺破卵黄膜，将针尖滑入胚胎下方，靠近卵黄表面但不进入胚胎层（图2B）。注入足够勾勒胚胎轮廓的墨汁后，小心拔出针头（图2C）。墨汁注射过多可能导致胚胎死亡。切勿在胚胎下方注入气泡，以免引起污染。注意：本实验中所用林格液均经灭菌处理，并含上述Pen/Strep抗生素。无菌磷酸盐缓冲液（PBS）也可在本方案所有步骤中替代林格液。
8. 根据Hamburger和Hamilton⁶³标准对胚胎进行分期，并用永久性墨水或铅笔在蛋壳上记录发育阶段。最佳观察方式是在体视显微镜下使用光纤“鹅颈管”光源，此类光源产热较少。
9. 向胚胎表面滴加2–3滴温热的无菌林格液，以防脱水和污染。用拉伸的Parafilm膜覆盖窗口，临时密封。
10. 在开始移植实验前，对所有鸡胚蛋重复执行步骤2.2–2.9。
11. 由于鹌鹑胚胎仅作为供体组织来源，可省略in ovo的步骤2.2–2.9。对于ex ovo制备供体胚胎，将鹌鹑蛋钝端朝上孵育，并在此区域用弯头镊子打开蛋壳以暴露胚胎。使用解剖剪在胚外区域的卵黄膜和胚盘上做四个切口，形成方形（确保各切口相交）。用弯曲虹膜镊轻轻夹住其中一个切口边缘，将胚胎从蛋中提起并转移至培养皿中的林格液内。也可用弯曲虹膜镊从下方托起已切下的胚胎，或使用经截断扩口的塑料移液器（切除圆筒较宽部分）转移胚胎。用#5镊子小心去除卵黄膜。按上述方法收集其余鹌鹑胚胎，并在解剖显微镜下进行分期。

3. 准备受体胚胎以接受移植物

1. 移除宿主（鸡）胚胎上的封口膜，使用 sharpened tungsten needle 或 #5 镊子，在神经管目标区域的卵黄膜上撕开一个小孔（图 3A）。
2. 向胚胎上滴加一滴林格氏液。在整个操作过程中，务必保持胚胎完全浸没在林格氏液中，以防止组织脱水。如有需要，可通过移液管向胚胎表面持续补充林格氏液。
3. 使用拉制的玻璃针，在背侧神经管的目标长度和区域处，小心地进行头端和尾端的横向切口。（拉制玻璃针由硅质玻璃毛细管在加热条件下经拉针仪拉制而成。）对于单侧移植，切口应仅延伸至背侧神经管的管腔；对于双侧移植，切口需贯穿整个背侧神经管。随后，在背侧神经管与轴旁中胚层之间进行双侧切割。
4. 小心将切下的外植体从神经管分离，然后用玻璃微量移液管将其吸出（图 3B）。

4. 准备受体移植物组织

1. 选取一个发育阶段匹配的鹌鹑胚胎。用AA镊子固定胚胎，去除卵黄膜，并按照上述方法（3.3-3.4）切取相似大小的神经管区域（图3A'-B'）。根据实验需求，该区域可以是宿主（鸡）神经管的对应区域，也可以是沿头尾轴不同位置的区域。（注意：对于较大的区域移植，包括完整的神经管移植，研究人员可能希望在此步骤中加入蛋白酶消化处理，以在移植前去除供体组织上附着的间充质组织。然而，对于早期阶段的小范围背侧神经管移植（如本文所述），仅通过手术技术即可轻松将神经管与邻近间充质分离，因此无需进行蛋白酶消化处理。）

5. 移植组织

1. 将供体外植体吸入含有林格氏液的玻璃微量移液管中。注意不要将气泡引入移液管内。
2. 将外植体转移至鸡宿主切除区域的邻近位置。使用拉制的玻璃针调整外植体方向，并轻柔地将其引导至消融区域（图3C）。
3. 向胚胎上小心滴加数滴林格氏液，以防止脱水。注意避免将液体直接滴在移植物部位，以免移位移植物。
4. 用封口胶带密封窗口。确保胶带完全封闭开窗区域，以防止后续培养过程中胚胎脱水和污染。
5. 将鸡蛋放回培养箱，培养至所需发育阶段。培养嵌合体时，务必关闭培养箱的“摇动”功能。若目标为较晚发育阶段，可每天手动轻轻翻转鸡蛋两次，以提高其存活率。

6. 准备受嵌合胚胎以进行切片

1. 在实验终点时，使用精细剪刀剪开覆盖窗口的胶带。
2. 用弯头虹膜镊（带锯齿尖端更容易操作）夹住胚盘边缘，然后在胚盘边界外侧进行四次大切口，将胚胎从卵黄上分离。
3. 将胚胎转移至含有林格氏液的培养皿中。注意尽量减少胚胎暴露于空气中的时间，以避免组织脱水。
4. 在体视显微镜下，使用#5镊子轻轻将卵黄膜从胚盘上分离。
5. 小心地在培养皿中调整胚胎位置，使其保持在卵内时的相同朝向，并将周围的膜展平。
6. 使用钨丝制成的解剖针⁶⁴，将针尖置于胚胎与胚外组织的边界处，钨丝长度方向与培养皿底部平行，通过轻柔的锯动动作干净地去除胚胎周围多余的胚盘组织。
7. 用#5镊子小心去除羊膜。此时可根据需要进一步解剖感兴趣的区域，或保持胚胎完整。
8. 将胚胎转移至冰冻的4%多聚甲醛中，在4 °C条件下轻轻振荡固定过夜。
9. 制备样品并进行冷冻或石蜡包埋切片。

在宿主胚胎内追踪移植组织。识别鸡胚中鹑类组织的方法有多种，包括通过苏木精染色检测鹑类核仁（鹑类细胞核具有比鸡类细胞核更大、染色更深的包涵体）、Feulgen-Rossenbeck反应、吖啶橙或双苯并咪唑染色联合电子显微镜观察，或针对鹑类特异性抗原的免疫标记^3,47,65,66。本文采用QCPN抗原及标准的整体或切片免疫荧光技术，以鉴定鹑-鸡嵌合体中的鹑类神经嵴细胞（图4）。该方法在实验设计上具有最大的灵活性，因为QCPN免疫荧光可与其他抗体联合使用，以识别来源于供体（鹑类）组织的已分化细胞。请使用标准的整体或切片免疫荧光技术对嵌合体中来源于鹑类的细胞进行标记。

7. 代表性结果

重新孵育6小时（至HH11期）后神经管移植区域的代表性图像显示，移植的供体（鹌鹑）组织已按预期整合入宿主（鸡）的神经管中（图4A）。若胚胎在重新孵育后显示移植物整合不完全，或头颅区域或体节发育不对称，则应予以弃用。

HH11 期移植物区域的横切面显示，HNK-1 标记的神经嵴细胞（NCCs）正从神经管向外侧迁移。参与神经嵴细胞迁移流及神经管形成的鹌鹑细胞被 QCPN 清晰标记（图 4B）。

在较晚的发育阶段，可以追踪鹌鹑神经嵴细胞（NCC）来源的细胞到达其最终靶组织。在胚胎发育第5天（E5），QCPN标记的细胞散布于鸡胚上颌突的间充质中（图4C）。

QCPN 抗体可轻松与其他抗体联合使用，以检测宿主环境中来源于鹌鹑的神经嵴细胞（NCCs）的分化情况。来源于鹌鹑 NCC 的三叉神经感觉神经元可被 QCPN 和 Tuj1 抗体标记（图 4D）。

图 1. 实验流程概览及所需仪器。 A) 宿主（鸡）与供体（鹌鹑）胚胎应处于相同发育阶段。为标记参与三叉神经节及上颌-下颌区域形成的神经嵴细胞（NCC）迁移流，HH9 期最为理想。在 HH9 期，前部区域的神经管开始闭合，但尚未完全封闭。图中灰色线条代表正在闭合的神经管中线。白色虚线表示从宿主和供体胚胎右侧神经管切除中脑区域的切割线。宿主胚胎被切除的组织将被丢弃，供体组织则移植至宿主位置，以生成嵌合胚胎。 B) 所需仪器包括：a) 5 mL 注射器配 18½ G 皮下注射针头，b) 1 mL 注射器配 26½ G 皮下注射针头（弯成 45° 角），c) 印度墨水，d) 透明封箱胶带，e) 玻璃移液管配口吸装置，f) 60 mm 培养皿，g) AA 镊子，h) 尖端带齿的弯头虹膜镊，i) #5 镊子，j) 精细剪刀，k) 磨尖的钨丝，l) 拉制玻璃针，m) 石蜡膜小方块。

图 2. 卵与胚胎的制备。 A) 卵的横截面示意图，显示用于抽取稀薄蛋白的理想穿刺位置，使用18½ G皮下注射针头。B) 抽取约3 mL稀薄蛋白后，卵黄及胚胎在卵内下沉，使研究人员可在蛋壳上切开一个“窗口”（箭头所示），以接触胚胎。随后可将印度墨水用无菌林格液按1:10稀释后注射至胚盘下方，以提供对比度，便于胚胎发育阶段的观察。C) 墨染后的鸡胚胎。

图3. 移植操作各步骤中HH9期供体与受体胚胎的示意图及实例。 A) 鸡受体胚胎。图中虚线表示应撕开卵黄膜的位置，以暴露头部区域进行移植。撕开后，应将三角形的卵黄膜瓣向尾侧剥离。图像中的方框表示用于(B-C)的放大区域。A') 鹌鹑供体胚胎。图像显示从蛋中取出并置于培养皿中以分离移植物组织的供体胚胎。图像中的方框表示用于(B')的放大区域。示意图(A')中的虚线表示应切割卵黄膜和卵黄囊膜的位置，以便将胚胎从蛋中取出。B) 已切除中脑区域单侧神经管的受体胚胎（白色箭头），等待移植。示意图中的点线表示应进行切割以切除中脑区域神经管的位置。B') 已切除背部神经管移植物组织的供体胚胎（黑色箭头所示为移植物组织）。示意图中的点线表示应在鹌鹑胚胎上进行切割的位置，以切除用于单侧中脑区域神经管移植的供体组织。C) 将鹌鹑背部神经管外植体移植至鸡中脑区域后形成的嵌合胚胎。

图4. 免疫荧光检测嵌合胚胎中供体来源细胞的鹌鹑特异性核抗原QCPN。 A) HH11期嵌合体（于HH9期移植）的整体图像，显示QCPN染色呈红色，HNK-1染色（迁移中神经嵴细胞的标记物）呈绿色。10倍放大，背侧视图。B) 图A胚胎的横切面，显示神经管及迁移中的神经嵴细胞中存在QCPN阳性鹌鹑来源细胞，并与HNK-1共染色（绿色）。40倍放大。C) E5期嵌合体上颌突的横切面（移植后孵育3天），显示QCPN阳性的神经嵴来源细胞（红色）已从神经管移植区域迁移至胚胎中的最终位置。10倍放大。D) E5期嵌合体切片，显示鹌鹑来源的神经嵴细胞对三叉神经节（红色）的贡献及其分化为TuJ1阳性神经元（绿色）。40倍放大。*，神经嵴细胞；MP，上颌突；NT，神经管；TG，三叉神经节。

讨论

本文所述的将鹌鹑神经管移植到宿主鸡胚中的方法是一种简单且经济的技术，可用于追踪沿头尾轴不同区域迁移的特定神经嵴细胞（NCC）亚群^21,67-69。该技术利用了禽类胚胎易于操作的优势（相较于哺乳动物胚胎），并可与其他技术结合使用，例如组织消融、抑制性分子注射，或通过电穿孔导入表达质粒进行遗传操作，从而在实验中研究特定迁移性NCC群体对胚胎内不同发育信号的响应^47,69。

鹌鹑-鸡嵌合体是研究神经嵴细胞（NCC）迁移与分化的有力工具，该技术也可进一步改进，用于移植除神经管以外的其他组织。将鹌鹑组织移植至鸡胚胎是一种成熟的技术^13,21,70-76，但由于神经管微小区域的显微解剖需要极为精细的操作技巧，因此通过直观演示学习该技术效果最佳。

由于可以通过QCPN（一种针对鹌鹑细胞的特异性抗体）进行免疫染色，从而将来源于鹌鹑的细胞与宿主鸡胚细胞明确区分开来，因此可以通过实验终点时供体（鹌鹑）细胞的分化情况，推断来自神经管特定区域的神经嵴细胞（NCCs）的发育潜能；例如...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
鸡胚蛋	Various
鹌鹑蛋	Various
蛋类孵化箱（Digital Readout 1502 Sportsman Incubator w/Humidity 110-120 Volt AC）	Poultry Supply	1502
Dumont AA 镊子，Inox 环氧涂层	Fine Science Tools	11210-10
透明胶带	Any Supplier
弯头虹膜镊	Fine Science Tools	11065-07
印度墨水	Any Supplier
青霉素/链霉素（Penicillin, Streptomycin）溶液	VWR international	101447-068
透明封箱胶带	Any Supplier
拉针仪	Narishige International	PE-21
拉制玻璃针，由 1.5–1.8 × 100 mm 硼硅酸盐玻璃毛细管制成	Kimble Chase	34500 99
拉制玻璃移液管，由 5¾" 巴斯德移液管制成	Fisher Scientific	13-678-6A
口吸移液装置（校准微量毛细移液管用吸液管组件）	Sigma-Aldrich	A5177-52A
Dumont #5 镊子	Fine Science Tools	11251-30
钨丝，直径 0.1 mm	VWR international	AA10404-H2
持针器（镍镀层针夹）	Fine Science Tools	26018-17
QCPN 抗血清	Developmental Studies Hybridoma Bank	QCPN
Alexa Fluor 二抗（例如 Alexa Fluor 594 山羊抗小鼠 IgG1）	Invitrogen	A21125
Ringer’s 溶液（2 L）： 14.4 g NaCl 0.34 g CaCl2 0.74 g KCl 0.230 g Na2HPO4 0.04 g KH2PO4 ddH2O 定容至 2 L 过滤并高压灭菌	Fisher Scientific	7647-14-5 10043-52-4 7447-40-7 7558-79-4 7778-77-0