本方法描述了利用基于红外染料的成像系统，以高灵敏度检测感染小鼠支气管肺泡灌洗（BAL）液中的H1N1病毒。该方法可在96孔或384孔板中进行，所需检测样品体积小于<10 μl，且具备同时筛查多种病原体的潜力。
本文内容
摘要
摘要
流感病毒是一种呼吸道病原体，每年在世界多个地区引起高度的发病率和死亡率。因此，准确鉴定感染毒株并快速对大量临床样本进行高通量筛查，对于控制大流行性感染的传播至关重要。目前临床对流感病毒感染的诊断主要基于血清学检测、聚合酶链式反应、直接标本免疫荧光检测以及细胞培养1,2。
本文报道了一种用于检测活体流感病毒的新型诊断技术的开发。我们采用鼠适应性人源 A/PR/8/34（PR8，H1N1）病毒3，利用 MDCK 细胞4对该技术的有效性进行测试。将 MDCK 细胞（每孔 104 或 5 × 103）培养于 96 孔或 384 孔板中，接种 PR8 病毒后，使用抗 M2 抗体进行检测，随后使用红外染料标记的二抗。M25 和血凝素1 是多种不同诊断检测中常用的两种主要标志蛋白。采用红外染料标记的二抗可最大程度降低其他荧光染料所引起的自发荧光。使用抗 M2 抗体使我们能够将抗原特异性荧光强度作为病毒数量的直接度量指标。为了量化荧光强度，我们采用了基于 LI-COR Odyssey 的红外扫描仪。该系统利用双通道激光红外检测技术识别荧光染料，并将其与背景噪声区分开来。第一通道激发波长为 680 nm，发射波长为 700 nm，用于量化背景信号。第二通道检测激发波长为 780 nm、发射波长为 800 nm 的荧光染料。在红外扫描仪中对 PR8 感染的 MDCK 细胞进行扫描，结果显示荧光强度与病毒滴度呈依赖性增强。从 102–105 PFU 起，荧光强度与病毒滴度之间的正相关性可被持续观察到。在 102–103 PFU 的 PR8 病毒滴度下，仍可观察到微弱但可检测的阳性信号，表明近红外染料具有高灵敏度。通过比较模拟感染或同型抗体处理的 MDCK 细胞，确定了信噪比。
利用96孔或384孔板的荧光强度数据，我们构建了标准滴定曲线。在这些计算中，第一个变量为病毒滴度，第二个变量为荧光强度。因此，我们采用指数分布进行曲线拟合，以确定病毒滴度与荧光强度之间的多项式关系。综上所述，我们得出结论：基于红外染料的蛋白质检测系统有助于诊断感染性病毒株，并能精确测定感染性病原体的滴度。
方案
1. MDCK 细胞培养
- 在37 °C、含5.2% CO2的培养箱中，将500万个MDCK细胞接种于T-75 cm2培养瓶中，加入20 ml完全RPMI1640培养基（含10% FBS、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、1 mM丙酮酸钠、5%的7.5%碳酸氢钠溶液和0.001% β-巯基乙醇），过夜培养。
2. PR8 感染与支气管肺泡灌洗液采集
- 通过一个鼻孔，以30 μl的无菌PBS总体积，对C57BL/6小鼠进行鼻内接种5,000 PFU的PR8病毒。使用不含病毒的无菌PBS进行模拟感染。
- 在感染后0、2、4和7天处死小鼠，打开胸腔，并在小鼠毛皮上沿气管平行方向做1 cm切口以暴露气管。
- 在气管近端做正中切口。
- 用0.5 ml PBS-1% BSA灌注气管并收集支气管肺泡灌洗液（BAL）。支气管肺泡灌洗液可储存于-20 °C冰箱中，待用时取出。
3. 利用LI-COR Odyssey进行病毒感染及病毒基质蛋白（M2）检测
- 使用红外染料偶联抗体定量病毒滴度时，从 T-75 cm2 培养瓶中收集 MDCK 细胞，并将其接种于光学平底黑色 96 孔板（每孔 10,000 个细胞）或 384 孔板（每孔 5,000 个细胞）中。在 RPMI1640 完全培养基中于 37 °C 培养过夜，随后用含牛血清白蛋白（BSA，0.2%，质量/体积）、青霉素（100 U/ml）、链霉素（100 μg/ml）、丙酮酸钠（1 mM）、碳酸氢钠溶液（7.5% 的 5%）和 β-巯基乙醇（0.001%）的无血清 DMEM 洗涤两次。
- 将 MDCK 细胞与支气管肺泡灌洗液（BAL 液，96 孔板每孔 50 μl，384 孔板每孔 10 μl）或已知滴度的 PR8 病毒在各孔中孵育，加入等体积（96 孔板每孔 50 μl，384 孔板每孔 10 μl）含 N-甲苯磺酰-L-苯丙氨酸氯甲基酮（TPCK）处理的胰蛋白酶（0.2 μg/ml）的 DMEM 培养基。
- 感染 1 小时后，向每孔加入 100 μl（96 孔板）或 20 μl（384 孔板）含 10% FBS 的 RPMI1640 完全培养基。
- 继续培养 MDCK 细胞进行感染共 16 小时；用 100 μl（96 孔板）或 20 μl（384 孔板）含 1% BSA 的 PBS 溶液洗涤 MDCK 细胞两次，并用 100 μl（96 孔板）或 20 μl（384 孔板）1% 多聚甲醛固定 5 分钟。
- 固定后，进一步用 100 μl（96 孔板）或 20 μl（384 孔板）含 1% BSA 的 PBS 进行封闭，孵育 30 分钟。
- 封闭后，加入针对 M2 蛋白的一抗（1:1000，用含 1% BSA 的 PBS 稀释），在 96 孔板中每孔使用 50 μl，在 384 孔板中每孔使用 20 μl，孵育 1 小时。
- 用含 1% BSA 的 PBS 洗涤 MDCK 细胞三次，每次 100 μl（96 孔板）或 20 μl（384 孔板），然后加入 50 μl（96 孔板）或 20 μl（384 孔板）山羊抗小鼠 IRDye@800 二抗（1:200 稀释），孵育 1 小时。
- 用 100 μl 含 1% BSA 的 PBS 洗涤 MDCK 细胞三次。将染色后的板置于 LI-COR Odyssey 红外扫描仪的读板玻璃平台上，设置为 96 孔或 384 孔板读取模式。
- 可使用 LI-COR Odyssey 软件设置阴性对照孔的空白值。使用 LI-COR Odyssey 软件对整块板或板内选定孔进行定量分析。
- 使用自动形状工具，在 96 孔或 384 孔板测试孔的中央绘制目标区域（ROI）的边界。创建 ROI 可使软件将定义的背景孔与病毒滴定样本进行比较。
- 为整个实验设定基线值，使用背景 ROI。将 Odyssey 软件提供的两条正交十字线置于 ROI 内，以测量孔内荧光强度的分布。
- 在 LI-COR Odyssey 红外扫描仪中，使用 780 nm 通道进行检测，680 nm 作为参考波长进行扫描。
- 激活“读取”命令后，系统将测量 ROI 内均匀间隔的荧光强度，并对采集的数据点进行积分。标准差倍数将决定在 ROI 判定中包含的高于基线的信号水平。
- 背景荧光将从模拟感染组或仅加二抗的对照组中定量，并用于估算测试孔的积分强度。
- 选择“积分强度”进行计算，因其代表定义的单个斑点的净像素体积，且不受特征尺寸影响。利用已知病毒滴度的标准曲线计算未知样本的病毒滴度。使用长插值曲线精确计算病毒滴度。通过将测试样本的强度与标准曲线比较，计算测试样本中的病毒滴度。
4. 典型结果
基于红外染料的高通量病毒检测系统的标准化
PR8 病毒可感染 MDCK 细胞，因此我们使用这些细胞开发了该检测方法。我们采用针对流感病毒基质蛋白（M2）的一抗来测定病毒滴度。与其他方法不同的是，我们使用了与近红外荧光染料偶联的二抗。该方法通过检测 M2 蛋白时产生的荧光强度，实现对 PR8 病毒滴度的简单、自动化测定。流感病毒感染后，M2 蛋白在宿主细胞内翻译、转运并积累，包括细胞表面。因此，M2 蛋白的含量可作为衡量病毒数量的可测指标。通过将待测样本的荧光强度与标准曲线进行比较，可精确测定病毒滴度。
为了评估基于荧光的方法的有效性，我们将104个MDCK细胞/孔接种于培养板中，过夜培养。将已知滴度的PR8病毒储备液以不同的噬斑形成单位（PFU）加入到重复孔中，使其在细胞上吸附1小时。随后将细胞孵育16小时，以允许病毒增殖。之后，用1%多聚甲醛固定腔室载玻片中的MDCK细胞，洗涤后加入抗M2抗体孵育1小时，再加入AlexaFluor 488标记的二抗继续孵育1小时。共聚焦显微镜分析显示，感染的MDCK细胞形成的贴壁单层基本保持完整，且来源于PR8病毒的M2蛋白在感染的MDCK细胞内大量存在（图1A）。在病毒滴度低至102时，仍可检测到荧光信号阳性的细胞。这些分析还表明，每孔中发出荧光的MDCK细胞数量与PR8病毒滴度的升高呈正比。然而，尽管基于氩激光的荧光染料激发具有较高的光学效率，可提供清晰的细胞图像，但其信噪比较低，且细胞自身存在自发荧光，使得病毒定量极为困难，尤其是在较低滴度时更为显著。
因此，为了建立一种准确的病毒定量方法，我们采用了一种基于红外染料的检测与定量系统。将 MDCK 细胞（每孔 104 个）培养于 96 孔板中，接种 PR8 病毒后，使用抗 M2 抗体进行检测，再加入红外染料标记的二抗。使用抗 M2 抗体使我们能够将抗原特异性的荧光强度作为病毒数量的直接指标。为了测定荧光强度，我们采用了基于 LI-COR Odyssey 的红外扫描仪。该系统利用双通道激光红外检测技术识别荧光染料，并将其与背景噪声区分开。第一通道激发波长为 680 nm，发射波长为 700 nm，用于量化背景信号。第二通道检测激发波长为 780 nm、发射波长为 800 nm 的荧光染料。在 LI-COR Odyssey 上对感染 PR8 的 MDCK 细胞进行扫描，结果显示荧光强度与病毒滴度呈依赖性关系（图 1B）。M2 阳性荧光信号的 MDCK 细胞在孔内清晰可见（图 1B）。从 102 至 105 PFU 的病毒滴度范围内，荧光强度与病毒滴度之间的正相关性可被稳定观察到。当 PR8 病毒滴度高于 106 PFU 时会导致细胞死亡，这限制了该检测方法的上限灵敏度。在 102 至 103 PFU 的 PR8 病毒滴度下，仍能持续检测到微弱但明显的阳性信号，表明近红外染料具有高灵敏度。通过比较未感染病毒（mock-infected）或经同型抗体处理的 MDCK 细胞，确定了信噪比。这两种对照均显示出可忽略或无法检测到的荧光水平（图 1B）。
为了进一步提高检测灵敏度并减少检测所需样本量，我们在384孔板中每孔接种5×103个MDCK细胞。使用不同PFU数量的PR8病毒以连续十倍稀释的方式进行测试（图1C）。384孔板的检测灵敏度与96孔板检测结果相当。在384孔板中，101和102 PFU的检测效果均持续优于96孔板。基于96孔或384孔板的荧光强度数据，我们构建了标准滴定曲线（图1D）。在这些计算中，第一个变量为病毒滴度，第二个变量为荧光强度。因此，我们采用指数分布进行曲线拟合，以确定病毒滴度与荧光强度之间的多项式关系。我们还使用另一种针对PR8病毒核蛋白（NP）的抗体验证了上述结果（数据未显示）。此外，还使用了不同来源的PR8毒株感染MDCK细胞，并用抗-NP或抗-M2抗体进行检测（数据未显示）。综上所述，我们得出结论：基于红外染料的蛋白质检测系统有助于诊断感染性病毒毒株，并可精确测定感染病原体的滴度。
计算病毒滴度的数学考量
荧光强度和滴度测定的数学计算方法如下所述。染色程序完成后，使用LI-COR Odyssey软件对整块板或板中的选定孔进行定量分析。利用自动形状工具，在96孔或384孔板的检测孔中间绘制目标区域（ROI）的边界（图2A和B）。创建ROI可使软件将定义的背景孔与病毒滴定样本进行比较。使用背景ROI设定整个实验的基线值。在ROI内引入两条相互垂直的十字线（白色），用于测量孔内荧光强度的分布（图2C）。图2C中代表性孔右侧和下方的曲线表示沿这些十字线的像素强度。测量ROI内均匀间隔的荧光强度，并对收集的数据点进行积分。通过设定标准差倍数来确定高于基线的信号水平，该信号被纳入ROI的判定范围。背景荧光通过模拟感染或仅加入二抗的对照组进行量化，并用于估算检测孔中的积分强度。我们选择积分强度进行计算，因为它代表了定义明确的单个斑点的净像素体积，且不受特征尺寸的影响。此外，积分强度在很大程度上与分辨率无关。总强度/像素（I）对应于所选孔在像素区域内的信号强度（Is）加上该像素区域背景产生的信号（b）。因此，对于像素“i”：
Ii = Isi + bi
像素体积同时表示信号的强度及其分布的面积。信号面积与产生该信号的样品分布相关。像素体积等于在像素“i”的面积（a）内测得的总信号乘以其高度（I）。因此，对于像素“i”：
vi = aIi
总像素体积是整个区域总信号的累加，因此：
| n | n | ||
| V= | Σvi | = | aΣIi |
| i=1 | i=1 |
整合强度是特征所包围的所有像素的强度值之和乘以圆/矩形的面积（单位 mm2）。因此，整合强度 =
a(ΣIi- b )
其中，b 表示平均背景像素强度。该公式用于计算对照孔或实验孔的总信号强度，从而建立标准曲线。测试样本中的病毒滴度通过该标准曲线计算得出。浓度（即强度）定义为特定感兴趣区域（ROI）中存在的荧光量。测试样本中的浓度是相对于同一图像中标准品的已知浓度进行计算的。为精确计算病毒滴度，需将各浓度标准品的强度值绘图，并拟合为一条长插值曲线。通过将测试样本区域的强度与标准曲线进行比较，即可计算其浓度。
测定流感病毒感染小鼠支气管肺泡灌洗液中的病毒滴度
在临床和实验室样本中检测活体流感病毒颗粒具有重要意义。因此，我们接下来探讨了是否可以利用该方法测定实验室样本中的病毒滴度。从未经免疫的小鼠中收集支气管肺泡灌洗液（BAL）并加入已知数量的PR8病毒。对加标后的BAL液体进行梯度稀释，以测定病毒滴度。取加标BAL液等分试样感染96孔板中的MDCK细胞，固定后使用抗M2抗体和IR荧光染料标记的二抗进行染色。如图3A所示，加标BAL液中的病毒滴度可被检测到，并与标准曲线中的PR8病毒滴度呈对应关系。利用该标准曲线，可精确量化加标及梯度稀释后BAL液中的病毒数量。通过指数曲线拟合计算，可进一步确定加标BAL液中的病毒滴度（图3B）。采用该方法，我们获得了计算所得病毒滴度与实际加标滴度之间的良好相关性，验证了该方法的可靠性（图3C）。
接下来，我们分析了PR8感染小鼠的支气管肺泡灌洗液（BAL）。PR8已被广泛用于小鼠模型中以研究人类病理学及抗病毒免疫反应3。将小鼠分组后通过鼻内接种5,000 PFU的PR8病毒。监测小鼠的体重减轻情况、弓背、毛发竖起及其他临床症状。在感染后的第0、2、4、7和10天处死小鼠，并收集支气管肺泡灌洗液。为利用这些实验室样本，将MDCK细胞与BAL液进行系列稀释后，在96孔板中以终体积50 μl孵育17小时。接种已知滴度PR8病毒储备液的MDCK细胞作为对照孔，用于生成标准曲线。感染后，细胞经洗涤、固定，随后用抗M2一抗孵育，再加入近红外荧光染料标记的二抗进行孵育。未感染病毒（假感染）或感染后使用同型对照处理的MDCK细胞用于确定背景荧光强度，以进行滴度计算。
支气管肺泡灌洗液（BAL）分析表明，实验室样本中的PR8病毒可通过基于红外染料的检测系统检出。感染后第2天和第4天，BAL液中的病毒载量显著升高（图4A）。对总荧光强度的计算结果显示，感染后第2天和第4天的BAL液中含有显著水平的PR8病毒（图4B）。我们的结果表明，PR8感染早期小鼠出现逐渐但显著的体重下降，反映出疾病的严重程度。然而，大多数小鼠在感染后7天开始从疾病症状中恢复，并逐渐恢复体重（图4C）。感染后第10天的小鼠体内未检测到任何PR8病毒，表明病毒已被清除，这与体重回升以及疾病症状显著减轻相一致。
为了进一步拓展本检测方法的应用范围，我们使用基于红外染料的抗体检测系统对一株2009年A(H1N1)人流感分离株进行了检测，并将其结果与实时PCR检测进行了比较。该临床样本来源于一名疑似患者的鼻咽/咽拭子混合样本，由密尔沃基卫生署实验室在MDCK细胞系中进行增殖培养。通过比较检测结果，评估基于红外染料的方法相对于实时PCR检测的灵敏度（图5）。结果表明，基于红外染料的抗体检测系统能够检测低至103 TCID50/ml的病毒载量，该灵敏度与基于PCR的检测方法（10 TCID50/ml）相当，并处于大多数患者样本的临床相关范围内。这些结果提供了有力证据，表明基于红外染料的检测系统具有足够的灵敏度，具备在科研实验室和临床环境中用于病毒滴度测定的潜力。
图 1. 基于红外染料的流感病毒免疫检测。 （A）在8孔板中培养的流感病毒感染MDCK细胞的共聚焦显微镜分析。免疫荧光显微镜分析显示，贴壁生长的MDCK单层细胞基本保持完整，并富含病毒来源的M2蛋白。（B-C）基于红外染料和LI-COR Odyssey系统的病毒滴度定量分析。（D）标准曲线的建立及指数曲线拟合图谱。A-D中的数据代表了五次独立实验的典型结果。
图2. 使用红外染料测定病毒滴度的方法。 （A）整合荧光强度测量。在检测孔内部定义一个区域（ROI），用于测量荧光强度。使用自动形状工具，在96孔或384孔板的检测孔中央绘制ROI边界。荧光以ROI区域内各个像素（像素=n）的形式进行测量。整合强度是特征范围内所有像素强度值的总和乘以圆/矩形的面积（计数 mm2）。 （B）测定检测孔中的整合荧光强度。创建ROI可使LI-COR扫描仪将定义的背景孔与病毒滴定样本进行比较。背景荧光从模拟感染或仅含二抗的对照组中量化，并用于估算检测孔中的整合强度。 （C）在ROI内采集数据点。在ROI内引入两条相互垂直的十字线（白色），用于测量穿过孔的荧光强度。代表孔右侧和下方的曲线表示沿这些十字线的像素强度。
图3. PR8加标BAL液体中病毒滴度的检测与定量。 (A) MDCK细胞在96孔板中培养过夜，并加入PR8加标的BAL液体。使用LI-COR Odyssey系统读取结果。(B) 外源性加标的BAL液体与标准曲线进行比较。(C) 计算所得病毒滴度与预期滴度的比较。指数曲线拟合得到公式 y=9.4784e0.0014x。A-C中的数据代表三次独立实验的结果。
图 4. PR8 感染小鼠支气管肺泡灌洗液（BAL）中流感病毒的检测与定量。 （A）将小鼠分组，通过鼻内接种 5,000 PFU 的 PR8 病毒。在 96 孔板中，将 MDCK 细胞与 BAL 液体的系列稀释液在终体积 50 μl 中孵育 17 小时。感染后，细胞经洗涤、固定，并使用抗 M2 一抗孵育，随后加入红外染料标记的二抗进行染色。最右侧图示为标准曲线。（B）感染小鼠 BAL 液中病毒滴度的定量分析。（C）PR8 感染期间小鼠体重下降与病毒载量的相关性。A–C 所示数据代表三次独立实验的结果。
图 5. 来自一名人类患者的 2009 年 A(H1N1) 大流行（pdm）流感分离株的检测与定量。 （A）采用红外染料标记抗体荧光系统对感染的 MDCK 细胞系进行半量滴定检测。荧光结果显示，该检测方法具有检测低至 103 TCID50/ml 病毒载量的潜力。（B）从培养分离物中提取的核酸，以及已知滴度的 H1N1 分离物的连续十倍稀释样本，均采用美国疾病控制与预防中心（CDC）的实时 PCR 检测法12 进行分析。实时 PCR 检测的最低检出限为 10 TCID50/ml。
讨论
东南亚地区近期暴发的禽流感疫情以及全球对甲型H1N1流感大流行的担忧，给公共卫生与安全带来了巨大挑战。目前的研究重点集中在开发针对现有及新型流感病毒株的疫苗。快速、高通量的技术若能实现精确检测和准确的病毒滴度计算，将极大改善治疗效果。目前用于测定病毒滴度的最常用技术包括噬斑形成试验和流感病毒血凝试验。噬斑形成试验最初用于测定噬菌体滴度，后由Renato Dulbecco改进，用于测定动物病毒滴度4。该实验的操作步骤为：对流感病毒原液或动物样本（如支气管肺泡灌洗液）进行10倍系列稀释，取0.1 ml等分试样接种于6孔板中的MDCK细胞单层上。让病毒吸附至MDCK细胞后，加入营养培养基和琼脂糖。在孵育过程中，最初被感染的细胞释放出子代病毒，仅扩散至邻近细胞。流感病毒感染引起的细胞病变效应形成圆形的感染细胞区域，称为噬斑。每个噬斑理论上由单个病毒颗粒感染单个细胞并复制后形成。可通过结晶紫等染料增强活细胞与噬斑之间的对比度。该方法的主要缺点是重复性差，实验内变异幅度大。另一种用于测定流感病毒滴度的实验是血凝试验。流感病毒表面的血凝素蛋白可高效结合哺乳动物和禽类红细胞表面含N-乙酰神经氨酸的蛋白质1。流感病毒与红细胞之间的这种相互作用导致形成晶格状的凝集现象。通过观察凝集程度，可估算待测样本中流感病毒的滴度。红细胞凝集试验仅可用于已知病毒的滴定，不能用于病毒株的鉴定。由于该试验无法区分活病毒与死病毒，因此难以获得精确的病毒滴度计算结果。
目前流感感染的临床诊断主要基于血清学检测、聚合酶链式反应（PCR）、直接标本免疫荧光以及细胞培养方法1,6。本文所描述的新方法也具有临床和实验室诊断潜力。流感检测试剂盒Directigen FLU-A（BD Biosciences，美国加利福尼亚州圣何塞）和BinaxNow（Binax, Inc.，美国缅因州斯卡伯勒）采用免疫层析法检测病毒抗原，例如核蛋白7。使用这些试剂盒可在15分钟内完成病毒检测；然而，所有阴性样本仍需通过细胞培养法进一步筛查。多项研究也报道了这些试剂盒的敏感性较低，尤其是在感染较轻或病毒载量较低的情况下8。在我们的方法中，可稳定检测低至100 PFU的病毒量。这表明该技术在临床样本中检测H1N1病毒时具有实用性，即使在感染较轻微的情况下也能有效检出。已有研究报道基于荧光的方法用于检测病毒抗原，该方法可直接分析鼻咽抽吸物标本，或将标本接种至易感细胞单层以进行病毒增殖及后续分析9。然而，这些方法在诊断应用上存在局限性，且不适用于病毒滴度的定量。定量PCR（Q-PCR）虽可鉴定病毒RNA的存在，但无法评估活病毒的感染能力。与上述检测方法相比，基于红外染料（IR dye）的检测系统更有利于在临床和实验室样本中实现病毒的检测与病毒滴度的定量。在流感暴发期间，短时间内诊断数千份样本至关重要。本方法基于384孔板和红外扫描仪，可同时扫描6块板（>2,000个样本），因此相较于其他直接荧光检测方法具有显著优势。快速处理大量临床样本的可行性有助于降低检测变异度、缩短检测时间并减少成本。使用M2特异性抗体的优势在于其不受H和N蛋白株系差异的影响。M2蛋白在大多数感染人类的流感病毒株中相对保守。若将针对流行株系的特异性抗体与本系统结合，即可同时测定病毒滴度并鉴定病毒株系。然而，由于M2是金刚烷胺类药物的作用靶点，可能产生突变，从而改变本研究中所用单克隆抗体的结合位点。这在正在接受此类药物治疗的个体中可能构成该系统的潜在局限性。
检测样本中流感病毒滴度的测定方法有多种。为计算病毒滴度，50%组织培养感染剂量（TCID50）和基于鸡胚尿囊液的检测方法被广泛使用1,10。然而，这些方法需要数天时间，因此可靠性较低。此外，这些方法基于噬斑数量50%变化的计算，仅提供理论值，无法获得准确的病毒滴度。噬斑形成实验可在96小时内完成，但在病毒滴度计算中缺乏可重复性是一个主要问题。本文所述的现有技术具有若干显著优势。首先，该技术具有高度可重复性，结果稳定一致。其次，病毒滴度的计算基于荧光强度的简单定量，并与已定义的标准曲线进行比较。第三，可在同一样本中使用两种或多种一抗来诊断多个血清型。此外，红外染料偶联抗体具有极低的自发荧光，已用于细胞成像11。由于存在高量子产率的内源性荧光物质，紫外或可见光辐射（300–600 nm）会导致细胞产生强烈的自发荧光。这些物质包括芳香族氨基酸、脂色素、吡啶核苷酸（NADPH）、弹性蛋白、胶原蛋白和黄素辅酶。细胞的这一固有特性使得难以利用这些辐射源作为探针来定量特定蛋白的表达。相比之下，近红外染料的激发和发射波长范围为670–1000 nm。许多宿主细胞分子和多环芳烃在此波长下不被激发，且由于光散射减少，产生的背景荧光极低。此外，由于近红外荧光染料具有高消光系数，背景信号与特异性检测信号之间的窗口显著扩大。光稳定性高、信噪比优异，对于病毒滴度的定量极为重要。使用微流控腔室可通过机器人控制实现筛选过程的自动化，从而更便捷地检测高传染性的临床样本。因此，在这些方法中使用近红外染料是理想且高度可靠的技术，可用于组织样本中病毒滴度的定量。
披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
本工作部分由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助项目编号为 R01 A1064826-01、U19 AI062627-01 和 NO1-HHSN26600500032C（授予 S.M.）。我们感谢实验室成员提供的讨论和技术支持，感谢 Tina Heil 对稿件的审阅。我们还要感谢 David Bina 及密尔沃基卫生局实验室在病毒培养和 PCR 检测方面提供的帮助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 牛血清白蛋白 | Atlanta Biologicals | S11750 | |
| PR8 病毒 | 来自 Dr Thomas M Moran | ||
| 山羊抗小鼠 IRDye@800 | LI-COR Biosciences | 926-32210 | 1:200 稀释 |
| LI-COR Odyssey 红外扫描仪 | LI-COR Biosciences | 9201-01 | |
| 384 孔平底板 | Nalge Nunc International | 164730 | |
| 96 孔平底板 | Nalge Nunc International | 165305 | |
| DMEM 培养基 | Invitrogen | 11965126 | |
| RPMI 培养基 | Invitrogen | 11875135 | |
| 碳酸氢钠 | Invitrogen | 25080 | |
| L-谷氨酰胺 100x | Invitrogen | 25030 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Invitrogen | R001100 | |
| 丙酮酸钠 | Invitrogen | 11360070 | |
| 抗 M-2 抗体 | 来自 Dr Thomas M Moran | ||
| 抗 NP 单克隆抗体 | CDC | V2S2208 | 通过 MTA 获得 |
参考文献
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- Kalter, S. S. Hemagglutinating Behavior of Mouse and Egg-adapted Type A (PR8) Influenza Virus. Science. 110, 184-184 (1949).
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