本文描述了首个符合药品生产质量管理规范（GMP）的从脐带血中制备病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的方法，脐带血是主要含有初始T细胞的来源。
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摘要
摘要
干细胞移植后发生的病毒感染是导致死亡的最常见原因之一，尤其是在脐带血（CB）移植（CBT）后，因为脐带血中不含有足够数量的具有抗病毒经验的T细胞，无法保护受者免于感染。1-4 我们及其他研究者已证实，从血清学阳性供者体内产生的病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）输注给受者是安全且具有保护作用的。5-8 然而，直到最近，人们仍无法从脐带血中生成病毒特异性的T细胞，这很可能是因为脐带血中缺乏病毒特异性的记忆T细胞。
为了更好地模拟 体内 为促进初始T细胞的活化条件，我们建立了一种方法，该方法使用经携带免疫优势CMV抗原pp65的腺病毒载体（Ad5f35pp65）转导的脐带血来源的树突状细胞（DC），从而引导T细胞特异性靶向CMV和腺病毒。9 在启动阶段，我们使用这些成熟的树突状细胞以及脐带血来源的T细胞，并在细胞因子IL-7、IL-12和IL-15存在的情况下进行培养。10 在第二次刺激时，我们使用表达潜伏期和裂解期EBV抗原的EBV转化B细胞（EBV-LCL）。第二次刺激时，采用经Ad5f35pp65转导的EBV-LCL在IL-15存在下刺激T细胞。后续刺激则使用经Ad5f35pp65转导的EBV-LCL和IL-2。
从50×106个脐带血单个核细胞出发，我们能够扩增出超过150×106个病毒特异性T细胞，这些细胞可在抗原刺激下裂解抗原致敏的靶细胞并释放细胞因子11。这些细胞按照符合GMP标准的工艺制备，仅使用了一份经分离的脐带血单位的20%组分，并已成功转化用于临床应用。
方案
1. 单个核细胞分离（第0天）
- 将雌性鲁尔接头的插头插入脐带血单位20%组分的出口端口，连接注射器并抽出血液。将解冻后的血液转移至含有20 mL预热RPMI的50 mL离心管中。用5 mL RPMI冲洗脐带血袋，并将冲洗液转移至同一离心管中。
- 以400 × g离心10分钟。吸除上清液。
- 用20 mL温热RPMI重悬细胞。将细胞层加至含15 mL Lymphoprep的50 mL离心管中。以400 × g离心40分钟。
- 收集含有单个核细胞的界面层，并用20 mL RPMI洗涤。以450 × g离心10分钟。
- 吸除上清液，再用20 mL RPMI洗涤。计数细胞后，以400 × g离心5分钟。
- 吸除上清液，将细胞重悬于Cellgenix DC培养基（无血清）中，浓度为5 × 106 个单个核细胞/mL。取出1 mL用于EBV-LCL的制备，转移至15 mL离心管中。
2. 树突状细胞的生成（从第0天开始）
- 将2 mL细胞（浓度已为5 × 106 个细胞/mL DC培养基）接种至6孔板的每个孔中，放入培养箱孵育1–2小时。
- 孵育1–2小时后，用PBS洗涤3–4次以去除未贴壁细胞。收集未贴壁细胞并冻存。每孔加入2 mL含1000 U/mL IL-4和800 U/mL GM-CSF的DC培养基。
- 树突状细胞（DC）诱导后第3–4天，通过每孔加入100 μL培养基补充细胞因子，使IL-4终浓度为1000 U/mL，GM-CSF终浓度为800 U/mL。
- 第5–6天，用移液管刮取孔内细胞以收获DC。计数大细胞，以400 × g离心5分钟。吸除上清液，将DC重悬于DC培养基中，调整细胞密度为2 × 106 个细胞/mL，每孔加入0.5 mL至24孔板。
- 使用Ad5f35pp65载体以每个细胞10个感染单位的MOI转导DC。将载体加入24孔板的各孔中，孵育细胞1.5小时。1.5小时后，每孔加入1.5 mL含以下成分的DC培养基：1000 U/mL IL-4、800 U/mL GM-CSF、10 ng/mL TNF-α、1 μg/mL PGE-1、100 ng/mL IL-6和10 ng/mL IL-1β。这些细胞因子可诱导DC成熟。
3. EBV-LCL 的制备（从第 0 天开始）
- 离心含有5 × 106个单个核细胞的离心管。加入200 μL浓缩的EBV B95.8上清液和1.8 mL含环孢素（1 μg/mL）的完全培养基（RPMI + 10% FBS + 2 mM L-谷氨酰胺）。
- 将细胞以每孔100 μL分装至96孔板中的10个孔，每孔200 μL分装至5个孔。向仅含有100 μL细胞的孔中加入100 μL完全培养基+环孢素。其余孔中加入无菌水。
- 每周更换LCL培养基，并在约2周后将细胞从96孔板扩增至24孔板。再过一周后转移至T25培养瓶，随后一周转移至T75培养瓶。在此阶段建议冻存LCL的分装样品。通常需要1个月时间获得足够数量的LCL。
4. CTL 启动——树突状细胞启动后第7天
- 收集DC细胞，并以30 Gy剂量照射。洗涤4次后计数。将DC细胞重悬于含人血清的T细胞培养基中（45% RPMI，45% CLICK's，10%人血清，2 mM L-谷氨酰胺），浓度为1 × 105 个DC细胞/mL。
- 解冻步骤2.2中获得的非贴壁细胞。洗涤细胞并计数。将非贴壁细胞以2 × 106 个细胞/mL的浓度重悬于含人血清的T细胞培养基中，加入10 ng/mL IL-7和IL-12，以及5 ng/mL IL-15。每孔加入1 mL细胞悬液至24孔板中，每孔再加入1 mL DC细胞。将24孔板中未使用的孔加入无菌水填充。
- T细胞培养启动7天后，用含人血清的T细胞培养基对细胞进行换液和/或传代。
- T细胞培养启动后9–12天，将T细胞冻存，直至LCL细胞准备就绪。
- 当LCL细胞扩增并在T75培养瓶中传代后，通过以400 × g离心5分钟收集LCL细胞。将病毒载体以每细胞100个感染单位的MOI加入细胞沉淀中，孵育1.5小时。1.5小时后，将细胞重悬于完全培养基中，浓度为5 × 105 个LCL/mL，每孔加入2 mL至24孔板中。12
- 2天后，收集LCL细胞并以40 Gy剂量照射。洗涤4次后计数。将LCL细胞以2.5 × 105 个细胞/mL的浓度重悬于含人血清的T细胞培养基中，每孔加入1 mL至24孔板。同时，将5 × 106 个LCL细胞加入Grex40培养装置，并加入5 ng/mL IL-15。13
- 收集T细胞，以400 × g离心5分钟，吸除上清液，将T细胞重悬于含人血清的T细胞培养基中，浓度为1 × 106 个T细胞/mL。加入5 ng/mL IL-15，每孔加入1 mL T细胞悬液（共1 × 106 个T细胞）至已置于24孔板中的LCL细胞中。在Grex40装置中，将培养基总体积补至30 mL。
- 刺激后第3–4天，若细胞已汇合，则按1:1比例在培养板中传代，并加入含50 U/mL IL-2的新鲜培养基；若未汇合，则吸除一半培养基，更换为含50 U/mL IL-2的新鲜培养基。在Grex40装置中，吸除一半培养基，补充新鲜培养基，并加入50 U/mL IL-2。
- 第7天重复步骤4.6的操作，但在刺激当天使用IL-2，而非IL-15。
5. 代表性结果
符合药品生产质量管理规范（GMP）且经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的生产工艺流程示意图见图1。该过程大约需要50天。生成病毒特异性T细胞的常规方法是扩增体内已存在的记忆T细胞；然而，脐带血中缺乏接触过病毒的T细胞，因此我们需要在体外激活初始T细胞。为此，我们使用树突状细胞以及白细胞介素IL-7、IL-12和IL-15，这些细胞因子对于诱导病毒特异性至关重要。
经过3次刺激后，细胞产量应超过100×106个。如果细胞数量不足，可进行额外的刺激，直至获得所需数量的CTL细胞。这些细胞中大多数应为CD3+，并含有CD4+和CD8+ T细胞的混合群体。NK细胞（CD3-/CD56+）比例应低于15%，CD19+ B细胞比例应低于1%（图2）。
扩增后的CTL应能识别来自CMV的pp65抗原、来自腺病毒的六邻体（hexon）和五邻体（penton），以及在EBV-LCL上表达的多种EBV抗原。在ELISPOT实验中，CTL对这些抗原刺激产生的IFN-?分泌量应高于对无关抗原的反应（图3）。
CTL 还应裂解病毒肽段致敏的靶细胞，例如 PHA 激活的淋巴细胞。在 51Cr 释放实验中，CTL 应裂解 LCL 细胞、CMVpp65 致敏的靶细胞以及腺病毒六邻体和/或五邻体致敏的靶细胞，但不应裂解致敏了无关肽段的靶细胞（图 4）。
图1. 从脐带血中生成多病毒特异性CTL。示意图展示了从脐带血制备CTL的整个过程。首先，从经分离的脐带血单元的20%组分中分离脐带血单个核细胞。除保留5×106个细胞用于LCL生成外，其余细胞均接种于树突状细胞培养基中，培养1-2小时后收集非贴壁细胞并冻存。随后，向树突状细胞（DC）中加入含有IL-4和GM-CSF的DC培养基。经过5天培养后，DC成熟，并用携带免疫优势CMV抗原pp65的腺病毒载体进行转导。在初始刺激时，这些DC与非贴壁细胞以及细胞因子IL-7、IL-12和IL-15共同培养。在后续的刺激中，使用相同的腺病毒载体转导EBV-LCL，作为抗原呈递细胞。第二次刺激时使用IL-15，之后则使用IL-2。
图 2。 所得 T 细胞的表型。图中显示被纳入淋巴细胞门的活细胞所占百分比。细胞毒性 T 淋巴细胞（CTL）为 CD3+ 且 CD4+ 或 CD8+，但主要为 CD3-/CD56- 和 CD19-。
图3。 T细胞功能。通过IFN-γ ELISPOT检测T细胞特异性。T细胞用覆盖六邻体（hexon）、五邻体（penton）、pp65以及无关抗原IE-1全长蛋白的重叠肽段进行刺激。CTL alone表示仅含培养基。自体LCL经照射后以每孔1×105个细胞加入。图中显示的是三复孔的平均斑点形成细胞数。
图 4. CTL 的细胞毒活性。通过51Cr 释放实验检测所获得的 CTL 裂解表达病毒抗原靶细胞的能力。将重叠肽段（覆盖整个抗原序列）刺激的51Cr 标记自体 PHA 活化淋巴母细胞，或51Cr 标记的自体 LCL 与 CTL 共同培养。培养 4 小时后，使用γ计数器测定释放的放射性。
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讨论
目前旨在控制脐带血移植（CBT）后病毒感染的策略可能有效，但常伴随显著的毒性，费用昂贵，且无法提供针对后续感染的长期保护。事实上，某些抗病毒药物的使用可能会限制原本具有保护作用的病毒特异性T细胞的扩增。14 另一种选择是输注供体来源的病毒特异性T细胞。我们及其他研究团队已证实，这类T细胞具有良好的安全性、有效性且成本效益较高。15-17 本文中，我们证明该方法也可拓展应用于脐带血。
培养人原代细胞时，必须使用无菌技术。由于T细胞具有初始状态的特性，因此在所有需要血清的培养基中都应使用人血清。根据我们的经验，含胎牛血清（FBS）的产品会导致T细胞大量扩增，这些T细胞靶向识别由FBS衍生的蛋白质。
使用Ficoll梯度分离单个核细胞时，常常难以完全去除红细胞，因为许多红细胞含有细胞核，且不会被红细胞裂解缓冲液裂解。如果红细胞数量过多，可对产物重新进行Ficoll梯度离心。
尽管本方法目前仅限于扩增病毒特异性T细胞——即巨细胞病毒（C...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到了丹·L·邓肯合作研究基金（C.M.B 和 E.J.S）、美国国家心肺血液研究所（US4HL081007）、白血病与淋巴瘤学会临床研究学者奖（C.M.B）以及美国国家癌症研究所（RO1 CA06150816；E.J.S）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | Invitrogen | 21870-076 | |
| DC 培养基 | CellGenix | 20801-0500 | |
| EHAA（点击’s 培养基) | Irvine Scientific | 9195 | |
| 人血清 | 杰明尼生物产品 | <强>100-110<强> | |
| 透气性培养器具18 | Wilson Wolf Manufacturing | 80040S | |
| IL-2 | 奇龙（TCH 药房） | ||
| IL-12 | 美国国家癌症研究所 | ||
| IL-15 | CellGenix | 1013-050 | |
| IL-7 | R&D Systems | AFL207 | |
| IL-1β | R&D Systems | AFL201 | |
| IL-6 | CellGenix | 1004-050 | |
| GM-CSF | TCH 药房 | ||
| IL-4 | R&D Systems | AFL204 | |
| TNF-α | R&D Systems | AFL210 | |
| Ad5f35pp65 | BCM CAGT 载体生产设施 | ||
| 带雌性鲁尔接头适配器的血浆转移套装 | 查特医疗 | 89-550-66j | |
| Lymphoprep | Nycomed | 1114550 |
参考文献
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