方法文章

体外 组装半人工分子机器及其在DNA损伤检测中的应用

DOI：

10.3791/3628

⸱

2012年1月11日

 , 
1Neurosurgery, Baylor College of Medicine , 2Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center, 3Molecular & Cellular Biology, Baylor College of Medicine

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们展示了由拓扑异构酶蛋白驱动的分子级装置的组装与应用。该构建体是一种生物分子传感器，通过将两种不同的荧光染料连接到组织切片中两类主要DNA断裂的末端，实现对其标记。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

天然存在的生物分子机器存在于每一个活细胞中，并展现出多种多样的结构设计1-6。然而，人工分子机器的发展主要集中于能够实现定向运动的装置，即分子马达，以及其微型化的机械部件（如轮子、轴、悬臂等）7-9。这种设计模仿了宏观机器，尽管对于这些装置至关重要的物理特性，如惯性和动量守恒，在纳米尺度环境中并不适用10。相比之下，采用生物分子在进化过程中形成的机制、而非遵循宏观机械装置模式的替代性设计，能够更好地利用纳米世界的特有环境条件。此外，将真实的生物分子用于纳米设计，有助于降低纳米技术产品可能带来的潜在风险。本文中，我们展示了一种此类生物功能化结构的组装及其应用：一种半人工分子装置，它将天然存在的分子机器与人工组分相结合。从酶学角度来看，该结构是一种设计型荧光酶-底物复合物，被构建用于执行特定的有用功能。根据定义，这一组装体属于分子机器，因其包含一个分子机器单元12。然而，通过与工程化部分——荧光双发夹结构——的整合，该分子机器被重新定向，用于标记DNA损伤12。

我们的构建体由一条32-mer DNA和一种酶——痘苗病毒拓扑异构酶I（VACC TOPO）组装而成。该体系随后利用自身材料生成两个带有荧光标记的检测单元（图1）。其中一个单元（绿色荧光）在其3'端共价连接有VACC TOPO，另一个单元（红色荧光）则为带有末端3'OH的游离发夹结构。这些单元寿命较短，会迅速重新组装回原始构建体，并随之再次发生切割。在无DNA断裂的情况下，这两个单元以循环方式持续分离与重新连接。在存在DNA损伤的组织切片中，携带拓扑异构酶的检测单元可选择性地结合于具有5'OH的平末端DNA断裂（DNase II型断裂）。11,12，对其进行荧光标记。第二个在寡核苷酸切割后形成的无酶发夹结构，将连接至一个5'PO4 钝端断裂（DNase I型断裂）11,12，如果溶液中存在T4 DNA连接酶 13,14 当T4 DNA连接酶被添加到组织切片或含有5'磷酸基团DNA的溶液中时4 钝端断裂，连接酶与5'PO反应4 DNA末端形成半稳定的酶-DNA复合物。平末端的发夹结构将与这些复合物相互作用，释放连接酶并将发夹共价连接至DNA，从而标记5'PO4 平末端DNA断裂

这一进展展示了一种设计分子机器的新颖实用方法，并为检测固定细胞和组织中的细胞凋亡与DNA损伤提供了一种有用的传感器。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

应首先制备基于分子机器检测的组织切片，因为其制备所需时间长于分子装置的组装。该构建方法适用于从多聚甲醛固定、石蜡包埋的组织块中切取的5-6 μm厚切片。建议使用对切片附着效果良好的载玻片品牌，例如ProbeOn Plus带电且预清洁载玻片（Fisher Scientific）或类似产品。我们建议初次实验时采用DNA损伤模式明确且同时含有DNase I型和DNase II型断裂的组织，例如地塞米松处理后发生凋亡的大鼠胸腺组织13,14。

1. 切片制备

  1. 将切片置于载玻片架中，用二甲苯脱蜡15分钟，然后转移至新鲜的二甲苯溶液中再处理5分钟。
  2. 通过梯度乙醇溶液进行水化：96%乙醇，2次，每次5分钟；80%乙醇，5分钟；蒸馏水，2次，每次5分钟。
  3. 用蛋白酶K消化切片。每张切片使用100 μL浓度为50 μg/mL的蛋白酶K溶液。在湿盒中室温（23°C）孵育15分钟。孵育时间可能需根据组织类型进行调整，硬组织可能需要更长的消化时间，通常使用15–25分钟。消化不足可能导致信号减弱，而过度消化则会导致信号消失及切片破坏。
  4. 用蒸馏水冲洗，每次10分钟，共2次。
  5. 每张切片加入100 μL的2% BSA溶液进行预封闭，室温（23°C）孵育15分钟。在此期间组装分子装置。

2. 分子机器的组装

所有试剂的用量均按25 μL的总体积计算，足以用于一个平均尺寸组织切片（10×10 mm）的单次检测。可根据需要按比例放大体积。

  1. 按以下顺序在小型塑料管中混合：
  1. 双蒸水；
  2. 15% 聚乙二醇-8000；
  3. 66 mM Tris HCl（pH 7.5）、5 mM MgCl2、0.1 mM 二硫赤藓糖醇、1 mM ATP 的溶液（即常规 T4 DNA 连接酶缓冲液）；
  4. 70 pmol 寡核苷酸 1；
  5. 215 pmol（1.76–7.1 μg）VACC TOPO；
  6. 10 单位 T4 DNA 连接酶（500 U/mL）
  1. 通过移液轻轻混匀。该分子结构在此溶液中几乎立即自发组装，可在室温（23°C）下立即使用。将温度升至37°C会阻断基于T4 DNA连接酶的标记组分。

3. 利用分子机器在组织切片中对5'OH和5'PO4 DNA断裂进行双重标记

  1. 吸去预封闭液，加入25μL完全反应混合液，其中包含70 pmol寡核苷酸1、53–215 pmol（1.76–7.1 μg）VACC TOPO以及10单位T4 DNA连接酶（500 U/mL），溶于以下溶液中：66 mM Tris HCl（pH 7.5）、5 mM MgCl2、0.1 mM二硫赤藓醇、1 mM ATP和15%聚乙二醇-8000。也可使用携带单个FITC标记的相同序列寡核苷酸（寡核苷酸2）替代，用于检测单一类型的DNA断裂。在此情况下，标记反应中应省略连接酶。此外，此时可使用50 mM Tris-HCl（pH 7.4）、15% PEG-8000溶液替代T4 DNA连接酶缓冲液。
  2. 在加湿 chamber 中，以塑料盖玻片覆盖，室温（23°C）孵育1小时，避光。将温度降至16°C会降低基于连接酶的信号；温度升至37°C则完全消除基于连接酶的信号。有时反应混合液中会出现连接酶的部分抑制，可能与拓扑异构酶制备过程中引入的污染物有关。因此，当存在大量连接酶标记的断裂时，可能需要更长的孵育时间（2–4小时）。尽管在此阶段可同时观察到连接酶和拓扑异构酶信号，但在许多情况下，可通过重新加入不含VACC TOPO和双标记寡核苷酸、但含有发夹结构寡核苷酸（寡核苷酸3）（35 mg/mL）及T4 DNA连接酶（250 U/mL）的反应混合液进一步增强连接酶信号。如需增强信号，请进入步骤3；如需观察未经增强的反应结果，请进入步骤5。
  3. 将载玻片垂直轻轻浸入盛有室温水的考普林瓶中，取下盖玻片。吸去多余水分。
  4. 通过加入25 μL反应混合液增强连接酶信号，该混合液不含VACC TOPO和寡核苷酸1，但包含寡核苷酸3：66 mM Tris HCl（pH 7.5）、5 mM MgCl2、0.1 mM二硫赤藓醇、1 mM ATP、15%聚乙二醇-8000、5单位T4 DNA连接酶和35 mg/mL寡核苷酸3（平末端发夹结构）。标记溶液的总体积可根据较大组织切片的需要相应放大。在加湿 chamber 中，以塑料盖玻片覆盖，室温（23°C）孵育18小时（过夜）。
  5. 将载玻片垂直轻轻浸入盛有室温水的考普林瓶中，取下盖玻片。随后用蒸馏水洗涤切片3次，每次10分钟。
  6. 用碳酸氢钠缓冲液漂洗。碱性溶液漂洗可增强FITC荧光，因FITC荧光具有pH敏感性，在pH低于7时显著减弱。
  7. 用抗荧光淬灭封片剂（含DAPI的Vectashield）覆盖切片，加盖盖玻片，并使用荧光显微镜分析信号。具有5'OH的双链DNA断裂呈绿色荧光，具有5'PO4的断裂呈红色荧光（图2）。

4. 代表性结果

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图1。 半人工分子机器可检测两种类型的DNA损伤 原位荧光机器在VACC TOPO结合双发夹结构的32聚体时自发组装。机器通过拓扑异构酶在识别序列3'端进行切割，分裂成两个检测单元，从而启动运行。由此形成一个循环过程：FITC标记单元持续与罗丹明标记单元分离并重新连接。此循环持续进行，直至遇到可检测的DNA断裂。当组织切片中存在替代受体（即5'OH平末端DNA断裂）时，FITC部分将连接至该断裂位点。剩余的罗丹明部分则连接至5' PO4 在T4 DNA连接酶的帮助下，检测DNA平末端断裂。因此，可同时检测两种类型的DNA断裂。

figure-protocol-2

图2. 分子机器双重标记地塞米松处理胸腺组织切片中的两类DNA断裂。在发生凋亡的胸腺皮质区域，可检测到DNase I型和DNase II型的平末端DNA断裂。绿色胞质荧光（5'OH DNA断裂）标记正在消化凋亡胸腺细胞核物质的皮质巨噬细胞。该信号由VACC TOPO产生，定位于含有5'OH双链断裂DNA的吞噬溶酶体11,12。红色荧光（5'PO4断裂）标记尚未被巨噬细胞吞噬的凋亡胸腺细胞的细胞核。大量胸腺细胞同时发生凋亡，并伴随产生5'PO4双链断裂，可通过基于连接酶的标记技术可视化。这些断裂位于细胞核边缘，呈现环状模式。所有细胞核通过DAPI复染（蓝色荧光）显示。

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在本视频中，我们演示如何组装和使用一种双标记DNA损伤传感器。该传感器是一种由生物分子引擎驱动的分子机器，其核心为病毒编码蛋白VACC TOPO，并与人工组件相连接。本项开发展示了一种基于生物赋能的设计方法，主张利用细胞的生物结构、构架以及实际的组成部分，用于构建无毒性的分子级装置。 12,15该方法解决了该领域内固有的两个问题 体内 纳米传感器：1. 使用传统纳米材料难以制备真正均一且可重复的纳米结构；2. 纳米探针、纳米颗粒及其他高度分散的纳米材料可能具有毒性及较高的生物反应性。 该传感器将天然存在的分子机器与人工组分相结合，使其重新定向执行DNA损伤标记的新功能。这种整合的产物是一种针对新任务设计的半人工分子机器。尽管拓扑异构酶、聚合酶及其他酶类分子机器在生物化学研究中经常被使用，但它们通常并未与工程化组分整合为独立的分子组装体，因此在常规应用中并不作为半人工装置使用。 12.

本文展示了如何使用组织切片形式的传感器同时标记DNase I型和DNase II型断裂。目前尚无其他方法可用于实现此类同步双...

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致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究获得了美国国立神经疾病与卒中研究所、美国国立卫生研究院（V.V.D.）的R01NS062842资助，以及通过美国复苏与再投资法案（ARRA）获得的美国国立神经疾病与卒中研究所、美国国立卫生研究院R21 NS064403资助（V.V.D.），同时还获得了美国国立生物医学成像与生物工程研究所、美国国立卫生研究院R21 EB006301的资助（V.V.D.）。

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参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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标签

DNA K T4 DNA

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