串联亲和纯化是一种用于鉴定蛋白质结合伴侣的可靠方法。作为概念验证，该方法已应用于研究较为深入的翻译起始因子 eIF4E，以共沉淀参与翻译起始的宿主细胞因子。此方法可轻松适用于任何细胞或病毒蛋白。
本文内容
摘要
摘要
理解宿主蛋白和病毒蛋白功能的关键步骤，同时也是常受限的环节，是鉴定与其相互作用的细胞或病毒蛋白伴侣。目前已有多种方法可用于鉴定相互作用的蛋白伴侣，包括酵母双杂交系统、利用重组蛋白进行下拉实验，以及通过免疫沉淀内源性蛋白后结合质谱分析进行鉴定1。近期研究强调了双亲和标签介导的纯化方法在相互作用蛋白鉴定中的优势，该方法结合两个特异性的洗脱步骤。这种被称为串联亲和纯化（Tandem Affinity Purification, TAP）的方法最初应用于酵母2,3，但近年来已逐步改进并适用于哺乳动物细胞4-8。
作为概念验证，我们建立了一种串联亲和纯化（tandem affinity purification, TAP）方法，使用了已被充分表征的真核翻译起始因子 eIF4E9,10。细胞翻译因子 eIF4E 是细胞内 eIF4F 复合物的关键组分，参与帽依赖性翻译起始过程10。本研究中使用的 TAP 标签由两个 Protein G 单元和一个链霉亲和素结合肽组成，二者之间由烟草蚀刻病毒（Tobacco Etch Virus, TEV）蛋白酶切割序列分隔8。为了避免需要构建克隆细胞系，我们开发了一种快速系统，该系统依赖于基于 pMEP4（Invitrogen）质粒的附加体载体来表达带有 TAP 标签的诱饵蛋白。该质粒中标签化的小鼠 eIF4E 表达由氯化镉诱导的金属硫蛋白启动子进行调控。
通过裂解表达细胞，并依次进行兔IgG琼脂糖亲和纯化、TEV蛋白酶切割、链霉亲和素偶联琼脂糖结合以及生物素洗脱，鉴定出大量明显特异性结合于eIF4E的蛋白（与仅表达TAP标签的对照细胞系相比）。这些蛋白的身份通过从一维SDS-PAGE凝胶中切取蛋白条带并进行串联质谱分析而获得。鉴定出的组分包括已知的eIF4E结合蛋白eIF4G和4EBP-1。此外，还鉴定出eIF4F复合物的其他组分（eIF4E本身是该复合物的一部分），即eIF4A和多聚腺苷酸结合蛋白。该方法不仅能够鉴定已知的直接结合伙伴，还能识别次级相互作用蛋白，进一步凸显了其在功能未知蛋白表征中的应用价值。
方案
1. 细胞系的建立：pMEP4 转染/表达
- 使用 pMEP4 表达载体转染细胞，并用 100 μg/mL 的潮霉素 B（Roche）进行筛选，直至所有未转染的对照细胞全部死亡。pMEP4 质粒以附加体形式维持，因此无需分离特定克隆。
- 含有 pMEP4 载体的细胞可通过 10 μM CdCl2 处理 16 小时进行诱导。在扩增细胞系之前，应先在小规模实验中验证蛋白的表达及可诱导性。TAP 标签蛋白可被 readily 检测，因为蛋白 G 结构域几乎可结合所有物种来源的抗体。进行大规模纯化时，通常需要 10 个汇合的 175 cm2 培养瓶的细胞，相当于约 2 × 108 个表达细胞。
2. 细胞裂解液的制备
- 用 PBS 刮取细胞，并收集至一个 50 ml 离心管中。1200×g 离心 5 分钟（初始细胞沉淀体积约为 2–3 ml，经洗涤后减少至约 1.5 ml）。
- 用预冷的 PBS（每次 50 ml）清洗细胞三次。
- 在 5 ml 裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 125 mM NaCl, 5% 甘油, 0.2% NP-40, 1.5 mM MgCl₂）中裂解细胞2，25 mM NaF，1 mM Na3VO4 和蛋白酶抑制剂）。注意：NaF、Na3VO4 并应新鲜加入蛋白酶抑制剂。冰上放置5分钟前，用移液器上下吹打10次。使用钝头针将样品来回推注5至10次，然后再次于冰上放置5分钟。重复推注操作，并继续在冰上静置5分钟。
- 将裂解液进行两次冻融（液氮）2 / 或干冰和乙醇）。切勿使样品温度升至高于 4°C注意：可将此样品在 -80°C 直到你有时间进行处理。
- 将样品分装至1.5 ml离心管中，通过离心去除未裂解的细胞和碎片（10分钟， 4°C，16,000×g。
- 回收上清液，合并至一个15 ml离心管中，并（可选）通过一个 0.45 μm 过滤后再取样 20 μl 用于蛋白质产量定量的样品。再移除一部分 50 μl 用于后续分析的等分试样（样品 1）。
3. 与兔 IgG-琼脂糖结合
（注意：除非另有说明，所有离心步骤均应在4°C的冷藏离心机中以1200×g离心1分钟）
- 轻轻旋转瓶身，使兔 IgG-琼脂糖溶液（Sigma-Aldrich）重悬。用剪去尖端的 1 ml 枪头吸取 380 μl IgG 琼脂糖，通过离心（1 分钟）去除运输/保存液。用预冷的裂解缓冲液（4°C）洗涤琼脂糖三次，每次均通过离心澄清。最终获得的琼脂糖沉淀体积约为 250 μl。
- 将步骤 2.6 中获得的澄清细胞裂解液（置于 15 ml 圆底离心管中）加入经洗涤的兔 IgG-琼脂糖中，于 4°C 在旋转混合仪上孵育 3 小时（或过夜）。
- 在 4°C 下离心 5 分钟，沉淀琼脂糖珠，弃去上清液用于后续分析（样品 2）。注意：TAP 标签蛋白此时应已结合于珠上。
4. TEV 蛋白酶切割
（注意：除非另有说明，所有离心步骤均应在4°C条件下，以1200×g的转速在预冷的离心机中离心1分钟）
- 用预冷的裂解缓冲液（4°C）通过离心洗涤兔 IgG 琼脂糖珠三次（注意：裂解缓冲液中不应含有蛋白酶抑制剂）。洗涤过程中应小心操作，避免移除或丢失任何珠子。
- 使用 TEV 蛋白酶切割缓冲液（10 mM Tris-HCl（pH 7.5）、100 mM NaCl 和 0.2% NP-40）进一步洗涤珠子两次，每次均通过离心澄清。最后一次洗涤后，小心吸除珠子中的所有液体。
- 配制 TEV 蛋白酶切割反应液；每份样品加入 467.5 μl H2O、25 μl 20x TEV 缓冲液（Invitrogen）、5 μl 0.1 M DTT 和 2.5 μl（25 U）TEV 蛋白酶（Invitrogen）。将 500 μl 该 TEV 切割反应液加入每份已压紧的珠子样品中，并将全部混合物转移至一个 1.7 ml 预润滑的离心管（Costar）。在孵育前，取出 30 μl 等分试样用于后续分析（样品 3）。
- 将 TEV 蛋白酶反应体系在 4°C 下旋转孵育过夜。注意，根据诱饵蛋白的性质及 TEV 蛋白酶切割位点的可及性，可采用较短的孵育时间，但最短孵育时间需通过实验确定。
5. 与 Ultralink 固定化链霉亲和素 Plus 琼脂糖微珠的结合
（注意：除非另有说明，所有离心步骤均需在4°C条件下，以1200×g离心1分钟）
- 将含有兔IgG琼脂糖珠的TEV切割反应物在1200 × g离心5分钟4°C）。移除一个 20 μl 用于分析的澄清上清液等分试样（样品4）
- 转移剩余的上清液（约 480 μl)转移至一个新的1.5 ml预润滑离心管（Costar）中，并置于冰上。请勿丢弃此上清液——其中含有TEV蛋白酶切割后的诱饵蛋白及任何与其结合的相互作用蛋白。
- 添加 500 μl 加入预冷的裂解缓冲液（第2.3节）至剩余的兔IgG琼脂糖珠中，重悬。离心该混合物以澄清珠子，弃上清后与步骤5.2所得上清合并。将此管置于冰上（此时体积应约为~）980 μl 样品量）。
- 保留兔IgG琼脂糖珠用于后续分析（样品5）。注意：如果将此样品进行SDS-PAGE凝胶电泳（或Western印迹），由于存在IgG重链和轻链，会产生较强的背景信号。
- 同时，轻轻旋转Pierce公司的Ultralink Immobilized Streptavidin Plus琼脂糖珠试剂瓶，温和重悬珠子。使用一根 200 μl 末端切开的移液器吸头，分装 70 μl 每份样品取链霉亲和素磁珠加入预先润洗的1.5 ml离心管中，通过离心去除运输/保存液。注意：这些磁珠体积非常小，因此洗涤过程中可使用“鸭嘴形”或扁平/窄口吸头以尽量减少磁珠损失。
- 用预冷的裂解缓冲液洗涤链霉亲和素珠三次（4°C) 通过离心澄清。此步骤后应剩余约 45-50 μl 每管装填的珠子
- 将TEV蛋白酶切割后的上清液（即 980 μl 将第5.3步的样品加入含有洗涤后链霉亲和素磁珠的离心管中，于3小时（或过夜）孵育 4°C 使用旋转混匀仪。
- 将链霉亲和素磁珠离心5分钟 4°C 并移除上清液用于后续分析（样品6）。用预冷的裂解缓冲液洗涤链霉亲和素珠三次（4°C) 通过离心澄清。最后一次洗涤后，小心移除 全部 剩余洗涤缓冲液
6. 链霉亲和素结合肽及诱饵蛋白的生物素洗脱
（注意：除非另有说明，所有离心步骤均应在4°C条件下，于冷冻离心机中以1200×g离心1分钟）
- 向链霉亲和素磁珠中加入 500 μl PBS:Biotin（1 mM D-生物素），在 4°C 下使用旋转混合器孵育 3 小时（或过夜），以洗脱标记的蛋白质。
- 在 4°C 下离心 5 分钟，沉淀链霉亲和素磁珠，并将上清液转移至一个预先润滑的 1.5 ml 离心管中（注意：此即为最终样品/洗脱液（样品 7））。
- 向剩余的链霉亲和素磁珠中再加入 500 μl Biotin:PBS，在 4°C 下使用旋转混合器孵育 2–3 小时（或过夜）。
- 重复步骤 6.2，并将两次洗脱液合并（样品 7）。此最终洗脱液可在 -80°C 下保存。
- 为评估生物素洗脱的效率，将剩余的链霉亲和素磁珠冷冻，随后在 SDS 样品缓冲液中煮沸（样品 8）（推荐使用：Fisher 公司的 LaneMarker 5x 还原性样品缓冲液）。
7. 蛋白质浓度
- 由于最终洗脱液（样品 7）蛋白质浓度较低且体积相对较大，因此在分析前需要进行浓缩。可使用低分子量（<5 KDa）Vivaspin 离心柱（Vivascience）进行浓缩，目标是将体积浓缩至小于 100 μl。该最终样品可在蛋白上样缓冲液中煮沸后保存（推荐使用：Fisher 公司的 LaneMarker 5x 还原性上样缓冲液）。
8. 分析
- 可通过蛋白质印迹分析样品1-8，以确定下拉实验的效率。注意：大多数二抗会与融合蛋白中的Protein G结构域发生交叉反应，但在TEV蛋白酶切割后该融合标签将被去除。
- 可采用一维或二维SDS-PAGE分析样品7。染色可使用银染或考马斯亮蓝染色（推荐使用Invitrogen的SilverQuest银染试剂盒和Colloidal Blue考马斯亮蓝染色试剂盒）。蛋白质鉴定可通过质谱分析进行。
9. 代表性结果
图2展示了通过本方案获得的最终洗脱液（样品7）进行1D SDS-PAGE分析的示例，用于鉴定TAP标签eIF4E的结合伴侣。该代表性凝胶图像反映了eIF4E在细胞内与其他蛋白质相互作用的复杂性和丰富性。与图2中同时展示的阴性对照（来自仅表达TAP标签的细胞系）相比，可说明本eIF4E诱饵蛋白pull-down实验的特异性。在此实验中，取浓缩后的最终洗脱液（样品7）的15%，使用商业化预制梯度凝胶进行1D SDS-PAGE分析，随后采用Invitrogen公司的Silverquest银染试剂盒进行染色。
通常使用胶体考马斯亮蓝染色法（Invitrogen）分析剩余浓缩洗脱液（样品7）的50-85%。然后从整个泳道中切取样品（凝胶条带/切片），并进行质谱分析。
通过将eIF4E下拉实验中鉴定出的蛋白质与阴性对照中的结合蛋白进行比对，排除非特异性结合蛋白。利用eIF4E的TAP标签技术最终鉴定出的蛋白质如图2所示，该图代表了使用此技术通常鉴定出的蛋白质。此外，还鉴定出多个eIF3亚基（数据未显示）。
图 1. 双向亲和纯化流程示意图。 六步双向亲和纯化（TAP）流程包括细胞系构建、细胞裂解、兔 IgG 琼脂糖免疫沉淀、TEV 蛋白酶切割、链霉亲和素磁珠亲和纯化，以及最终的生物素洗脱。
图2. 小鼠eIF4E蛋白的串联亲和纯化。 使用附带的实验方案，从真核HEK293细胞中纯化了N端带有TAP标签的eIF4E的相互作用蛋白。取最终洗脱液的20%（样品7），通过预制的4-12%梯度凝胶进行SDS-PAGE分析（TAP-eIF4E泳道）。同时对仅带标签的对照样本（TAP泳道）进行了相同的分析。蛋白质通过银染法进行检测。同一标本经质谱分析后鉴定出的蛋白质在此凝胶图上已标出。
缩写：eIF4G：真核翻译起始因子4γ，PABP：多聚A结合蛋白，eIF4A：真核翻译起始因子4α，SBP-eIF4e：残留的TAP诱饵蛋白，包含与真核翻译起始因子4E融合的链霉亲和素结合肽，4EBPs：真核翻译起始因子4E结合蛋白，eIF4eNiF1：真核翻译起始因子4E核输入因子1，SBP：TEV未融合TAP肽中残留的链霉亲和素结合肽。
讨论
本文所展示的TAP标签技术是一种在真核细胞中分离诱饵蛋白结合伴侣的高特异性和严格性的方法。该方法可应用于细胞蛋白和病毒蛋白。据我们所知，这是首次将此类技术应用于翻译起始因子eIF4E。利用该技术鉴定出已知的eIF4E结合蛋白eIF4G和4EBPs，证实了该方法的可靠性。此外，还鉴定出了eIF4F复合物的另一个组分eIF4A以及PABP，这表明在纯化过程中间接相互作用和三级复合物仍保持完整。同时，也明显鉴定出经典eIF4E结合蛋白的多种同工型。这些结果在图2中有更详细的描述。
关于该方法的局限性，在选择诱饵蛋白以及确定将TAG标签置于N端还是C端时需格外注意。建议在大规模纯化前，先通过功能实验或显微镜观察融合蛋白的定位，以确认带标签的蛋白衍生物具有正常功能。对于内在膜蛋白或核蛋白，裂解步骤中所描述的相对温和的去污剂条件可能不足以将其充分释放。与所有免疫沉淀及类似的pull-down实验一样，可通过调整裂解缓冲液中去污剂的种类和浓度以提高裂解效率。此外，也可调节裂解缓冲液和洗涤缓冲液的离子浓度，以增强或降低纯化的严谨性。另一种可行方案是：首先在标准温和条件下进行初步纯化（如上所述），随后将链霉亲和素磁珠（第5.8节）分为4–5份等份，再在逐步提高离子强度的条件下分别进行洗涤。该策略有助于使用者确定最佳洗涤条件，从而去除非特异性结合的蛋白质。整个实验流程亦可采用瞬时转染的方式进行，尤其适用于已知相互作用蛋白、且其存在与否可通过后续Western blot检测确认的情况。在此情况下，我们建议使用两皿100 cm2的细胞，每皿转染8 μg表达质粒。该改良方案在研究TAP融合蛋白的突变体衍生物与已知结合伴侣蛋白相互作用能力时尤为适用。
在银染SDS-PAGE凝胶上（或若有可用抗体，可通过Western印迹）分析第1至第8号样品，是当该技术未能产生可接受结果时进行故障排查的极佳方法。通过这种系统性取样方法，可评估每一步亲和沉淀及特异性洗脱的效率。在针对每种新诱饵蛋白优化实验方案期间，应采集第1至第8号样品进行分析。
TAP标签技术为其他方法（如GST沉淀、酵母双杂交实验等）提供了一种强大且稳健的替代方案。双重亲和纯化及特异性洗脱步骤（TEV切割和生物素洗脱）可在整个纯化过程中保持高度的特异性和严谨性。该技术的关键优势在于可应用于任何蛋白质，因此是鉴定目标蛋白质相互作用伙伴的优良方法。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本研究由授予伊恩·古德费洛博士的惠康信托高级研究员奖学金资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 潮霉素 B | Roche Group | 10843555001 | |
| 兔 IgG 琼脂糖 | Sigma-Aldrich | A2909 | |
| AC-TEV 蛋白酶 | Invitrogen | 12575-015 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Calbiochem | 539134 | |
| Ultralink 固相化链霉亲和素 Plus 磁珠 | Pierce, Thermo Scientific | 53116 | |
| Vivaspin 500 离心浓缩管 (5KDa) | Vivaspin | V50112 | |
| SilverQuest 银染试剂盒 | Invitrogen | LC6070 | |
| Novex 胶体蓝考马斯亮蓝染色试剂盒 | Invitrogen | LC6025 | |
| 1.7 ml 预润滑管 | Costar | 3207 | |
| 微量移液器吸头 | VWR international | 37001-150 | |
| NuPage 4-12% Bis-Tris 梯度凝胶 | Invitrogen | NP0322BOX | |
| CdCl2 | Sigma-Aldrich | 202908 | |
| 5x SDS 上样缓冲液 | Fisher Scientific | PN39000 |
参考文献
- Williamson, M. P., Sutcliffe, M. J. Protein-protein interactions. Biochem. Soc. Trans. 38 (4), 875-878 (2010).
- Rigaut, G. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat. Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).
- Blackwell, C., Brown, J. D. The application of tandem-affinity purification to Candida albicans. Methods Mol. Biol. 499, 133-148 (2009).
- Cochrane, A. Stable complex formation between HIV Rev and the nucleosome assembly protein, NAP1, affects Rev function. Virology. 388 (1), 103-111 (2009).
- Fernandez, E. Targeted tandem affinity purification of PSD-95 recovers core postsynaptic complexes and schizophrenia susceptibility proteins. Mol. Syst. Biol. 5, 269-269 (2009).
- Gloeckner, C. J. Tandem affinity purification of protein complexes from mammalian cells by the Strep/FLAG (SF)-TAP tag. Methods Mol. Biol. 564, 359-372 (2009).
- Holowaty, M. N. Protein profiling with Epstein-Barr nuclear antigen-1 reveals an interaction with the herpesvirus-associated ubiquitin-specific protease HAUSP/USP7. J. Biol. Chem. 278 (32), 29987-29994 (2003).
- Burckstummer, T. An efficient tandem affinity purification procedure for interaction proteomics in mammalian cells. Nat. Methods. 3 (12), 1013-1019 (2006).
- Goodfellow, I. Calicivirus translation initiation requires an interaction between VPg and eIF 4 E. EMBO Rep. 6 (10), 968-972 (2005).
- Goodfellow, I. G., Roberts, L. O. Eukaryotic initiation factor 4E. Int. J. Biochem. Cell Biol. 40 (12), 2675-2680 (2008).
重印与许可
