一种简单、高效且稳健的方法，通过同步递送多种病毒组分至植物细胞 农杆菌介导的瞬时表达方法被描述。该方法适用于研究复制、衣壳化，随后的 体外 非病毒组分的重装配，形成基因组耗尽的光学病毒幽灵，适用于生物医学应用。
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摘要
摘要
在感染人类、动物和植物的正链RNA病毒中，子代病毒颗粒被包裹形成成熟且稳定的病毒粒子是其在特定宿主中建立感染的关键阶段。因此，对包裹过程的研究有助于揭示调控病毒组装以形成具有感染性病毒粒子的机制。这类信息对于制定抑制病毒传播和控制疾病的新方法至关重要。病毒包裹过程可被研究 体内 和 体外基因组包装 体内 是一个高度调控的、选择性过程，涉及大分子相互作用和亚细胞区室化。因此，研究病毒衣壳化所涵盖的事件至关重要 体内 将为理解病毒如何增殖和组装提供基础知识。近期 体外 衣壳化已被广泛应用于生物医学成像及治疗领域的研究。在这一探索进程中，非包膜植物病毒处于领先地位 体外 负电荷外源物质的衣壳化。麦芽花叶病毒（Brome mosaic virus, BMV）是一种对植物具有致病性的无包膜多组分RNA病毒，已被用作研究基因组包装的模型系统。 体内 和 体外用于包封实验的 烟草本氏 植物， 农杆菌 介导的瞬时表达，称为农杆菌浸润（agroinfiltration），是一种高效且可靠的同步递送多个组分并在同一细胞中表达的技术。该方法中，将含有相应组分的农杆菌悬浮液 Agrobacterium tumefaciens 将含有目标病毒mRNA cDNA的双元质粒载体导入农杆菌，再利用1 ml一次性注射器（无针头）将其注入植物叶片的细胞间隙。该过程可将DNA插入片段转移至植物细胞内；T-DNA插入片段在细胞核中短暂存在，并由宿主RNA聚合酶II转录，从而实现瞬时表达。所产生的mRNA转录本（具有5'端帽子结构和3'端多聚腺苷酸尾）随后被转运至细胞质中进行翻译。在侵染后约24至48小时，可取侵染区域的叶片组织用于显微观察或生化分析。农杆菌介导的瞬时转化可实现大量细胞（数百至数千个）的同步转染。对于体外衣壳化实验，首先通过透析含有氯化钙的解离缓冲液，将纯化的苜蓿花叶病毒（BMV）病毒颗粒解离为衣壳蛋白，再经离心去除RNA及未完全解离的病毒颗粒。随后，基因组缺失的衣壳蛋白亚基可与目标病毒基因组组分或非病毒组分（如吲哚菁染料）重新组装形成新的病毒样颗粒。
方案
1. 植物材料
- 用于包封实验的Nicotiana benthamiana植株应处于四叶期（约3-4周龄）。
2. 通过农杆菌浸润法将功能性病毒基因组组分递送至植物细胞并实现表达
- 第1天： 将含有 pCass-BMV RNA1、BMV RNA2 和 BMV RNA31,2 的农杆菌菌株（例如 EH105 或 GV3101）接种于添加了 50 mg/ml 卡那霉素（用于筛选 pCASS 载体）和 100 mg/ml 利福平（用于筛选农杆菌）的 LB 琼脂平板上，于 28 °C 培养两天。
- 第3天： 挑取 LB 琼脂平板上的单菌落，接种至含有 50 mg/ml 卡那霉素和 100 mg/ml 利福平的 2 ml LB 液体培养基中，在 28 °C、250 RPM 的摇床中培养1天。
- 第4天： 取1 ml 上述菌液接种至50 ml LB 液体培养基中，培养基中添加有 50 mg/ml 卡那霉素、100 mg/ml 利福平、10 mM MES（pH 5.6）和 100 mM 乙酰丁香酮，置于250 ml 锥形瓶中，在28 °C、250 RPM 的摇床中培养16小时。
- 第5天： 当菌液 OD600 达到1.0时，将培养物转移至橡树岭管或无菌 Falcon 管中，在4 °C、5000 rpm 条件下离心10分钟。
- 将菌体沉淀重悬于10 ml 含10 mM MgCl2 的溶液中，在4 °C、5000 rpm 条件下离心10分钟，重复此步骤一次，以确保完全去除抗生素。
- 将菌体沉淀重悬于10 ml 含10 mM MgCl2 和10 mM MES（pH 5.6）的缓冲液中。
- 分别测定 BMV RNA1、RNA2 和 RNA3 菌液的 OD600，并用含10 mM MgCl2 和10 mM MES（pH 5.6）的缓冲液调整至 OD600 = 0.1。
- 取 OD600 = 0.1 的三种菌液各1 ml，混合均匀。
- 加入乙酰丁香酮至终浓度为100 mM，轻轻混匀，室温静置3小时。
- 将上述菌液混合物吸入1 ml 无针头的注射器中。
- 将注射器轻压至 N. benthamiana 植株（5叶期，3–4周龄）2–3片充分展开叶片的远轴面一侧，进行浸润接种。
- 对其他叶片重复上述浸润操作。
- 将接种后的植株置于24 °C 的温室中培养。
- 接种后3至4天（dpi）采集浸润过的叶片。
3. BMV 病毒粒子的纯化
- 采集共转染了三种野生型BMV农杆菌转化株混合物的N. benthamiana叶片。
- 将叶片置于无菌研钵中，加入等体积（w/v）的BMV提取缓冲液（0.5 M NaAc；0.08 M MgAc，pH 4.5，并在使用前加入1/100体积的β-巯基乙醇）进行研磨3。为最大化病毒产量，建议加入酸洗砂（约0.5–1 g），以促进研磨并有效破坏细胞。
- 将叶片提取液通过2–3层纱布过滤，收集滤液。
- 将纱布上残留的组织部分用与初始叶材料等量的BMV提取缓冲液再次研磨。
- 使用纱布重复过滤步骤。以上操作应在4 °C下进行。
- 将滤液转移至离心管中，加入等体积预冷的氯仿，室温下涡旋（或振荡）5分钟，直至悬浮液颜色变为浅绿色。
- 将乳化后的溶液在4 °C下以12,000 RPM离心15分钟。
- 收集水相，并在磁力搅拌器上搅拌30分钟，以去除残留的氯仿。
- 将悬浮液转移至无菌超速离心管中。
- 在样品下方铺加1 ml 10%蔗糖溶液（用病毒提取缓冲液配制）作为垫层3。
- 在Beckman超速离心机中，于4 °C下以30,000 rpm离心3小时。
- 弃去上清液，将沉淀用所需体积的BMV悬浮缓冲液重悬（悬浮缓冲液的配制方法：将BMV提取缓冲液用无菌蒸馏水稀释至1/10）。
- 将上述步骤获得的初步纯化的病毒颗粒样品进行10–40%蔗糖密度梯度离心，于4 °C下以28,000 rpm离心150分钟。
- 通过手动或分级收集器收集病毒条带。在白光照射下，病毒条带呈蓝色。
- 用病毒悬浮缓冲液将含有病毒样品的蔗糖溶液至少稀释50%。
- 将稀释后的含病毒蔗糖溶液在Beckman超速离心机中，于4 °C下以30,000 rpm离心3小时。
- 最后，将高度纯化的病毒沉淀用所需体积的病毒悬浮缓冲液重悬。
- 使用分光光度计在OD260处测定病毒颗粒的浓度（mg/ml）。
注意：根据RNA含量，BMV的消光系数为54。
- 通过透射电子显微镜（TEM）观察验证病毒粒子的纯度（图 A）
4. 体外组装用衣壳蛋白亚基的制备
- 配制1升1×病毒解离缓冲液（0.5 M CaCl2；50 mM Tris HCl，pH 7.5；1.0 mM EDTA；1.0 mM DTT 和 0.5 mM PMSF）5。
- 根据Sambrook et al 6 的方法制备透析膜。
- 将所需浓度的纯化病毒加入透析袋中。
- 将含有病毒的透析袋放入盛有1×病毒解离缓冲液的烧杯中。
- 在4°C下搅拌透析24小时。
- 24小时后收集透析袋中的溶液，并在4°C下以12,000×g离心15分钟，以分离BMV RNA与解离的病毒颗粒。
- 收集上清液，并在Beckman离心机中以35,000 rpm在4°C下离心3小时，以沉淀任何未解离的病毒颗粒。
- 收集上清液。
- 在此阶段，必须去除解离的衣壳蛋白亚基中可能残留的病毒RNA污染。为此，应将第8步获得的上清液在不添加任何RNA的情况下，使用RNA 1×组装缓冲液（见下文）进行过夜的衣壳蛋白亚基重新组装，随后进行高速离心（4°C下30,000 rpm离心3小时），以沉淀任何重新组装的病毒颗粒。经过此重新组装步骤后，含有衣壳蛋白亚基的上清液应不含任何残留的污染性RNA。然而，为确保完全去除，建议仅使用衣壳蛋白亚基在RNA 1×组装缓冲液中进行一次额外的体外重新组装。过夜重新组装后，样品中必须无组装的病毒颗粒（可通过透射电子显微镜TEM验证）。
- 通过测定OD 254和280 nm处的吸光度，或采用Bradford法等其他方法测定衣壳蛋白亚基的浓度。
- 进行12–15% SDS-PAGE电泳，随后进行Western blot，以评估解离的衣壳蛋白亚基的完整性。
5. 体外 含RNA病毒颗粒的组装
- 制备将被重新组装成病毒颗粒的RNA转录本，并计算其浓度7。
- 按1:5（质量比）的比例混合衣壳蛋白亚基与RNA转录本5。
- 将上述混合物加入透析袋中，并妥善封闭以防止泄漏。
- 配制1,000 ml的RNA 1×组装缓冲液（50 mM NaCl；50 mM Tris-HCl，pH 7.2；10 mM KCl；5 mM MgCl2，1.0 mM DTT）5。
- 将含有反应混合物的透析袋放入装有1×组装缓冲液的烧杯中，并进行搅拌。
- 在4 °C下轻轻搅拌，透析重组反应24小时。
- 24小时后从透析袋中收集混合物，并加入1.5 ml RNA组装缓冲液。
- 将此混合物通过Centricon-100离心柱，在低速（2,000×g）下离心30分钟。
- 在4 °C下用1.5 ml组装缓冲液洗涤柱子一次，持续30分钟。
- 重复上述洗涤步骤两次。
- 最后，在4 °C下以10,000×g离心5分钟，洗脱重新组装的病毒颗粒。
- 在OD 260 nm处测定病毒颗粒的浓度。
6. 光学病毒空壳（OVGs）的制备
- 将吲哚菁绿（Indocyanine green, ICG）8 按所需浓度比例加入纯化的衣壳蛋白中（本报告中使用的吲哚菁绿与衣壳蛋白的质量比为1:10），并通过移液充分混匀。
- 将衣壳蛋白与ICG的混合溶液在OVG组装缓冲液（1 M NaCl；50 mM NaAc；1 mM EDTA；1 mM DTT，pH 4.8）中于4 °C透析24小时。
- 24小时后，从透析袋（截留分子量12 kDa）中收集溶液，并在4 °C下以90,000 rpm离心1小时（图B）。
- 弃去上清液，通过涡旋振荡或将沉淀在BMV悬浮缓冲液中于4 °C过夜静置自发悬浮，使沉淀重新悬浮。
- 通过透射电子显微镜（TEM）验证OVG的形态（图C）。
- 使用分光光度计（Cary 50, Varian Inc.）测定240 nm至950 nm范围内的吸光度；通过约700 nm和790 nm处的特征吸收峰确认ICG的存在8（图D）。
- 使用荧光分光光度计（Fluorolog 3, Jobin-Yvon），在620 nm激发波长下激发OVG溶液，可在约700 nm和约800 nm处观察到典型的ICG荧光发射峰（图D）。
7. 代表性结果
图 A. 通过农杆菌浸润法将三种野生型BMV农杆菌构建体混合物转入本氏烟（N. benthamiana）植株后纯化的BMV病毒颗粒的透射电子显微镜（TEM）图像（比例尺 = 100 nm）。
图 B。 沉淀物 体外 高速离心后收集含有ICG的OVG。
图 C. 负染ICG包埋OVG的透射电子显微镜图像（比例尺 = 100 nm）。
图 D. OVGs 的吸光度（上图）和荧光（下图）光谱。OVGs 发射所用的激发波长为 620 nm。
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讨论
此处介绍的农杆菌浸润法可广泛适用于多种植物病毒。该方法的一个显著特征是能够将多个农杆菌载体同步递送至同一细胞，从而克服了常规使用的植物病毒机械接种法通常存在的主要缺陷。 在体 和 体外 以溴化花叶病毒为模型的组装研究，若遵循一些技巧，可高效开展。（i）为成功进行浸润 N. benthamiana 叶片，在渗透前24小时内不要给植物浇水；（ii）若在下午4至5点之间进行渗透，农杆菌悬浮培养液将更容易扩散至细胞间隙；（iii）培养液在OD600处的光密度值不应超过1.0600高密度农杆菌培养物的侵染已知会引发细胞毒性及叶片衰老9,10 这可能严重影响病毒复制及后续的病毒粒子形成；（iv）在渗透过程中，应轻轻按压叶片的远轴面，以防止对叶片造成严重损伤，从而避免触发植物的免疫反应；（v）可通过将最高浓度与最低浓度的蔗糖相加后除以2的方法，在离心管中用BMV悬浮缓冲液配制10%至40%的25%蔗糖密度梯度 即，10% + 40% / 2 = 25%），立即于 -80 °C 冻结 2–4 小时，随后将蔗糖溶液直立放置于 4 °C 过夜...
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披露
我们无任何披露事项。
致谢
作者感谢实验室多位成员在农杆菌浸润和体外组装实验开发过程中提出的宝贵建议。本研究由加利福尼亚大学资助项目提供经费支持。部分研究工作由美国国家科学基金会资助项目（CBET-1144237）支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| MES 钠盐 | Sigma-Aldrich | M2993 | |
| 吲哚菁绿 | Sigma-Aldrich | I2633 | |
| 贝克曼超速离心机 | Beckman Coulter Inc. | 型号：L8-70M | |
| Centricon-100 柱 | EMD Millipore | YM-100 | |
| 分光光度计 | Varian, Inc. | 部件号 10068900 | |
| 荧光分光光度计 | Fluorolog 3, Jobin-Yvon. | 部件号 FL3-21 |
参考文献
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- Annamalai, P., Rofail, F., Demason, D. A., Rao, A. L. Replication-coupled packaging mechanism in positive-strand RNA viruses: synchronized coexpression of functional multigenome RNA components of an animal and a plant virus in Nicotiana benthamiana cells by agroinfiltration. J. Virol. 82, 1484-1495 (2008).
- Annamalai, P., Rao, A. L. Plant Virology Protocols. Foster, N., Johansen, H. 451, Humana Press. 251-264 (2008).
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- Jung, B., Rao, A. L., Anvari, B. Optical nano-constructs composed of genome-depleted brome mosaic virus doped with a near infrared chromophore for potential biomedical applications. A.C.S. Nano. 5, 1243-1252 (2011).
- Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana. Cell. 103, 157-167 (2000).
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