准备个体 果蝇 用于活体成像的卵室

摘要

Drosophila 卵室是研究 mRNA 定位机制的优良模型。为了捕捉定位过程背后动态事件的变化，需要对活体组织进行快速高分辨率成像。本文介绍了一种对活体样品进行解剖和成像的实验方案，可在最小干扰下完成操作。

摘要

活细胞成像是一种重要的技术，广泛应用于多种作为模式系统的黑腹果蝇（Drosophila）组织，以研究诸如轴向特化、细胞分化和器官发生等科学问题¹。实验样品的正确制备是一个关键但常被忽视的步骤。样品制备的目标是确保实验的生理相关性，并建立最佳的成像条件。为了维持组织的活性，必须避免脱水、缺氧、过热或培养基恶化等不利因素²。

果蝇（Drosophila）卵室是研究体轴模式形成、mRNA 定位及细胞骨架组织等相关问题的经典模型系统，其应用范围不仅限于此^3,4。对于早期和中期的卵室，使用卤代烃油封片是一种理想的处理方法，因其可允许氧气自由扩散，有效防止脱水与缺氧，同时具备优异的光学特性，适用于显微成像。通过将转基因引入卵室，或直接注射标记的 RNA、蛋白质或抗体，可实现对荧光蛋白的成像观察^5-7。例如，在动物基因组中引入 MS2 构建体，可实现对卵母细胞中 mRNA 的实时观测⁸。这些构建体利用 MS2 噬菌体 RNA 干环结构与其外壳蛋白的特异性结合，实现 mRNA 在活体（in vivo）中的标记⁹。

本文介绍了一种从雌性Drosophila中提取卵巢以及分离单个卵巢管和卵室的实验方案。有关Drosophila卵子发生过程的详细描述，请参见Allan C. Spradling（1993年，2009年重印）¹⁰。

方案

1. 果蝇 解剖前准备（根据普林斯顿大学 E. Gavis 的方法）

1. 丢弃稀疏培养瓶中的成虫，并在实验前将培养瓶转移至25 °C环境中。当新的成虫开始羽化后，等待两天。
2. 取一个含有约10 ml固体培养基的果蝇小瓶，以45度角加入0.5–0.7克干酵母（见表格）。不要将酵母覆盖整个果蝇培养基表面。
3. 向酵母中加入几滴水，足以润湿即可（图1A）。将小瓶保持在45度角，静置约3分钟，使酵母充分吸水（图1B）。

注意：也可在另一个容器中预先混合酵母糊，然后用刮勺将糊状物加入小瓶中。

4. 通过注入CO₂气体使试管中的果蝇麻醉。当果蝇停止活动后，将失去意识的果蝇倾倒至CO₂操作垫上进行分选（图1C）。
5. 在解剖显微镜下，使用细头画笔挑选10–15只所需基因型的雌蝇和5只雄蝇（图1D）。雄蝇可通过其腹部末端存在一对钳状结构（抱器）以及深色突出的形态特征进行明显识别。
6. 将选好的果蝇加入已添加酵母的试管中（图1E）。置于25 °C条件下培养24–60小时。若需获得较高比例的早期至中期卵室，可缩短培养时间；若需获得晚期卵室，则应延长培养时间。

2. Drosophila 卵巢解剖

1. 在1.5号、22 × 50 mm的盖玻片上滴一滴卤代烷油（图2A）。将准备好的盖玻片置于一旁，避免妨碍后续操作。
2. 通过注入CO₂气体麻醉酵母管中的果蝇，并将其轻倒于CO₂操作垫上。
3. 使用尖头精细镊子夹住一只腹部膨大的雌蝇，夹取位置为腹部前端（不要夹在腹部与胸部之间）（图2B-C）。
4. 用镊子夹住雌蝇，在解剖显微镜下观察，显微镜距准备好的盖玻片约2-3 cm。
5. 继续保持在前端夹持，用另一把镊子去除雌蝇最末端的组织（图2D）。注意：肠道组织通常会随尾端组织一同被拉出。将去除的组织从镊子上擦拭干净。
6. 仍以前端夹持雌蝇，用擦净的镊子轻轻挤压或按摩其腹部，方向由前向后，手法类似于从牙膏管末端挤出牙膏。
7. 两个较大的不透明结构将从腹部被挤出，并黏附在镊子末端（图2E-F）。这两个结构即成对的卵巢。
8. 将卵巢轻轻触碰至下方盖玻片的卤代烷油中。
9. 重复解剖操作1-2次，共在盖玻片的油滴中收集4-6个卵巢（图2G）。

3. 分离卵巢管

注意：每个卵巢包含大约16个卵管，每个卵管由6到10个处于不同发育阶段的卵室组成，呈串珠状排列¹⁰。

注意：在分离卵巢管之前，调节体视显微镜的光源，使照明以浅角度照射样品。这能增强样品的对比度，便于观察早期卵室。

1. 在油中，用闭合的镊子去除后端（较老的阶段）连接组织，将两个卵巢分开（图3A）。
2. 将单个卵巢调整方向，使最老的阶段位于左侧，最年轻的阶段位于右侧。卵巢中年轻阶段的卵室呈透明状，并形成卵巢较尖的一端。
3. 用惯用手持一对镊子，轻轻夹住卵巢的后部，最好夹住残留的连接组织部分。用镊子固定卵巢位置的同时，使用解剖探针（或钨针）逐一分离出单个的卵管（图3B-D）。

注意：单个卵管会在早期阶段（卵原区至10期）之间断裂，因为较晚的阶段体积过大，无法从完整的卵巢中分离出来。

注意：若用解剖探针刺破晚期卵母细胞，会导致细胞质泄漏到油中，从而使单个卵巢管的提取变得非常困难。一旦刺破晚期卵母细胞，应更换为一个新的卵巢样本。

4. 当卵管从卵巢中分离后，使用解剖探针将其拖至油滴中心，并根据实验需要调整其方向。注意：在油中的卵管会自然沉降并附着于玻璃表面。
5. 重复此操作（3.3–3.4）步骤，直至获得 15–25 根独立的卵管。注意：此过程可能需要解剖多个卵巢。整个过程应耗时少于 15 分钟。

注意：建议从多只果蝇中各解剖一个卵巢，而不是从较少的果蝇中解剖出两个卵巢，以增加实验中果蝇的样本量（n值）。

注意：粗暴操作卵原小叶将导致卵母细胞不健康，并可能在实验中产生人为假象。

注意：卵母细胞在从卵巢解剖分离后40分钟会因应激开始表现出表型变化（比较图7E与7F）。

6. 当卵管处于合适的方向时（图3E），使用解剖探针和闭合的镊子将多余的卵巢组织移出油滴。可将镊子上的组织擦拭到纸巾上。

4. 分离单个晚期卵室（根据普林斯顿大学 E. Gavis 的方法）

1. 用优势手持镊子夹住分离的卵巢后部，最好夹住结缔组织的残余部分。用镊子固定卵巢位置的同时，将解剖针从靠近镊子的卵巢后端插入（图4A）。插入解剖针时应避开任何卵室，将其插入晚期卵室之间的间隙。
2. 将解剖针沿卵巢拉过，直至其从早期卵室端穿出（图4B）。操作正确时，解剖针会去除固定卵巢管和晚期卵室的结缔组织。
3. 重复步骤4.2，直至卵巢管在盖玻片上散开。注意：当卵室不再相互堆叠时，此步骤即已完成。
4. 使用解剖针将晚期卵母细胞分开，以便于成像观察（图4C）。

注意：解剖晚期卵室时刺破卵母细胞，其影响不如解剖早期卵室的单个卵管时刺破卵母细胞那样严重。

注意：对于14期卵室，使用镊子夹住背侧附属结构以确定方向。

5. 注射液的制备

注意：注射中期卵母细胞时，应将卵管垂直于盖玻片的长轴方向放置。

1. 开启成像显微镜（本实验中使用 Applied Precision 公司的 DeltaVision Core 系统），并加载相应的成像设置（图 5A-B）。
2. 开启显微注射装置（图 5C）。
3. 使用上样尖端将注射针上样（图 5D-E）。待注射的溶液应先高速短暂离心，以避免可能堵塞注射针的沉淀物。
4. 将已上样的注射针安装到注射器上，注意避免针尖断裂（图 5F）。
5. 为便于疏通堵塞的针尖，可在含有卵泡的油滴一侧放置一小块尺寸为 2×10 mm 的盖玻片碎片。确保该玻璃碎片被油完全覆盖。此玻璃碎片可用于顶撞针尖，以击碎或疏通堵塞物。

6. 荧光RNA的注射

开始前：设置注射装置和显微操作器控制，使注射针位于视野中心上方。

1. 将待注射的样品固定在显微镜载物台上。
2. 选择 20x 物镜。也可使用更高或更低放大倍数的物镜。

注意：如果使用具有定点访问功能的自动载物台，建议在开始之前标记所有8-9期的卵母细胞以供注射。这有助于方便地访问和注射选定的卵母细胞。

3. 将注射针缓慢下移，直至接触油滴表面。确保针尖位于物镜正上方中心位置。
4. 关闭室内光源，打开显微镜的明场照明。从已标记的位点列表中选择第一个位点（卵母细胞）。通过目镜观察，对卵母细胞进行调焦（图6A）。
5. 手动降低注射针，使其与卵母细胞处于同一焦平面，并可在卵母细胞旁清晰可见。
6. 使用操纵器控制装置，将注射针尖移动至卵母细胞内部。快速刺入的动作通常比缓慢推进更易成功。进入细胞后，从针尖推出少量液体，肉眼观察其效果，必要时重复操作。若注射成功，卵母细胞内的细胞质将发生位移；若无明显变化，需重复注射。无需通过荧光成像来判断物质是否已注入。注射完成后，将针头从卵母细胞内退出（图6B-G）。
7. 精确量化注射液体的体积较为困难。如需增加注射量，可调节注射脉冲的压力或持续时间，轻微折断针尖以略微扩大开口，或采用多次注射脉冲。

注意：若操作得当，整个注射过程应在10秒内完成。对卵母细胞进行反复穿刺或在细胞内长时间滞留针头，将导致卵室严重受损。

8. 在选择下一个标记的卵母细胞之前，将注射针在油中抬高至足够高度，以避免在移动路径中接触其他卵母细胞。
9. 到达新的卵母细胞后，重复步骤 6.6。以此方式继续操作，直至完成所有所需卵母细胞的注射。

注意：若在注射过程中出现失误，请移至下一个已标记的卵母细胞。不要在已损坏的卵母细胞上浪费时间。

注意：在注射过程中，针头可能会发生堵塞。此时，将针头移至盖玻片油滴中玻璃碎屑的附近。使玻璃碎屑与针头处于同一焦平面，轻轻将针头撞击玻璃碎屑（图6H）。通过按压注射按钮，观察是否有液体从针尖流出，以检测针头是否已疏通。

10. 当所有卵母细胞注射完成后，手动将注射针向上移动，从油中取出，并将其调整至显微镜光路之外。确保其处于安全方向，以避免造成眼部损伤。

注意：如果卵室分离与卵母细胞注射之间间隔时间过长，卵母细胞将难以注射，并表现出与应激相关的表型变化。粗暴操作卵母细胞或注射过量液体也可能导致类似问题（比较图6I、J、K）。

7. 活体成像实验设计

1. 从列表中选择第一个已注射的卵母细胞。通过荧光成像一帧图像（如图6G所示）来确认注射是否位于卵母细胞内。
2. 设置实验参数，包括：激发波长、发射光路、激发时间、Z轴层扫以及采集间隔时间。注意：有关此内容的更多信息，请参见Parton R. 等人 (2010)²。
3. 采集数据集。

8. 代表性结果

体外合成的Alexa-546 grk RNA被注射到Me31B::GFP卵室中（图7A）。该RNA定位于卵母细胞的背侧前部，并在细胞核周围形成帽状结构（图7B）。有关RNA定位的更多示例，请参见MacDougall N. 等（2003）¹¹。

表达荧光标记蛋白（Tau-GFP，图7C）或RNA标记系统（grk*mCherry，图7D）的中期和晚期卵母细胞无需注射即可进行成像。

图 1。

图 2.

图3.

图 4。

图 5.

图6。

图 7.

讨论

活细胞成像是一种用于实时观察细胞过程的强大检测方法。除了简单的明场观察外，对目标蛋白和RNA添加荧光标记已带来诸多突破。本文概述了一种可用于单个活卵母细胞成像的实验方案，该方法可与遗传学和生物化学检测手段联合使用。

在本方案中，我们还介绍了如何通过显微注射对活体卵母细胞进行实验性操作。可注射的物质有多种选择，包括 体外 合成荧光标记的RNA以检测二级结构指导RNA定位的能力（Ball和Davis，未发表），以及抑制蛋白质功能的抗体 ⁶未来的研究可能会将其他标记成分和细胞机制引入活体卵母细胞，从而能够验证分子机制。

在处理活细胞时，保持组织的活性和健康状态至关重要。在本实验方案中，我们指出了若干可能导致卵室受到应激的步骤。例如，尽管油相介质在成像方面具有优势，但长时间在油中培养可能会对卵室造成应激。这种应激可通过明场曝光下观察细胞核形态与位置、卵母细胞膜的变化来轻松监测：在应激状态下，卵母细胞膜会发生扭曲并出现出泡现象（可对比图7E（无应激）与图7F（有应激））。第9期卵室可在数小时内维持RNA定位和边界细胞迁移¹²。然而，第7/8期卵室在卵巢从雌性果蝇体内取出约40分钟后，便会在卤代碳油中开始出现不良效应。由于在第11至14期时滤泡细胞已开始分泌卵壳，因此晚期卵室在油相或水相培养基中均可正常发育¹³。已有报道指出，在水相昆虫培养基中添加胰岛素可使第9期卵母细胞维持活性长达6小时¹⁴，并可使生殖腺体维持活性达14小时¹⁵。在所有情况下，均应避免对卵室进行剧烈操作，因为这会增加卵母细胞的应激并降低其存活率。通过减少成像的卵室数量，并谨慎轻柔地处理每一个卵室，是确保最佳存活率的最佳方法。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
解剖所用工具应保持清洁，但无需高压灭菌。使用前用乙醇擦拭工具，并使其自然晾干。
细尖画笔（艺术家用貂毛圆头笔，00号或0号）	任意供应商		高质量的画笔至关重要
Halocarbon Products Corporation，Series 95	Halocarbon Products Corp.		欧洲经销商： Solvadis (GMBH) 务必通过向油中通入空气进行氧合处理。
盖玻片 - No. 1.5，22 × 50 mm	International - No1 - VWR 目录号=631-0137-22-50mm	Menzel-Glaser - 22 - 40mm - MNJ 400-070T
Dumont No.5 - Dumostar	Fine Science Tools	11253-20	“Biologie”型号的尖端也可使用，但更易损坏
解剖探针	Fine Science Tools	10140-01
体视显微镜	Olympus Corporation	SZ61
CO2垫板	Genesee Scientific	59-114 （789060 Dutscher）	欧洲经销商： Dutscher www.dutscherscientific.com/ 也可相对容易地自行定制果蝇垫板
KimCare	Kimberly-Clark Corporation	KLEW3020
显微镜 - DeltaVision	Applied Precision	DC-CORE
显微操作仪	Burleigh	Burleigh PCS-5000 系列，TS-5000-300	http://www.ldgi-burleigh.com/ （原 Exfo）
注射装置	Tritech Research, Inc.	MINJ-1	经改装，可适配 Eppendorf Femtotips 吸头
注射针	Eppendorf	930000043	不同应用宜选用不同类型的针尖
上样吸头 20μl	Eppendorf	5242956.003
干活性酵母	Fleischman’s	#2192