中脑多巴胺系统和纹状体的外植体被用于胶原基质实验，以研究 体外 中脑-纹状体和纹状体-黑质通路发育的分析。该实验可操控并量化轴突生长与导向，亦可经修改用于评估其他脑区或分子信号。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
中脑多巴胺（mdDA）神经元通过内侧前脑束投射至端脑的多个区域，包括纹状体1相反，纹状体中发出纹状体黑质（直接）通路的中等棘状神经元则支配黑质2这些轴突束的发育依赖于多种轴突生长与导向信号分子的组合性作用，包括由神经突或（中间）靶区释放的分子。3,4这些可溶性因子可以被研究 体外 通过在胶原基质中培养中脑多巴胺能（mdDA）和/或纹状体外植体，为轴突提供模拟细胞外环境的三维基质。此外，胶原基质有助于在外植体或邻近细胞释放的蛋白质周围形成相对稳定的浓度梯度（例如参见参考文献5和6）。本文描述了大鼠尾部胶原的纯化方法、多巴胺能及纹状体外植体的显微解剖、其在胶原凝胶中的培养，以及后续的免疫组织化学和定量分析方法。首先，分离E14.5小鼠胚胎的脑组织，并进行多巴胺能和纹状体外植体的显微解剖。随后将这些外植体接种于盖玻片上的胶原凝胶中，单独或共培养48至72小时。 体外随后，使用神经元标记物（如酪氨酸羟化酶、DARPP32 或 βIII 微管蛋白）对轴突投射进行可视化，并对轴突生长及趋化性或排斥性轴突反应进行定量分析。该神经元制备方法是研究 体外 研究发育过程中中脑-纹状体和纹状体-黑质轴突生长与导向的细胞与分子机制。利用该检测方法，还可评估多巴胺能和纹状体轴突的其他（中间）靶区，或验证特定的分子信号。
方案
1. 大鼠尾部胶原蛋白的制备
- 采集6-10条成年大鼠尾巴（可将尾巴在-20 °C下保存至使用）。
- 将尾巴在95%乙醇中室温（RT）浸泡过夜。
大鼠尾部解剖（在组织培养罩内进行）：
（不使用工具时应将其置于70%乙醇中，并确保本实验过程中使用的所有溶液、工具和玻璃器皿均为无菌状态）
- 为采集尾部肌腱，剪去尾尖。用一对镊子夹住尾部较粗的一端，用另一对镊子夹住尾部并弯曲，使其在靠近第一对镊子处折断。将两段拉开，肌腱将保留在原位（图1A,B）。
- 将肌腱收集至无菌 H2O 中，待所有肌腱收集完毕后，转移至另一含有无菌 H2O 的培养皿中。
- 取 2–3 根肌腱，在含有无菌 H2O 的新培养皿中用两对镊子将其剪碎。去除静脉等非肌腱组织（肌腱组织具有光泽且反光；图1C）。去除所有非肌腱组织后，每根尾部可获得约 100–150 mg 肌腱。
- 将肌腱转移至 300 ml 无菌 3% 乙酸中，于 4 °C 缓慢搅拌过夜。
- 再加入 200 ml 无菌 3% 乙酸，于 4 °C 缓慢搅拌过夜。
- 将含有肌腱的乙酸溶液在 4 °C 条件下以约 2700 ×g 离心 120 分钟，以沉淀未溶解的肌腱及非肌腱组织。
- 在离心过程中准备透析管：
- 剪取 40 cm 长的透析管片段
- 在 500 μM EDTA 中煮沸 5 分钟
- 用无菌 H2O 冷却
- 在透析管一端打结，于生物安全柜中使用自动移液器和 25 ml 移液管，将离心后肌腱溶液的上清液加入冰上的透析管中。避免产生气泡。将另一端打结，并将装好液体的透析管置于冰上无菌铝箔上保存，直至所有透析管填充完毕（图1D）。
- 在生物安全柜中准备 10 L 无菌 0.1X MEM（pH 4.0）。将浮子放入透析管段中，并将其加入预冷的 0.1X MEM 溶液（置于 10 L 烧杯中）。于 4 °C 缓慢搅拌条件下透析过夜。此步骤可去除过量酸，同时保持较低 pH。
- 更换为新的预冷 10 L 0.1X MEM，于 4 °C 搅拌过夜。
- 重复上一步骤，再次更换为新的预冷 10 L 0.1X MEM，于 4 °C 搅拌过夜。
- 将胶原蛋白溶液分装至无菌 50 ml 离心管中。分装后于 4 °C 保存，可稳定存放 6–12 个月。仅在生物安全柜中操作胶原蛋白储备液。
- 重要的是需检测纯化的胶原蛋白是否需要稀释（用 0.1X MEM 稀释）以在胶原基质实验中获得最佳结果。因此，应建立一系列胶原蛋白稀释梯度（未稀释胶原、1:1、1:2 和 1:5 稀释），并按以下所述进行胶原基质实验，以确定最佳胶原蛋白稀释比例。
2. 多巴胺能中脑的解剖7,8
- 从母鼠子宫中取出 E14.5 小鼠胚胎，并置于冰上的 L15 培养基中保存，待用。
所有后续解剖步骤均在冰上含L15培养基中进行。
- 取出脑组织。
- 沿每个端脑泡的内侧部分进行切割，移除端脑（可将端脑泡用于纹状体外植体实验）。
- 去除脑膜鞘。
- 在中脑弯曲部前方稍近头侧处做一个背腹向切口。
- 在中脑弯曲部后方稍近尾侧处再做一个背腹向切口。
- 使用显微解剖刀沿背侧中线做一吻尾向切口，以暴露下方的腹侧中脑组织。注意避免损伤腹侧中脑组织，因其含有多巴胺能神经元（图 2）。
- 在腹侧中线两侧平行于中线做两个吻尾向切口，以去除背侧中脑组织。
- 使用显微解剖刀将剩余的腹侧中脑组织分割成若干外植体。
- 将外植体保存在含有 5% FBS 的 L15 培养基中，置于冰上待用。
3. 纹状体的解剖分离
所有解剖步骤均在冰上含有L15培养基的环境中进行。
- 利用中脑解剖过程中分离出的端脑泡。
- 使用镊子在丘脑与纹状体之间进行切割，以去除丘脑。
- 在纹状体前方做一内外方向的切口，以去除嗅球等前部结构。对位于纹状体后方的组织重复此步骤。
- 调整剩余脑片的位置，以获得纹状体的冠状切面视图（图2）。
- 纹状体可辨认为组织中密度略低（更透明）的部分。使用显微解剖刀将纹状体分离并切割成外植块。应避免靠近中线处颜色略深的组织，该区域含有来自外侧和内侧神经节隆起的迁移神经元。
- 将外植块保存在含5% FBS的L15培养基中，置于冰上待用。
4. 组装胶原基质实验
胶原蛋白的制备（所有步骤均在冰上操作，使用预冷的移液器吸头）
- 将860 μl稀释的胶原蛋白与100 μl 10x MEM和40 μl 1M碳酸氢钠（NaHCO3）混合，并置于冰上。如果此时胶原蛋白温度升高，将会发生凝固。
- 取20 μl（直径约5 mm）制备好的胶原蛋白滴加到Nunc 4孔板中一个盖玻片上，放入37 °C、5% CO2的CO2培养箱中静置30分钟（环境O2浓度即可）。在此孵育过程中，胶原蛋白将发生凝胶化。
在胶原凝胶中建立共培养体系
- 胶原蛋白凝固后，使用带有 200 μl 吸头的移液器将一个多巴胺能或纹状体外植体转移至胶原蛋白中。
- 用针将外植体移动至彼此靠近的位置，保持约等于一个外植体直径的距离（~200–300 μm）（图 2）。
- 吸去多余培养基，然后在外植体上方加入 20 μl 已准备好的胶原蛋白。此操作常导致外植体移动，需按步骤 4.4 所述，用针重新调整外植体位置。
- 在室温下静置 15 分钟，随后于 37 °C、5% CO2 条件下继续孵育 30 分钟，使胶原蛋白完全凝固。
- 胶原蛋白凝固后，加入 400 μl 外植体培养基，并在 37 °C、5% CO2 的 CO2 培养箱中培养 2–3 天。
5. 免疫组织化学分析与定量
免疫组织化学
- 固定外植体时，轻轻加入 400 μl 含 8% 多聚甲醛（PFA）的 PBS 溶液至 400 μl 培养基中（使 PFA 稀释至 4%），室温孵育 1 小时。
- 在 PBS 中室温洗涤 3 次，每次 15 分钟。
- 在封闭缓冲液（BB；PBS + 1% FBS + 0.1% Triton X-100）中孵育 2 小时。
- 加入一抗抗体，在 4 °C 下于封闭缓冲液中过夜孵育。检测多巴胺能轴突时使用抗酪氨酸羟化酶抗体（1:1000）7，检测纹状体轴突时使用抗 DARPP32 抗体（1:500）9，检测所有轴突时使用抗 βIII 微管蛋白抗体（1:3000）7。
- 在 PBS 中室温洗涤 5 次，每次 1 小时。
- 在封闭缓冲液中加入适当荧光标记的二抗（1:500），4 °C 过夜孵育。从该步骤开始，尽量减少外植体暴露于光照（例如用铝箔包裹）。
- 在 4 °C 的 PBS 中过夜洗涤，次日再进行多次洗涤。
- 使用 Prolong 抗荧光淬灭封片剂将外植体封片于显微镜载玻片上。在玻璃载玻片上滴加约 10 μl 封片剂。取盖玻片，将带有外植体的一面朝下，轻轻放置于封片剂液滴上。通过缓慢轻柔地放下盖玻片，避免在盖玻片下截留气泡。
通过计算P/D比值进行定量分析
- 使用落射荧光显微镜获取外植体的数字图像（图3）。
- 根据这些图像，将每个外植体划分为四个象限，生成近端象限（即外植体中靠近相邻外植体的部分）和远端象限（即外植体中远离相邻外植体的部分）（图2、4）。
- 测量从外植体近端和远端象限中延伸出的最长20条神经突的长度。
- 利用这20条最长神经突的平均长度，计算每个外植体的近端/远端（P/D）比值。P/D比值 > 1 表示轴突被吸引，而比值 < 1 表示轴突被排斥。
- 在某些情况下，神经突生长过于密集，难以评估单个神经突的长度。此时可通过测量外植体边缘与近端和远端象限中轴突生长前沿之间的距离来进行定量分析。
6. 代表性图像
在成功培养多巴胺能和纹状体外植体后，通过明场显微镜观察或抗βIII微管蛋白免疫细胞化学染色（未显示）可观察到大量轴突。其中一部分轴突为多巴胺能或纹状体轴突，可通过免疫细胞化学染色进行识别（图3）。通过如前所述将外植体划分为四个象限并计算P/D比值，可定量评估潜在的轴突趋化吸引或排斥效应（图3E）。
图1. 大鼠尾部肌腱中胶原蛋白制备过程的示意图。A）拉开大鼠尾巴可暴露出肌腱。B）肌腱呈绳索状束形，清晰可见。C）肌腱具有闪亮的白色外观，易于与静脉区分。D）肌腱在乙酸中溶解后，将溶液转移至透析管中。为保持胶原蛋白处于低温状态，将透析管置于冰上的无菌铝箔上。
图 2. 示意图显示实验操作的各个步骤。分离并切割适当的大脑区域以制备外植体。将一个中脑和纹状体外植体紧密放置于胶原基质中，在 37 °C 下培养 48–72 小时。通过荧光免疫组织化学方法可视化轴突，并计算 P/D 比值以定量分析趋化性反应。
图 3. 胶原基质培养中轴突生长的代表性结果。A) 使用抗酪氨酸羟化酶抗体染色的中脑外植体，显示轴突向外生长。虚线表示相邻的外植体。B) A 图的放大图像，显示单个神经突和生长锥（箭头所示）。C) 使用抗 DARPP32 抗体染色的纹状体外植体。D) C 图的放大图像，显示单个神经突。E) P/D 比值定量示例。将外植体均分为四个象限，近端象限朝向相邻外植体，远端象限则背向相邻外植体。比例尺为 100 μm。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本文所述的胶原基质实验在过去几十年中已被许多不同的实验室用于研究多种轴突导向分子和神经元系统，并不断得到改进（例如参见参考文献5-8）。这些研究表明，该实验是研究不同（中间）靶组织分泌的轴突导向分子的作用及其调控机制的有力工具。
然而，需要注意的是，胶原基质仅是细胞外环境（ECM）的一种替代物，明显缺乏ECM中通常存在的多种蛋白质。已知ECM的组分会影响轴突导向分子的作用效果。10然而，胶原基质实验在研究基本分子机制方面尤为有用 体外 以及与其他组织培养方法结合使用（例如，器官型切片培养）11或转基因动物模型的分析。
胶原基质实验的成功取决于多个因素。首先，外植体的大小对轴突生长至关重要。较大的多巴胺能和纹状体外植体通常表现出有限的轴突生长，而过小的外植体则出现不规则且束状的生长。此外，各个外植体之间的距离显著影响分泌分子对邻近外植体的作用效果。若外植体间距过大，可扩散分子将无法到达邻近外植体；反之，若间距过小，轴突可能直接生长进入相邻外植体，从而难以对轴突生长...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
在过去二三十年中，胶原基质检测技术已由多个不同的研究团队开发并不断完善。本文所述的多巴胺能和纹状体外植体方法极大地受益于这些研究。此外，作者感谢Asheeta Prasad在外植体纹状体培养体系建立过程中提供的帮助。本实验室的工作得到了人类前沿科学计划组织（职业发展奖）、荷兰卫生研究与发展组织（ZonMW-VIDI和ZonMW-TOP）、欧洲联盟（mdDA-NeuroDev项目，FP7/2007-2011，资助号222999）（资助对象：RJP）以及荷兰科学研究组织（TopTalent项目；资助对象：ERES）的资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 胎牛血清 | BioWhittaker | 14-801F | |
| 谷氨酰胺（200 mM） | PAA Laboratories | M11-004 | |
| HEPES | VWR international | 441476L | |
| β-巯基–乙醇 | Merck & Co., Inc. | 444203 | |
| 最低必需培养基（MEM） | GIBCO, by Life Technologies | 61100-087 | |
| Neurobasal 培养基 | GIBCO, by Life Technologies | 21103-049 | |
| B27 | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| Leibovitz’s L-15 培养基 | GIBCO, by Life Technologies | 11415-049 | |
| 青霉素-链霉素 | GIBCO, by Life Technologies | 15070-063 | |
| Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂 | Invitrogen | P36930 | |
| 透析袋 | Spectrum Labs | 132660 | |
| 兔抗酪氨酸羟化酶抗体 | Pel-Freez Biologicals | P40101-0 | |
| 兔抗 Darpp32（H-62）抗体 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-11365 | |
| 小鼠抗βIII 微管蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | T8660 | |
| Alexa Fluor 标记的二抗 | Invitrogen |
参考文献
- van den Heuvel, D. M., Pasterkamp, R. J. Getting connected in the dopamine system. Prog. Neurobiol. 85, 75-93 (2008).
- Lobo, M. K. Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future. Int. Rev. Neurobiol. 89, 1-35 (2009).
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298, 1959-1964 (2002).
- Chilton, J. K. Molecules mechanisms of axon guidance. Dev. Biol. 292, 13-24 (2006).
- Lumsden, A. G., Davies, A. M. Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system. Nature. 323, 538-539 (1986).
- Tessier-Lavigne, M., Placzek, M., Lumsden, A. G., Dodd, J., Jessel, T. M. Chemotropic guidance of developing axons in the mammalian central nervous system. Nature. 336, 775-778 (1988).
- Kolk, S. M., Gunput, R. A., Tran, T. S., van den Heuvel, D. M., Prasad, A. A., Hellemons, A. J., Adolfs, Y., Ginty, D. D., Kolodkin, A. L., Burbach, J. P., Smidt, M. P., Pasterkamp, R. J. Semaphorin 3F is a bifunctional guidance cue for dopaminergic axons and controls their fasciculation, channeling, rostral growth, and intracortical targeting. J. Neurosci. 29, 12542-12557 (2009).
- Fenstermaker, A. G., Prasad, A. A., Bechara, A., Adolfs, Y., Tissir, F., Goffinet, A., Zou, Y., Pasterkamp, R. J. Wnt/planar cell polarity signaling controls the anterior-posterior organization of monoaminergic axons in the brainstem. J. Neurosci. 30, 16053-16064 (2010).
- Arlotta, P., Molyneaux, B. J., Jabaudon, D., Yoshida, Y., Macklis, J. D. Ctip2 controls the differentiation of medium spiny neurons and the establishment of the cellular architecture of the striatum. J. Neurosci. 28, 622-632 (2008).
- De Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons. J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).
- Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
标签
