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小鼠多巴胺能神经元和纹状体组织三维胶原基质培养物的分离与培养

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DOI：

10.3791/3691

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2012年3月23日

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1Department of Neuroscience & Pharmacology, Rudolf Magnus Institute for Neuroscience, University Medical Center Utrecht

本文内容

摘要

中脑多巴胺系统和纹状体的外植体被用于胶原基质实验，以研究 体外 中脑-纹状体和纹状体-黑质通路发育的分析。该实验可操控并量化轴突生长与导向，亦可经修改用于评估其他脑区或分子信号。

摘要

中脑多巴胺（mdDA）神经元通过内侧前脑束投射至端脑的多个区域，包括纹状体1相反，纹状体中发出纹状体黑质（直接）通路的中等棘状神经元则支配黑质2这些轴突束的发育依赖于多种轴突生长与导向信号分子的组合性作用，包括由神经突或（中间）靶区释放的分子。3,4这些可溶性因子可以被研究 体外 通过在胶原基质中培养中脑多巴胺能（mdDA）和/或纹状体外植体，为轴突提供模拟细胞外环境的三维基质。此外，胶原基质有助于在外植体或邻近细胞释放的蛋白质周围形成相对稳定的浓度梯度（例如参见参考文献5和6）。本文描述了大鼠尾部胶原的纯化方法、多巴胺能及纹状体外植体的显微解剖、其在胶原凝胶中的培养，以及后续的免疫组织化学和定量分析方法。首先，分离E14.5小鼠胚胎的脑组织，并进行多巴胺能和纹状体外植体的显微解剖。随后将这些外植体接种于盖玻片上的胶原凝胶中，单独或共培养48至72小时。 体外随后，使用神经元标记物（如酪氨酸羟化酶、DARPP32 或 βIII 微管蛋白）对轴突投射进行可视化，并对轴突生长及趋化性或排斥性轴突反应进行定量分析。该神经元制备方法是研究 体外 研究发育过程中中脑-纹状体和纹状体-黑质轴突生长与导向的细胞与分子机制。利用该检测方法，还可评估多巴胺能和纹状体轴突的其他（中间）靶区，或验证特定的分子信号。

方案

1. 大鼠尾部胶原蛋白的制备

  1. 采集6-10条成年大鼠尾巴（可将尾巴在-20 °C下保存至使用）。
  2. 将尾巴在95%乙醇中室温（RT）浸泡过夜。

大鼠尾部解剖（在组织培养罩内进行）：
（不使用工具时应将其置于70%乙醇中，并确保本实验过程中使用的所有溶液、工具和玻璃器皿均为无菌状态）

  1. 为采集尾部肌腱，剪去尾尖。用一对镊子夹住尾部较粗的一端，用另一对镊子夹住尾部并弯曲，使其在靠近第一对镊子处折断。将两段拉开，肌腱将保留在原位（图1A,B）。
  2. 将肌腱收集至无菌 H2O 中，待所有肌腱收集完毕后，转移至另一含有无菌 H2O 的培养皿中。
  3. 取 2–3 根肌腱，在含有无菌 H2O 的新培养皿中用两对镊子将其剪碎。去除静脉等非肌腱组织（肌腱组织具有光泽且反光；图1C）。去除所有非肌腱组织后，每根尾部可获得约 100–150 mg 肌腱。
  4. 将肌腱转移至 300 ml 无菌 3% 乙酸中，于 4 °C 缓慢搅拌过夜。
  5. 再加入 200 ml 无菌 3% 乙酸，于 4 °C 缓慢搅拌过夜。
  6. 将含有肌腱的乙酸溶液在 4 °C 条件下以约 27....

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讨论

本文所述的胶原基质实验在过去几十年中已被许多不同的实验室用于研究多种轴突导向分子和神经元系统，并不断得到改进（例如参见参考文献5-8）。这些研究表明，该实验是研究不同（中间）靶组织分泌的轴突导向分子的作用及其调控机制的有力工具。

然而，需要注意的是，胶原基质仅是细胞外环境（ECM）的一种替代物，明显缺乏ECM中通常存在的多种蛋白质。已知ECM的组分会影响轴突导向分子的作用效果。10然而，胶原基质实验在研究基本分子机制方面尤为有用 体外 以及与其他组织培养方法结合使用（例如，器官型切片培养）11或转基因动物模型的分析。

胶原基质实验的成功取决于多个因素。首先，外植体的大小对轴突生长至关重要。较大的多巴胺能和纹状体外植体通常表现出有限的轴突生长，而过小的外植体则出现不规则且束状的生长。此外，各个外植体之间的距离显著影响分泌分子对邻近外植体的作用效果。若外植体间距过大，可扩散分子将无法到达邻近外植体；反之，若间距过小，轴突可能直接生长进入相邻外植体，从而难以对轴突生长.......

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披露

我们没有需要披露的内容。

致谢

在过去二三十年中，胶原基质检测技术已由多个不同的研究团队开发并不断完善。本文所述的多巴胺能和纹状体外植体方法极大地受益于这些研究。此外，作者感谢Asheeta Prasad在外植体纹状体培养体系建立过程中提供的帮助。本实验室的工作得到了人类前沿科学计划组织（职业发展奖）、荷兰卫生研究与发展组织（ZonMW-VIDI和ZonMW-TOP）、欧洲联盟（mdDA-NeuroDev项目，FP7/2007-2011，资助号222999）（资助对象：RJP）以及荷兰科学研究组织（TopTalent项目；资助对象：ERES）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
胎牛血清BioWhittaker14-801F
谷氨酰胺（200 mM）PAA LaboratoriesM11-004
HEPESVWR international441476L
β-巯基–乙醇Merck & Co., Inc.444203
最低必需培养基（MEM）GIBCO, by Life Technologies61100-087
Neurobasal 培养基GIBCO, by Life Technologies21103-049
B27GIBCO, by Life Technologies17504-044
Leibovitz’s L-15 培养基GIBCO, by Life Technologies11415-049
青霉素-链霉素GIBCO, by Life Technologies15070-063
Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂InvitrogenP36930
透析袋Spectrum Labs132660
兔抗酪氨酸羟化酶抗体Pel-Freez BiologicalsP40101-0
兔抗 Darpp32（H-62）抗体Santa Cruz Biotechnology, Inc.Sc-11365
小鼠抗βIII 微管蛋白抗体Sigma-AldrichT8660
Alexa Fluor 标记的二抗Invitrogen

参考文献

  1. van den Heuvel, D. M., Pasterkamp, R. J. Getting connected in the dopamine system. Prog. Neurobiol. 85, 75-93 (2008).
  2. Lobo, M. K. Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future. Int. Rev. Neurobi....

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