移植物抗宿主病的诱导 在体 内 使用MHC匹配的小鼠模型监测T细胞

摘要

小鼠骨髓移植是一种广泛使用的技术，用于研究调控人类移植物抗宿主病的免疫学机制。体内监测T细胞迁移模式的能力，使得能够对移植物抗宿主病过程中T细胞反应的发生与发展进行详细分析。

摘要

移植物抗宿主病（GVHD）是限制骨髓移植作为多种血液系统疾病治愈疗法广泛应用的主要障碍。GVHD 是由骨髓移植物中存在的成熟同种反应性T细胞引起的，这些T细胞被输注到受体体内后会攻击并损害宿主器官。然而，在小鼠模型中，必须向骨髓接种物中额外添加T细胞才能诱发GVHD。尽管已有大量研究致力于表征移植后T细胞的免疫应答，生物发光成像技术仍是一种用于在活体（in vivo）中无创监测T细胞迁移模式的有效方法。

经致死剂量照射后，受体小鼠被移植来自供体小鼠的骨髓细胞和脾细胞。移植物中包含来自L2G85.B6（组成型表达荧光素酶的转基因小鼠）的T细胞亚群。通过仅移植特定T细胞亚群，可实现对特定T细胞亚群的追踪 体内，并根据其位置，针对特定T细胞亚群在不同时间点促进移植物抗宿主病（GVHD）的作用提出假设。在移植后预设的时间点，使用Xenogen IVIS CCD相机对受体小鼠进行成像。利用Living Image软件对光强度进行定量，以光子强度为基础生成伪彩色图像（红色表示高强度，紫色表示低强度）。

移植后4至7天，受体小鼠开始出现移植物抗宿主病（GVHD）的临床症状。Cooke 等¹ 建立了一种评分系统，根据受体小鼠的毛发质地、皮肤完整性、活动能力、体重减轻和姿势来量化疾病进展。小鼠每日进行评分，当其进入濒死状态时实施安乐死。受体小鼠通常在移植后20至30天进入濒死状态。

小鼠模型是研究移植物抗宿主病（GVHD）免疫学的宝贵工具。选择性移植特定T细胞亚群有助于精确识别各亚群所发挥的作用。非侵入性地在活体（in vivo）追踪T细胞反应，为小鼠GVHD模型增添了更高层次的研究价值。

方案

1. 致死性照射

1. 将最多10只受体小鼠放入与所用辐照仪兼容的独立通风笼具中。
2. 以两次相等剂量进行辐照，总剂量为9 cGy（BALB.B受体小鼠）。第二次辐照应在第一次辐照后3小时进行。注射应在最后一次辐照后4–6小时内进行。可使用Cs¹³⁷源或RS2,000辐照仪对小鼠进行辐照。
3. 给予第二次辐射剂量后，将小鼠置于含有酸化水的独立通风笼具中，直至移植时使用。

2. 脾细胞制备

1. 根据机构指南对一只供体小鼠实施安乐死。每只供体通常可获得 75×10⁶ - 125×10⁶ 个脾细胞。使用 CD8 纯化试剂盒时，每只小鼠通常可获得 6×10⁶ - 12×10⁶ 个 CD8 T 细胞。
2. 在肋骨下方距腹中线右侧 2 cm 处做一条垂直的 2 cm 切口，切开毛皮、皮肤和脏层腹膜，暴露并取出脾脏。
3. 将脾脏置于含 1640 RPMI 培养基（添加 5% FBS）的培养皿中的 40 μm 细胞筛网上，用注射器活塞研磨脾脏，直至整个脾脏组织均通过筛网，制成单细胞悬液。
4. 对每只野生型（WT）和 L2G85.B6 供体小鼠重复此操作。将所有野生型单细胞悬液收集至一个 50 ml 锥形管中，将所有 L2G85.B6 单细胞悬液收集至另一个独立的 50 ml 锥形管中。
5. 在 4 °C 条件下以 1,200 rpm 离心 10 分钟。弃上清后用含 5% FBS 的 1640 RPMI 培养基重悬细胞沉淀，并进行细胞计数。

3. 骨髓制备

1. 取一只供体小鼠的一条后肢，去除皮肤。
2. 尽可能仔细地剔除股骨和胫骨/腓骨上的肌肉组织。
3. 在髋关节处切断股骨，取下后肢；在胫骨/腓骨交界下方剪除后足。所有骨骼切割均应使用坚固的剪刀进行。
4. 仔细清除残留的肌肉组织。剪除腓骨——腓骨中骨髓含量极少，不值得保留。
5. 将后肢置于含5% FBS的冷RPMI 1640培养基中，并对第二条后肢重复上述操作。每只小鼠可获得约20×10⁶ - 40×10⁶ 个骨髓细胞。

4. 骨髓移除

1. 从培养基中取出一个后肢，放入含有少量冷培养基（约 1 ml）的大培养皿中。
2. 切除膝关节。使用注射器（体积 > 5 ml），将皮下针头插入胫骨，推动注射器活塞，直至胫骨内部所有红色组织被完全清除。对股骨重复此操作。弃去不含骨髓的剩余骨骼。对另一后肢重复上述过程。
3. 通过将含有骨髓的培养基用移液器吹打至大培养皿中，并使用注射器活塞和 40 μm 细胞筛网，制备单细胞悬液。将单细胞悬液转移至 50 ml 锥形管中，并置于冰上保存。

5. CD3 耗竭

有多种方法可以从骨髓中耗竭CD3+细胞。本实验室使用Miltenyi Biotec公司生产的试剂盒（CD3-biotin - 130-093-021）。请按照制造商提供的操作说明从骨髓中耗竭CD3+细胞。Miltenyi试剂盒所用缓冲液此后均称为MACS缓冲液（含2 mM EDTA、0.5% BSA的PBS，pH 7.2）。

1. 通过在 4 °C 条件下以 1200 rpm 离心脾细胞和骨髓细胞 10 分钟来洗涤细胞，并进行细胞计数。
2. 彻底移除所有上清液。将骨髓细胞重悬于 MACS 缓冲液中，每 1000 万个骨髓细胞加入 100 μl 缓冲液。
3. 按照生产商提供的操作说明继续进行 CD3 耗竭步骤。
4. 用无菌 PBS 洗涤 CD3 耗竭后的骨髓细胞 3 次。对 CD3 耗竭后的骨髓细胞进行计数，并重悬于适当体积的溶液中，用于注射 10⁷ 个细胞。

6. L2G85.B6 CD8+ T 细胞纯化

有多种方法可从 L2G85.B6 小鼠中纯化 CD8 T 细胞。此外，也有多种方法可从野生型脾细胞供体中耗竭 CD8 T 细胞。本实验室使用 Miltenyi Biotec 的试剂盒（CD8 耗竭 - 130-049-401，CD8 纯化 - 130-095-236）。

1. 按每 10⁷ 个细胞加入 90 μl MACS 缓冲液重悬 WT 细胞沉淀。根据生产商说明书进行 CD8 T 细胞去除（CD8 去除 - 130-049-401）。
2. 按每 10⁷ 个细胞加入 40 μl MACS 缓冲液重悬 L2G85.B6 细胞沉淀。根据生产商说明书进行 CD8 T 细胞纯化（CD8 纯化 - 130-095-236）。
3. 分别计数各细胞群体，并用无菌 PBS 洗涤三次。将各细胞群体重悬于适当体积的缓冲液中，以便注射 18×10⁶ 个 WT（CD8 去除）脾细胞和 2×10⁶ 个 L2G85.B6 纯化的 CD8 T 细胞。

7. 注射液的制备

1. 在微量离心管中混合10⁷个CD3耗竭的骨髓细胞、18×10⁶个野生型（CD8耗竭）脾细胞以及2×10⁶个纯化的L2G85.B6 CD8 T细胞。用无菌PBS洗涤后重悬于300 μl中。
2. 将细胞悬液通过尾静脉注射至受体小鼠体内。注射时应使用28号针头。
3. 将小鼠饲养于微隔离器笼中，并提供酸化水。每日使用Cooke et al¹建立的移植物抗宿主病（GVHD）评分系统对小鼠进行评分。

8. 生物发光成像

1. 移植后第六天，向受体小鼠注射 4 mg D-荧光素。静置 5 分钟，使荧光素与荧光素酶充分反应。
2. 将小鼠置于生物发光成像仪的异氟烷麻醉腔中进行麻醉，并以小 binning 模式对受体小鼠进行 5 分钟成像。该设置可在尽可能捕获信号事件的同时获得高分辨率图像。
3. 使用 Living Image 软件分析数据。可根据需要调整伪彩图像的显示尺度以获得最佳可视化效果，但在不同实验间必须使用相同的尺度。
4. 可利用 Living Image 软件定义感兴趣区域，并通过计算每个感兴趣区域发射的光通量（光子数/秒）来定量分析发光强度。

9. 代表性结果

移植后约7-10天，小鼠开始出现移植物抗宿主病（GVHD）的临床症状。由于缺乏理毛行为，小鼠外观显得毛发杂乱。受体小鼠在移植后7-10天之间也开始出现体重下降。受体小鼠的活动能力和姿势在移植后约第12-14天之前仍保持相对正常。移植后前2-3周内，累积的GVHD评分将稳步上升（图1A）。不同小鼠之间的疾病进程存在较大差异；然而，所有受体小鼠应在移植后30-40天内一致地死于GVHD（图1B）。

图2显示了移植后第6天成像的受体小鼠。伪彩色标尺显示了光发射在体内的分布情况，其中脾脏和肠道的光强度最高。肠道中CD8 T细胞的聚集与先前的研究结果一致⁶。受体小鼠可重新放回独立通风隔离笼中，以便在后续时间点进行成像，或进行安乐死以开展离体成像（ex vivo imaging）。

标准	0级	1级	2级
体重减轻（每周）	< 10%	> 10% - < 25%	>25%
姿势	正常	仅在静止时出现弓背	频繁弓背；影响活动能力
活动性	正常	活动性轻度至中度下降	静止不动，除非受到刺激
毛发质地	正常	轻度至中度毛发蓬乱	严重蓬乱/理毛不良
皮肤质地	正常	足垫/尾部出现脱屑	明显存在脱毛性皮肤区域

表1. Cooke 等于1996年建立了该评分系统¹。应每天对每只小鼠左侧列出的每一项标准进行评分。每项标准给予0-2分，总分是所有单项得分的总和。

图1. 致死剂量照射的BALB.B小鼠单独移植10⁷个骨髓细胞，或联合移植18×10⁶个CD8 T细胞耗竭的野生型（WT）脾细胞和2×10⁶个纯化的L2G85.B6 CD8 T细胞。A) 单独移植骨髓细胞，或联合移植CD8 T细胞耗竭的野生型脾细胞和纯化的L2G85.B6 CD8 T细胞受体的临床评分数据。B) 上述各组受体小鼠的生存数据。 点击此处查看高清大图。

图 2. 经致死剂量照射的 BALB.B 小鼠单独移植 10⁷ 个骨髓细胞，或同时移植 18×10⁶ 个 CD8 T 细胞耗竭的野生型脾细胞和 2×10⁶ 个纯化的 L2G85.B6 CD8 T 细胞。受体小鼠通过腹腔注射 4 mg D-荧光素酶底物，并使用 Xenogen IVIS 系统在小 binning 模式下成像 5 分钟。图像以伪彩色显示，其中紫色表示低强度，红色表示高强度。感兴趣区域涵盖整只小鼠，定量分析总荧光通量（光子/秒）。

图3. 致死剂量照射的BALB.B小鼠单独移植了10⁷个骨髓细胞，或联合移植18×10⁶个CD8 T细胞耗竭的野生型脾细胞和2×10⁶个纯化的L2G85.B6 CD8 T细胞。受体小鼠通过腹腔注射4 mg D-荧光素，并使用Xenogen IVIS系统在小 binning 模式下成像5分钟。伪彩色图像中，紫色表示低强度，红色表示高强度。受体小鼠分别在A）移植后第4天、B）第6天和C）第8天进行成像。

讨论

本文所述的小鼠移植物抗宿主病（GVHD）诱导方案代表了一种具有临床相关性的小鼠GVHD模型。该模型最初由Berger et al. 于1994年建立，采用C57Bl/6移植至BALB.B品系的组合，属于MHC匹配模型，其GVHD死亡率由CD4依赖性的CD8 T效应细胞介导²，与最常见的临床情况高度相似³。已知在此模型中单独移植CD8 T细胞不会引起GVHD；然而，当CD4和CD8 T细胞同时存在时，疾病进展显著比仅存在CD4 T细胞时更为严重。此外，已有大量研究揭示了该模型中针对次要组织相容性差异的免疫应答存在免疫优势层级¹⁰。然而，关于T细胞亚群在GVHD不同阶段所起作用仍存在一些不确定性⁴。本实验室未发表的研究表明，CD4 T细胞在GVHD早期事件中起主导作用，而CD8 T细胞则在后期时间点占主导地位。

追踪T细胞聚集模式的能力 体内 是一种强大的工具，有望用于检验关于CD4和CD8 T细胞在移植物抗宿主病（GVHD）过程中作用的假设。表达萤火虫荧光素酶的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RPMI 1640	Invitrogen	12633-012
胎牛血清	Invitrogen	10439016
40 μM 细胞滤筛	BD Biosciences	352340
CD3e-生物素	Miltenyi Biotec	130-093-021
抗生物素微珠	Miltenyi Biotec	130-091-147
CD8a 微珠	Miltenyi Biotec	130-049-401	用于从脾脏中耗竭 CD8 T 细胞。
CD8a 纯化抗体混合物	Miltenyi Biotec	130-095-236	用于从脾脏中纯化 CD8 T 细胞。
D-荧光素	Caliper Life Sciences	122796