该方法可实现高产量 体外 从含有线性化质粒的模板合成带帽和无帽mRNA 高斯荧光素酶 荧光素酶（GLuc）基因。RNA经纯化后，取部分未加帽RNA通过酶法加帽 痘苗病毒 病毒加帽酶。最后一步中，将mRNA转染至HeLa细胞，并检测细胞培养上清液中的荧光素酶活性。
本文内容
摘要
摘要
体外转录是指由RNA聚合酶以包含相应启动子序列（T7、T3、SP6）及待转录基因的线性DNA模板为模板合成RNA转录本的过程（图1A）。典型的转录反应体系包含模板DNA、RNA聚合酶、核糖核苷三磷酸、RNase抑制剂以及含有Mg2+离子的缓冲液。
高质量的RNA通常被大量需要用于多种应用。使用 体外 转录已被报道用于RNA结构与功能研究，例如剪接1哺乳动物细胞中的RNAi实验2，通过“Eberwine方法”进行反义RNA扩增3，微阵列分析4 以及用于RNA疫苗研究5该技术还可用于制备放射性标记和荧光染料标记的探针6. Warren, 等 通过转染实现人类细胞重编程的最新报道 体外 转录的带帽RNA7New England Biolabs 公司的 T7 高产 RNA 合成试剂盒设计用于在每 20 μl 反应体系中合成高达 180 μg 的 RNA。使用该试剂盒已成功转录长度达 10 kb 的 RNA。只要在待转录基因的上游含有 T7 启动子序列，即可使用线性化质粒 DNA、PCR 产物和合成 DNA 寡核苷酸作为转录模板。
在真核生物中，为RNA添加5'端帽结构是一个重要的过程。该过程对于RNA的稳定性8、高效翻译9、核内运输10以及剪接11至关重要。该过程涉及在RNA的5'三磷酸末端添加一个7-甲基鸟苷帽结构。RNA加帽可通过转录后使用加帽酶或在转录过程中使用帽类似物来实现。在酶法加帽中，使用痘苗病毒（Vaccinia）加帽酶对mRNA进行加帽12,13。该酶以GTP和S-腺苷甲硫氨酸作为供体，在RNA的5'端添加7-甲基鸟苷帽（即帽0结构）。两种方法均可产生具有功能活性的加帽RNA，适用于转染或其他应用14，例如用于反向遗传系统中病毒基因组RNA的制备15，以及对eIF4E等帽结合蛋白进行晶体学研究16。
在下述方法中，使用 NEB 的 T7 高产 RNA 合成试剂盒合成Gaussia荧光素酶（GLuc）和Cypridina荧光素酶（CLuc）的加帽与未加帽 RNA 转录本。取部分未加帽的 GLuc RNA，利用痘苗病毒加帽系统（NEB）进行加帽。以含有 GLuc 或 CLuc 基因及 T7 启动子的线性化质粒作为模板 DNA。将转录所得的 RNA 转染至 HeLa 细胞，并检测细胞培养上清液中的荧光素酶活性。其中，加帽的 CLuc RNA 用作内参对照，以标准化 GLuc 的表达水平。
方案
RNase 常见于皮肤、头发、灰尘、实验台表面、溶液等处。操作前应佩戴手套，并彻底清洁实验台面、移液器等，以避免 RNase 污染。强烈建议使用无核酸酶的移液器吸头、离心管、玻璃器皿和试剂。
1. 体外 使用T7高产率RNA合成试剂盒进行转录
转录反应所用的DNA模板是含有Gaussia荧光素酶基因的线性化质粒，该基因编码序列上游包含一个T7启动子（图1B）。
- 从T7高产量RNA合成试剂盒中取出各组分，解冻后置于冰上保存。
- 对于未加帽RNA，在室温下按以下顺序设置反应体系：
| 组分 | 体积 (μl) | 终浓度 |
| 无核酸酶水* | X | |
| 10X 反应缓冲液 | 2 | 1X |
| ATP (100 mM) | 2 | 10mM |
| CTP (100 mM) | 2 | 10mM |
| UTP (100 mM) | 2 | 10mM |
| GTP (100 mM) | 2 | 10mM |
| 模板 DNA * | X | 1 μg |
| T7 RNA 聚合酶混合液 | 2 | |
| 总体积 | 20 |
*加入1 μg DNA，并用无核酸酶水补足总体积至20 μl。所加水量需根据模板DNA的浓度进行调整。
- 对于加帽RNA：按以下顺序在室温下设置反应体系：
| 组分 | 体积 (μl) | 终浓度 |
| 无核酸酶水* | X | |
| 10X 反应缓冲液 | 2 | 1X |
| ATP (100 mM) | 2 | 10mM |
| CTP (100 mM) | 2 | 10mM |
| UTP (100 mM) | 2 | 10mM |
| GTP (20 mM) | 2 | 2mM |
| 3´-O-甲基-m7G(5')ppp(5')G 帽类似物 (ARCA)(40mM) | 4 | 8mM |
| 模板 DNA* | X | 1 μg |
| T7 RNA 聚合酶混合液 | 2 | |
| 总体积 | 20 |
*加入1 μg DNA，并用无核酸酶水补足总体积至20 μl。所加水量根据模板DNA的浓度而定。
- 充分涡旋混匀，然后在干燥空气培养箱中37 °C孵育反应体系2小时。
- 参照步骤1.3–1.4，从含有CLuc基因的线性化质粒合成Cypridina荧光素酶（CLuc）的加帽转录本。该mRNA将与加帽及未加帽的GLuc mRNA共转染，用于GLuc表达的归一化。
2. 去除模板DNA
在进行纯化之前，用DNase I处理转录反应以去除DNA模板。
- 向转录反应中加入 70 μl 无核酸酶水，然后加入 10 μl DNase I 反应缓冲液。
- 向反应体系中加入 2 μl DNase I。
- 在干式空气恒温培养箱中 37 °C 孵育 15 分钟。
3. 带帽与去帽RNA的柱纯化
- 根据制造商说明，使用 MEGAclear 试剂盒纯化加帽和未加帽的 RNA（也可使用任何基于离心柱的 RNA 纯化试剂盒）。
- 使用 NanoDrop 分光光度计对 RNA 进行定量。
- 根据制造商说明，使用 Agilent RNA 6000 Nano 试剂盒和 Agilent 2100 生物分析仪评估 RNA 样品的质量。
4. 使用以下方法进行RNA加帽 痘苗病毒 封端系统
- 取10 μg纯化的未加帽GLuc mRNA。
标准加帽反应最多可对10 μg（100个核苷酸或更长）的RNA进行加帽。如果需要对更大量的RNA进行加帽，可相应扩大反应体系。
- 用无核酸酶水将体积调至 15 μl。
- 将 RNA 在 65 °C 下加热 10 分钟以去除二级结构，然后置于冰上 5 分钟。
- 为建立加帽反应，在 15 μl 变性 RNA 中加入 2 μl 10X 加帽缓冲液、1 μl GTP（10 mM）、1 μl 新鲜稀释的 S-腺苷甲硫氨酸（2 mM）和 1 μl（10 单位）痘苗病毒加帽酶。
- 轻轻涡旋混匀，于干式空气孵育器中 37 °C 孵育反应 30 分钟。
5. 帽子结构RNA的柱纯化
- 使用MEGAclear试剂盒纯化加帽RNA（也可使用任何基于离心柱的RNA纯化试剂盒）。
- 根据生产商说明书，使用Agilent RNA 6000 Nano试剂盒和Agilent 2100生物分析仪评估RNA样品质量。
6. 使用 TransIT mRNA 转染试剂盒进行 HeLa 细胞转染
- 在48孔板中接种HeLa细胞，每孔加入150 μl高糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM），并添加10%胎牛血清（每孔细胞数为0.7–2.3 × 105个）。
- 于37 °C孵育16–24小时，使细胞融合度达到60–90%。
- 将GLuc（带帽和去帽）及CLuc RNA稀释至100 ng/μl的浓度。
每次转染均设置8个重复。
- 准备8个离心管 管。向每根管中加入 1 μl 未加帽的GLuc RNA， 1 μl 加帽CLuc RNA（用于归一化）和 25 μl 无血清DMEM。充分混匀。
- 准备8个离心管，向每个管中加入 1 μl 加帽GLuc RNA（帽类似物）， 1 μl 加帽的CLuc RNA（用于标准化）和 25 μl 无血清DMEM。充分混匀。
- 准备8个离心管，向每个管中加入 1 μl 加帽GLuc RNA（痘苗病毒), 1 μl 加帽的CLuc RNA（用于标准化）和 25 μl 无血清DMEM。充分混匀。
- 添加 0.2 μl 向第一组8个试管中加入mRNA增强试剂并混匀。
- 添加 0.2 μl 转录将IT mRNA试剂加入第一组8个试管中并混匀。
- 室温孵育2-5分钟。（孵育时间不得超过5分钟）。
- 将转染混合物逐滴加入含有 HeLa 细胞培养物的孔中（参考 图3 用于平板设置。
- 重复步骤7至10，使用2nd 和 3rd 8支试管为一组
- 37 °C下孵育过夜（16小时） 37 °C 在5% CO₂中2.
7. Gaussia 荧光素酶（GLuc）检测
使用 BioLux Gaussia 荧光素酶检测试剂盒，检测每个孔上清液中的 GLuc 活性，步骤如下：
- 通过将15 μl BioLux GLuc底物加入1.5 ml BioLux GLuc测定缓冲液中，配制新鲜的测定溶液（每个样品需要50 μl测定溶液）。根据样品数量以及 luminometer 注射器的预冲洗需求，配制足量溶液（参见制造商说明书）。
- 通过反复倒置试管充分混匀（切勿涡旋振荡）。
使用来自 Berthold Technologies 的 Centro LB 960 微孔板发光仪测量发光值。
- 将化学发光仪设置为50 μl的注射体积和2-10秒的积分时间。
- 从每个孔中吸取10 μl细胞培养上清液，加入至96孔黑色板中。
- 用检测溶液预冲洗注射器，然后进行化学发光信号的测定。
- 未转染孔获得的数值将作为阴性对照。
8. Cypridina 荧光素酶（CLuc）检测
使用 BioLux Cypridina Luciferase Assay Kit 检测每个孔上清液中的 CLuc 活性，步骤如下：
- 根据试剂盒说明书中的说明，配制新鲜的复溶底物（100倍浓缩液）。
- 解冻 BioLux Cypridina 荧光素酶检测缓冲液并充分混匀（避光操作）。
- 为配制 CLuc 检测溶液，将 15 μl 复溶底物（100倍浓缩液）加入 1.5 ml BioLux Cypridina 荧光素酶检测缓冲液中（每份样品需 50 μl 检测溶液）。请根据样品数量及发光仪进样器的预冲洗需求配制足量溶液（参见仪器制造商说明书）。
- 通过反复倒置管子充分混匀（勿用涡旋振荡器）。
- 将溶液在室温下放置 30 分钟（避光）。
使用Berthold Technologies公司的Centro LB 960微孔板发光仪测量发光值。
- 将化学发光仪设置为50 μl进样量，延迟1-2秒，积分2-10秒。
- 从每个孔中取10 μl细胞培养上清液加入至96孔黑色板中。
- 用CLuc检测试剂溶液预润进样器，并检测发光信号。
- 未转染孔所得数值将作为阴性对照。
9. 代表性结果
T7 高产量 RNA 合成试剂盒每 20 μl 反应可产生最多 180 μg 未加帽 RNA 以及 40 至 50 μg 加帽 RNA。在 Agilent 2100 生物分析仪上分析时，高质量且完整的 RNA 应显示为一个单一、尖锐的峰，代表 RNA 转录本。宽峰或多峰表明 RNA 发生了降解。此外，验证 RNA 的大小也非常重要。若 RNA 转录本长度长于预期，可能是由于模板质粒 DNA 消化不完全所致。RNA 降解和产量降低通常是由于模板 DNA 引入了污染物所致。图 2 展示了在生物分析仪上运行高质量、完整 RNA 后获得的电泳图谱和凝胶图像示例。
将带有5'端帽子结构和无帽子结构的GLuc RNA转染至HeLa细胞后，进行孵育，并检测细胞培养上清液中的荧光素酶活性。5'端帽子结构对于保护RNA免受外切核酸酶降解8以及促进mRNA的翻译起始9具有重要作用。因此，RNA加帽是转染实验中的关键步骤。共转录（帽类似物）方法可获得约40 μg RNA，其中约80%具有帽子结构。而利用痘苗病毒加帽酶的实验方案每反应可对最多10 μg RNA（长度≥100个核苷酸）进行加帽，效率接近100%。
图4展示了转染了加帽与未加帽RNA样本的细胞培养物之间荧光素酶表达水平的差异。可以明显看出，与转染未加帽RNA的细胞培养物（无荧光素酶活性）相比，转染加帽RNA的细胞培养物荧光素酶表达水平显著更高。此外，图4还证实了两种加帽技术——使用帽类似物和使用痘苗病毒加帽酶——均能成功生成具有功能性的加帽RNA转录本，并可被翻译成蛋白质。t检验得到的双尾p值为0.2583，表明两种加帽方法的发光数据之间无显著统计学差异。
图 1A。 T7 RNA 聚合酶介导的 RNA 合成
图 1B. 含有 GLuc 基因和 T7 启动子的 pCMV-GLuc 载体。
图 2. 加帽与未加帽RNA的Bioanalyzer电泳图谱及凝胶样图像。X轴表示RNA的核苷酸（nt）长度，Y轴表示荧光单位（FU）。A）纯化后GLuc mRNA（未加帽）的电泳图谱。B）使用Vaccinia加帽酶加帽的GLuc mRNA（加帽）的电泳图谱。C）通过共转录方式使用加帽类似物加帽的GLuc mRNA的电泳图谱。D）由Bioanalyzer生成的凝胶样图像。'L'泳道为RNA标记物，泳道1为未加帽的GLuc mRNA，泳道2为使用加帽类似物加帽的GLuc mRNA，泳道3为使用Vaccinia加帽酶加帽的GLuc RNA。
图3. HeLa细胞转染实验孔板设置示例。每个孔中的HeLa细胞铺板密度为60-90%融合度。向每孔加入转染混合物，包含相应类型的GLuc RNA（未加帽、使用帽类似物加帽或使用Vaccinia加帽酶加帽）、用于归一化的加帽CLuc RNA、mRNA Boost试剂和TransIT mRNA试剂。每次转染设8个重复孔（图中相同颜色的孔代表重复）。
图 4.HeLa 细胞中的 GLuc 表达。将纯化的加帽和未加帽 GLuc mRNA 转染至 HeLa 细胞中，并在 37 °C 下孵育过夜（16 小时）。收集每孔的细胞培养上清液，检测 GLuc 和 CLuc 活性，并记录发光值。GLuc 的发光值以加帽 CLuc RNA 的发光值为基准进行标准化。
* 在归一化之前，已从 GLuc 和 CLuc 值中减去未转染细胞的发光信号。
商标
BioLux 是 New England Biolabs, Inc. 的商标。
TransIT 是 Mirus Bio LLC 的注册商标。
MEGAclear 是 Ambion 的商标。
讨论
体外转录是一种用于获得高产量 RNA 的有效方法，适用于多种应用。使用 T7 高产量 RNA 合成试剂盒的主要优势在于其配方经过优化，可实现 RNA 的高产量。此外，试剂盒中提供的试剂不含污染性核酸酶，从而能够合成高质量、完整的 RNA 转录本。该试剂盒设计具有高稳定性和灵活性，可用于合成 mRNA、荧光标记 RNA、高比活性放射性标记探针以及加帽 RNA。试剂盒说明书列出了每种应用所需的具体操作步骤和附加材料，还包含有关使用 PCR 产物和合成 DNA 寡核苷酸作为转录模板的技术信息。需要注意的是，该转录试剂盒仅能使用含有 T7 启动子的 DNA 模板。
本文所述方法展示了使用痘苗病毒加帽酶进行转录后RNA加帽，以及使用RNA帽结构类似物进行共转录加帽。我们已证明，这两种方法合成的加帽RNA在转染后均具有功能活性。5'帽结构可提高RNA的稳定性及翻译效率，因此对于显微注射11和转染7实验至关重要。共转录加帽方法可生成40–50 μg、约80%加帽率的RNA。需要注意的是，使用在m7G的3'-羟基位点被阻断的3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA帽类似物（ARCA），可确保帽结构以正确方向整合17。若需制备更大量RNA，可对两种加帽方法的标准反应体系进行放大。然而，从成本角度考虑，使用痘苗病毒加帽系统更为经济可行，因为共转录加帽所用的帽类似物是一种相对昂贵的组分。此外，痘苗病毒加帽系统的加帽效率接近100%，因此也是一种更优的方法。
上述描述的RNA加帽方法可在RNA的5'末端合成具有帽0（cap 0）结构的RNA。帽1（cap 1）结构则涉及RNA末端第一个核苷酸核糖糖基的2'-O位点的额外甲基化。已有研究报道，帽1结构可提高RNA的翻译效率18，可通过使用2'-O-甲基转移酶实现该结构的引入20, 21。
本文所述方法可用于转录、加帽和转染任何目标 mRNA。本实验方案特别选用了荧光素酶 GLuc 和 CLuc，因其具有多种优势：它们可直接分泌到细胞培养基中，因而无需细胞裂解步骤；此外，它们产生的生物发光信号强度高，活性检测灵敏度高且操作简便。需要注意的是，细胞中 GLuc 的表达可能受到除 RNA 自身功能外多种因素的影响，例如移液误差、每孔细胞数量差异、转染效率不同等。为校正这些因素的影响，需进行数据归一化处理。在本方案中，我们通过将 CLuc RNA 作为内参与 GLuc RNA 共转染。将 GLuc 发光信号除以 CLuc 对照值后，即可对转染过程中的误差和变异进行归一化校正19。
披露
所有作者均为新英格兰生物实验室股份有限公司的员工。
致谢
Dongxian Yue, Brett Robb, George Tzertzinis, Tanya Bhatia, Breton Hornblower
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| T7 高产 RNA 合成试剂盒 | New England Biolabs | E2040S | |
| 3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G RNA 帽结构类似物 | New England Biolabs | S1411S | |
| DNase I（RNase-free） | New England Biolabs | M0303S | |
| 痘苗病毒加帽系统 | New England Biolabs | M2080S | |
| MEGAclear 试剂盒 | Ambion | AM1908 | |
| NanoDrop 分光光度计 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Agilent RNA 6000 Nano 试剂盒 | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| Agilent 2100 生物分析仪 | Agilent Technologies | G2939AA | |
| TransIT mRNA 转染试剂盒 | Mirus Bio LLC | MIR2250 | |
| HyClone* 经典液体培养基：高糖 Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30285.01 | |
| HyClone 非必需氨基酸 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30238.01 | |
| Centro LB 960 | Berthold Technologies | ||
| BioLux Gaussia 荧光素酶检测试剂盒 | New England Biolabs | E3300S | |
| BioLux Cypridina 荧光素酶检测试剂盒 | New England Biolabs | E3309S | |
| RNase 抑制剂，小鼠来源 | New England Biolabs | M0314 | |
| RNase 抑制剂，人胎盘来源 | New England Biolabs | M0307 | |
| pCMV-GLuc 对照质粒 | New England Biolabs | N8081 |
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