评估酒精暴露胎儿斑马鱼模型中的致畸变化

摘要

为了理解乙醇诱导的发育损伤的分子机制，我们建立了一种乙醇暴露的斑马鱼模型，并正在探索乙醇暴露后发生的物理、细胞和遗传改变¹。随后，我们试图在此动物模型中寻找潜在的干预措施并快速对其进行测试。

摘要

胎儿酒精综合征（FAS）是胚胎期暴露于乙醇所引起的一种严重表现，其特征为面部和器官的典型缺陷，以及因大脑发育紊乱和损伤导致的智力障碍。胎儿酒精谱系障碍（FASD）是一个涵盖性术语，用于描述由母亲孕期饮酒所引发的一系列出生缺陷，在美国约有4%的新生儿受此影响。由于约50%育龄女性报告曾饮酒，且一半以上的妊娠为非计划妊娠，因此乙醇的非故意暴露仍是一个持续存在的问题²。为了更好地理解乙醇造成的损害，并建立可用于测试潜在干预措施的模型，我们开发了一种利用斑马鱼胚胎研究发育期乙醇暴露的模型。斑马鱼非常适合此类致畸物研究^3-8。每对斑马鱼可产下数百枚卵，且收集过程不会对成鱼造成伤害。斑马鱼胚胎具有透明特性，可方便地使用多种染色方法进行成像观察。通过对不同剂量、不同暴露时长和施用时间的乙醇处理后胚胎进行分析，发现乙醇引起的整体发育缺陷与人类出生缺陷具有一致性。本文将介绍用于研究和操作斑马鱼FAS模型的基本技术。

方案

1. 胚胎的乙醇处理

1. 来自野生型交配的斑马鱼胚胎在5 ml胚胎水（Milli-Q水添加60 mg/L Instant Ocean）中于28 °C条件下培养。不同品系的野生型胚胎对乙醇暴露的耐受性略有差异⁹。
2. 乙醇暴露从囊胚期（约受精后4.3小时，hpf）开始，持续所需时间，最长可达24小时脉冲处理。该起始阶段大致相当于哺乳动物胚胎的着床阶段，即原肠胚形成之前。所用乙醇浓度范围为0.2%–2.5%（体积/体积）。实验表明，水溶液中的乙醇有25–50%会进入发育中的胚胎^{10, 11}。胚胎在28 °C条件下维持所需时间。在完成所需时间的乙醇暴露后，移除乙醇-水溶液，并用普通斑马鱼水清洗三次，随后继续在正常条件下培养至所需时间。所产生缺陷的特异性取决于乙醇处理的起始时间、剂量以及脉冲持续时间。

2. 用于RNA提取的胚胎收集 原位 杂交、抗体与软骨染色

1. 为进行qPCR获取mRNA，收集年龄匹配的胚胎至离心管中。去除斑马鱼培养用水后，加入含TCEP的裂解缓冲液。使用电动研磨器在裂解液中对胚胎进行物理破碎。随后将裂解液通过预清除柱，以去除未完全解离的大块组织。所得溶液包含裂解过程中释放的所有大分子物质。通过柱式法提取RNA，包括洗涤步骤及DNase处理。洗脱使用水或试剂盒生产商（5'-Prime）提供的洗脱液进行。提取的RNA可通过标准方法反转录为cDNA用于qPCR分析，或直接用于微阵列分析。
2. 对于 原位 杂交与抗体染色实验中，将6至24小时受精龄（hpf）的胚胎在4%多聚甲醛中于4 °C过夜固定。随后用含0.1%吐温的磷酸盐缓冲液（PBT）洗涤3次，以防止胚胎相互粘连。接着将胚胎依次经过3次甲醇:PBT混合液洗涤，转移至100%甲醇中，此后可于-20 °C保存。这些胚胎可用于后续实验 原位 杂交或抗体染色。某些抗体在甲醇处理后无法正常工作，因此需注意这一限制，并对您所使用的特异性抗体进行测试，以确定其在甲醇处理后是否仍有效。
3. 对于软骨染色，胚胎需培养至受精后5至6天。随后在4 °C条件下用4%多聚甲醛固定过夜，接着用PBT缓冲液洗涤3次。

3. 评估乙醇诱导的基因表达变化及发育影响

1. 为了确定基因表达水平的变化，通过qPCR和原位杂交（in situ hybridization）检测目标基因。qPCR所用引物使用Integrated DNA Technologies（IDT）软件设计，并利用3个独立的生物学重复样本进行验证。引物验证成功后，对从收集的RNA样本反转录得到的cDNA进行qPCR分析，每个样本设三个技术重复。PCR反应使用Platinum SYBR Green qPCR SuperMix（Invitrogen），在Chroma-4 PCR仪（BioRad）或具有多色检测系统的类似PCR仪上进行。除目标基因外，必须使用一组对照引物以校正cDNA或RNA制备过程中可能存在的微小差异。对于斑马鱼胚胎，我们使用gapdh作为内参基因，其引物序列为：5'GAAGGTGGGAAACTGGTCAT3' 和 5'TTGCACCACCCTTAATGTGA3'。目标基因的表达水平将归一化至gapdh的表达水平，并采用Pfaffl方法对2^-ΔΔCt进行修正，以实验组相对于野生型的倍数变化形式展示数据¹²。常规计算方法假设每个PCR循环中所有基因的DNA扩增均为两倍，因此将实验基因的变化量与参照基因的变化量之比表示为以整数“2”为底的幂运算，该“2”代表理想PCR反应中每循环一次DNA数量翻倍的扩增效率。Pfaffl方法则用实验者测定的实际引物扩增效率替代通用的“2”，从而更准确地反映PCR反应中的差异。其完整公式为：
   

   （实验基因扩增效率）（对照样本Ct值 - 处理样本Ct值）

   -------------------------------------------------------------------------------------

   （参照基因扩增效率）（对照样本Ct值 - 处理样本Ct值）

2. 对于原位杂交（in situ hybridization），使用含有目的基因部分序列的质粒构建地高辛（digoxigenin, dig）标记的核糖探针。将年龄匹配的胚胎在标准条件下暴露于核糖探针¹³，并通过与碱性磷酸酶偶联的抗地高辛抗体进行检测，利用显色反应（NBT/BCIP）显示标记探针的定位。随后使用Leica体视显微镜观察胚胎（图1B-G）。
3. 为评估形态发生发育情况，于预定时间点收集胚胎并在体视显微镜下观察。对于体节形态的分析，直接对活体胚胎进行成像¹⁴；而对于眼间距和体长的测量，则需先将胚胎用PFA固定。在所有情况下，均在固定放大倍数下使用体视显微镜拍摄目标区域图像，并利用Adobe Photoshop软件进行测量^10,14。
4. 为检测处理对幼体斑马鱼软骨结构发育的影响，我们采用阿利新蓝（Alcian Blue）染色法。将固定的斑马鱼幼体置于含80%乙醇和20%冰醋酸（酸性乙醇）的阿利新蓝溶液中染色数小时或过夜。随后用酸性乙醇多次漂洗脱色，再转移至1% KOH和3%过氧化氢溶液中进一步清除色素细胞。斑马鱼需至少发育至4天龄才能观察到软骨结构，而5至6天龄的个体软骨结构更为清晰。
5. 活体胚胎中的细胞死亡通过吖啶橙（Acridine Orange, AO）进行评估。AO不能穿透活细胞膜，但可与膜完整性受损的细胞（如发生凋亡或坏死的细胞）中的DNA结合。将活体胚胎在PBS中与5 mg/mL AO共孵育1小时，随后用PBS洗涤3次。然后使用共聚焦显微镜进行成像，并将数字Z轴序列图像合并生成复合图像。

4. 斑马鱼胚胎的操作

1. 在鉴定出因乙醇暴露而表达下调的基因后，可尝试通过注射设计用于替代缺失基因的mRNA来进行补偿。带有帽结构的mRNA由线性化的DNA质粒作为模板，利用RNA聚合酶体外转录获得。 体外 转录试剂盒，按照制造商的说明进行操作（mMessage Machine，Applied Biosystems）。将25–200 pg/nl的RNA溶于0.1 M KCl溶液中，注射至1–2细胞期的斑马鱼卵内。注射后的胚胎在乙醇处理前先进行恢复，乙醇处理步骤如上所述。图5).
2. 对于任何因乙醇暴露而表达升高的基因转录本，均可利用反义吗啉环寡核苷酸技术进行降低或“敲低”。反义吗啉环寡核苷酸（AMOs）由 Gene Tools 公司设计，可根据实验需求阻断 RNA 向蛋白质的翻译过程，或阻断 RNA 的成熟与剪接过程。吗啉环寡核苷酸的作用可限制靶基因活性蛋白的生成量，若存在相应抗体，该蛋白表达水平的不足可通过免疫检测进行测量。RNA 剪接型吗啉环寡核苷酸的效率可通过 RT-PCR 检测剪接与未剪接转录本的相对含量进行评估。对吗啉环寡核苷酸进行梯度稀释，可产生剂量依赖性的效应¹⁵. AMO 在 Danieau 溶液（58 mM NaCl，0.7 mM KCl，0.4 mM MgSO₄，0.6 mM Ca(NO₃)₂，5.0 mM HEPES，pH 7.6）中稀释至工作浓度（经滴定确定，浓度范围为 pg 至 ng）。₄，0.6 mM Ca(NO₃)₂，5 mM HEPES，pH 7.6）。在1-2细胞期进行显微注射，随后让胚胎发育，再按上述方法进行乙醇处理。

5. 代表性结果

斑马鱼胚胎暴露于乙醇会导致多种发育和遗传缺陷，这些缺陷与其他脊椎动物中观察到的表型相关。我们已记录到轴向组织的异常发育，包括脊索（数据未显示¹⁴）。乙醇引起的发育延迟显然会破坏脊索的正常伸长过程，导致脊索变短且偶尔出现断裂（数据未显示¹⁴）。这种早期的发育延迟及脊索缺陷可能部分导致了体节后续出现的异常（图2），表现为体节失去了未处理对照组中明显的V形结构，而更接近于声波信号通路减弱时所典型的U形体节表型¹⁴。体节的角度可通过标准软件进行测量，未处理对照组胚胎的体节角度为92.1 ± 4.6°，而乙醇处理组则升高至122.6 ± 6.6°（p < 0.001）。

乙醇暴露的另一个后果可能是早期发育延迟以及后期脊索缺陷的下游效应，即胚胎体长缩短（图3）。即使在测量时已校正乙醇暴露引起的胚胎弯曲，乙醇暴露仍会导致躯干缩短，且缩短程度依赖于胚胎所暴露的乙醇剂量（图3E¹⁴）。这一发现与在发育期间暴露于乙醇的儿童中观察到的青春期前身材矮小持续存在的现象相似^{16, 17}，提示斑马鱼模型对于理解人类先天性出生缺陷具有相关性。

胎儿酒精综合征（FAS）的经典特征之一是典型的面部表型，包括下颌发育不良、眼裂较小以及人中平滑。这些特征大多与中线组织的发育减少有关。动物模型研究表明，严重的乙醇暴露会导致更为显著的表型，包括并眼和独眼畸形。当对斑马鱼胚胎施加较高剂量的乙醇时，其眼内距（IOD）呈剂量依赖性减小（图4），这与人类出生缺陷的特征一致。独眼畸形仅在极高剂量下出现，但较低剂量已能显著减小眼内距（图4），提示该动物模型在面部中线发育方面存在类似的缺陷¹⁰。

为了理解乙醇暴露导致机体和面部缺陷的潜在机制，我们试图确定在发育早期发生的基因表达变化，这些变化可能合理地预期会促成后续的发育缺陷。我们通过两种方法实现这一目标：从胚胎中提取 mRNA，可对乙醇处理组胚胎与对照组之间的基因表达水平进行定量评估（图1A）。此外，我们还可进行原位杂交，以观察基因的表达模式，无论其信号是否下降（图1B-G¹⁸）。在此示例中，展示了两个在乙醇暴露后表达水平降低的基因：gli1和six3b。当我们检测six3b的原位杂交模式时，确实发现乙醇暴露胚胎中该基因的表达空间范围有所缩小（图1 E-G）。在基因gsc中也观察到类似的表达减少现象（图B-D）。six3b和gsc均在将发育为颅面中线组织的细胞中表达。因此，在8 hpf时这些基因的表达减少与后续观察到的眼间距（IOD）减小结果一致，如图4所示。

一旦鉴定出受乙醇影响的基因，便可采用相应机制来上调或下调这些基因的表达。在此特定示例中，我们展示了2个表达下调的基因（gli1 和 six3b通过qPCR检测。我们选择注射mRNA，以确定逆转这些基因变化是否能够改善结局。在本实验中，不采用注射 gli1，我们选择注射 shh，一种能够增加的配体 gli1 水平。对于 six3b 我们能够注射 six3b 其本身。我们在注射后未发现任何变化 six3b （数据未显示），但通过补充剂能够基本挽救斑马鱼胚胎的严重缺陷 shh 注射（图5).

图1. 乙醇暴露改变了早期发育基因的表达模式和所选发育基因的表达水平。A）8小时受精胚胎（8hpf）的qPCR结果。显示了两个基因的结果： six3b 和 gli1结果显示为三次独立实验的平均值，所示乙醇剂量为2.5%。与对照组相比，两个基因的表达均显著降低（t检验， p < 0.05）。B-G） 原位 8小时受精龄斑马鱼胚胎的杂交。两者 gsc 和 six3b 此时点的模式与对照组相比发生改变。（经Loucks许可修改） 等 2007).

图 2. 经处理的胚胎中体节发育发生改变。在48小时后受精（hpf）时观察体节结构和角度。对照组胚胎（A）中，体节呈V形且角度尖锐。经乙醇暴露的斑马鱼体节则更多呈I形或U形，且角度更钝。（经Loucks和Ahlgren 2009年许可修改）。

图 3. 乙醇处理显著降低斑马鱼的体长。在受精后5天测量未经处理和暴露于乙醇的胚胎长度。所有经处理的胚胎均表现出显著的长度减少（ANOVA， p < 0.001）。B-D. 经1.0%和1.5%乙醇处理的胚胎总长度略有但显著的减少，而经2.0%和2.5%乙醇处理的胚胎则表现出更明显的长度减少。E. 为控制每批卵块的大小差异，将每次实验的对照组胚胎标准化为100，其兄弟胚胎的处理组结果以对照组的百分比表示。（经Loucks和Ahlgren 2009年许可修改）。

图 4. 乙醇暴露导致斑马鱼胚胎眼内距离（iod）减小。A）胚胎的正面观显示正常和眼睛融合的表型。B）在原肠胚形成期间给予不同剂量的乙醇处理3小时，24小时后检测鱼类的iod均出现减小。眼睛融合和独眼畸形仅在测试的最高剂量（2.4%）下观察到。* 表示与对照组相比，iod显著降低。（经Ahlgren, 2004许可修改）。

图 5. shh-NmRNA 注射可挽救乙醇暴露引起的斑马鱼胚胎整体发育缺陷。在单细胞至两细胞期胚胎中注射 100 pg/nl 的 shh-NmRNA，其中一半注射胚胎在 4.3 至 24 hpf 期间接受标准乙醇处理。在 5 dpf 时对胚胎进行分析。经 2.0% 乙醇处理的胚胎表现出尾部背侧弯曲、I 形体节以及包括独眼畸形在内的视眼缺陷。在 76 个注射胚胎中的 71 个（93%）观察到上述表型的挽救。在这些胚胎中，身体呈直线形，体节呈 V 字形，眼睛完全分离。

讨论

本文所述方法及展示的结果仅揭示了斑马鱼在研究发育缺陷方面的部分应用潜力。由于其胚胎易于获取、每次产卵数量众多，且实验结果具有高度可重复性，这些脊椎动物非常适用于致畸研究。此外，斑马鱼还可经基因改造以表达荧光分子，作为特定基因或通路的可视化报告系统¹⁹。在乙醇相关研究中，所使用的剂量相较于哺乳动物的血液酒精浓度似乎较高；然而，这些数值反映的是水中的乙醇浓度，而非全部乙醇均能进入胚胎体内。

综上所述，上述所描述并详述的方法表明，斑马鱼胚胎在模拟与乙醇暴露相关的人类出生缺陷方面具有重要价值。此外，斑马鱼中发现的基因表达变化已在哺乳动物模型系统中被其他研究者证实²⁰，提示乙醇对发育的影响在脊椎动物中具有保守性。上述许多技术也可用于其他环境或药物损伤，以快速、简便地检测潜在致畸物，并确定参与特定物质致畸作用的潜在机制。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
组织RNA试剂盒：5-Prime PerfectPure	赛默飞世尔科技	FP2302410
Platinum SYBR green qPCR SuperMix-UDG	英潍捷基	11733038
mMessage mMachine 高产量加帽RNA转录试剂盒	应用生物系统公司	取决于质粒中的RNA聚合酶