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小鼠精子冷冻保存与复苏——使用 I·Cryo 试剂盒

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DOI：

10.3791/3713

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2011年12月12日

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1Genetically Engineered Models and Services, Charles River , 2Research Models and Services, Charles River

本文内容

摘要

本文展示了新开发的 I•Cryo 小鼠精子冷冻保存试剂盒。使用该试剂盒，在5种小鼠品系中，冻融精子获得的二细胞期胚胎发育率 consistently 得到提高。在1.5年期间，利用 I•Cryo 试剂盒通过精子冷冻保存技术保存了49个基因修饰小鼠品系，并在后续通过体外受精成功恢复了这些品系。

摘要

自转基因和基因敲除技术问世以来，已培育出数千种新的转基因小鼠品系。这些珍贵的动物目前大多仅以活体形式存在，一旦发生紧急情况便没有备份方案。胚胎冷冻保存可提供此类备份，但成本较高，操作过程耗时较长，且通常需要大量动物才能成功。自从发现小鼠精子可在仅含18%棉子糖和3%脱脂奶粉的基础冷冻保护剂中成功冷冻保存以来，精子冷冻保存已成为存档、分发和恢复这些珍贵品系的一种可接受且经济有效的方法。

本文展示了一种新开发的小鼠精子冷冻保存I•Cryo试剂盒。使用该试剂盒对五种常用近交系小鼠的精子进行冷冻并随后复苏。与对照组（基础CPA）相比，使用该试剂盒冷冻的五种近交系小鼠精子，其活力保护率（> 60%）和快速前向运动活力保护率（> 45%）均更高。利用复苏后的精子进行体外受精（IVF），在所检测的全部五种小鼠品系中，受精后发育至二细胞期胚胎的效率均得到一致提升。在超过1.5年的时间内，共利用I•Cryo试剂盒冷冻保存了49个转基因小鼠品系，并通过体外受精成功复苏。

方案

1. 小鼠精子冷冻保存

  1. 对于每一条需要冷冻保存的样本，开始前需准备以下物品。
    1. 4孔板中的1个孔，加入240 µl试剂盒CPA
    2. 15 根精子冷冻保存细管，具体如下
      1. 将0.25 ml细管与1 ml注射器连接，棉塞端靠近注射器。每根细管中加入8 cm（约 160 μl加入 IVF 培养基，然后加入 1 cm 空气。用待保存品系的名称标记细管。
  2. LN2 应将泡沫箱中的样品置于15 cm深度处。盖上盖子。
  3. 对每种需冷冻保存品系的雄性小鼠各处死2只，小鼠年龄应在10至60周龄之间。从小鼠体内取出双侧尾部附睾及输精管。
  4. 将附睾放入预先准备好的含有CPA的4孔板孔中（步骤1.1）。
  5. 在每侧附睾上做5-7个纵向切口，并轻轻挤压每条输精管以挤出精子。
  6. 在室温下轻轻用手摇动CPA与附睾的混合物3-5分钟，以使精子游出。
  7. 使用先前准备好的吸管，吸取5 mm（约 10 μl精子悬液的体积，然后加入1 cm空气。
  8. 重复此过程，最多共处理15根麦管。为获得最佳精子存活率，应在10分钟内完成麦管的装载与封口。
  9. 仔细热封吸管的两端。将吸管放入冻存罐中，确保精子柱一端先进入。
  10. 将试剂盒中提供的1 ml移液器连接到罐体上以延长手柄。将罐体置于液氮中2 通过盖子上的孔将罐体放入泡沫箱中，使其在液氮中垂直漂浮2 10 分钟。
  11. 将罐体浸入液氮中。精子现已冷冻保存，可转移至长期液氮储存2 储存
  12. 只有当罐体升温至室温后，才能用于下一条线。

2. 小鼠超数排卵

  1. 通常使用与精子供体相同遗传背景的年轻雌性小鼠。
  2. 小鼠体重应约为 12 g（3–4 周龄）。
  3. 腹腔注射 5–10 IU 孕马血清促性腺激素（PMSG）。
  4. 等待 46–48 小时。
  5. 腹腔注射 5–10 IU 人绒毛膜促性腺激素（hCG）。
  6. 在 hCG 注射后 14–16 小时收集卵母细胞，具体方法如下所述。

3. 小鼠精子回收与体外受精

  1. 在进行体外受精（IVF）之前，针对每一根需要解冻的麦管，准备以下物品，并在37°C、含CO2的培养箱中平衡至少一小时。
    1. 精子孵育皿：一个35 mm的培养皿，内含90 μl精子处理液（STM），表面覆盖矿物油。
    2. 切割皿：用于最多10只超排卵雌鼠的卵母细胞收集，一个35 mm培养皿中加入3 ml体外受精液（IVF medium）。
    3. 体外受精孔：每5只超排卵雌鼠用于体外受精时，使用4孔板中的一个孔，加入500 μl体外受精液（例如，若使用10只超排卵雌鼠，则需要2个孔）。
    4. 洗涤皿：一个35 mm培养皿，内含3 ml钾离子简单优化培养基（KSOM），用于洗涤4孔体外受精板中的每个孔。
    5. 培养皿：一个35 mm培养皿，内含以矿物油覆盖的50 μl KSOM液滴，用于从每个体外受精孔中获得的胚胎进行培养。
  2. 从液氮（LN2）中取出一根麦管，放入37°C水浴中解冻2-3分钟。
  3. 将麦管从水浴中取出，擦干表面多余水分。在靠近棉塞端的第一个气柱附近进行第一次切割。将麦管切开并置于体外受精液中，此时在精子段之前仍可见一个气柱。
  4. 然后在第二个气柱处切断麦管末端，注意避免切到精子段。以45度角切割——这将使精子更易于吸取。
  5. 使用200 μl移液器从麦管远端吸取精子悬液。
  6. 将精子悬液置于STM液滴中央，并将培养皿放入37°C、5% CO2培养箱中孵育45-60分钟。
  7. 在精子孵育期间，将超排卵雌鼠的输卵管解剖至切割皿中。使用30号针头或镊子撕开每根输卵管，释放出卵丘-卵母细胞复合体（COCs）。避免将脂肪和血液带入体外受精液中，因为污染的培养基会增加额外的洗涤步骤。
  8. 待所有输卵管均被撕开后，将来自5只雌鼠的COCs转移至每个体外受精孔中。超排卵所产生的COCs数量因品系而异。
  9. 从STM液滴边缘吸取10-15 μl精子悬液，在人绒毛膜促性腺激素（hCG）注射后约14-16小时对一个体外受精孔进行受精。对所使用的每个孔重复此受精操作。最终精子浓度约为100万/ml。
  10. 将精子与卵母细胞共同培养4-6小时，置于37°C、5% CO2培养箱中。
  11. 用KSOM至少洗涤胚胎两次，然后将其转移至KSOM液滴中，在37°C、5% CO2培养箱中继续培养以促进发育。
  12. 体外受精率的计算方法为：过夜培养后，二细胞期胚胎数占所用总卵母细胞数的比例。

4. 代表性结果

对5种查尔斯河小鼠近交品系的精子进行了冷冻。保护率通过将冷冻精子的评估值除以新鲜精子的评估值得出。C57BL/6NCrl、129S2/SvPasCrl、FVB/NCrl、DBA/2NCrl 和 BALB/cAnNCrl 品系的精子运动性保护率分别为 60.2%、81.3%、78.6%、66.5%、61.0%。快速前向运动性的保护率在 C57BL/6NCrl、129S2/SvPasCrl、FVB/NCrl、DBA/2NCrl 和 BALB/cAnNCrl 品系中分别为 47.3%、69.4%、57.0%、52.8%、54.1%（图1）。

C57BL/6NCrl、129S2/SvPasCrl、FVB/NCrl、DBA/2NCrl 和 BALB/cAnNCrl 小鼠使用冻融精子的体外受精率分别为 55.7%、26.4%、87.3%、87.8% 和 26.2%（图 2）。

在1.5年期间，通过精子冷冻保存技术保存了49个转基因小鼠品系。这些品系随后通过体外受精（IVF）在4种雌性小鼠品系（C57BL/6、BALB/c、DBA/1和129Sv）中成功恢复（以产生活仔为定义标准）（图3）。

保护率图表；小鼠品系运动性研究；柱状图；遗传变异分析。
图 1. 小鼠精子运动性与快速前向运动性的保护率

Bar graph; two-cell embryo development (%) across mouse strains; genetic research results.
图2. 体外 小鼠冻融精子的体外受精

遗传品系胚胎发育图表；柱状图按供体品系比较体外受精卵母细胞结果。
图3。 体外 受精结合冻融精子在转基因小鼠中的应用

讨论

自1990年以来，使用18%棉子糖和3%脱脂奶粉的基本精子冷冻方案已在多种小鼠品系中被证实可靠，大量小鼠品系已通过该方法实现冷冻保存1,2,3,4,5,6,7。精子细胞在冷冻和解冻过程中受损的主要原因与冰晶形成8,9以及活性氧物质10有关。在冷冻保护液中添加自由基清除剂（如氨基酸）和还原剂（如单硫甘油），已被研究并证实可显著提高近交系小鼠（包括C57BL/6）冻融精子的体外受精率11,6。

在本方案中，我们通过优化基础冷冻保护剂（CPA），添加市售抗氧化剂和冰晶抑制剂，并改进精子冷冻及体外受精（IVF）操作流程，开发出一种新的小鼠精子冷冻保存I•Cryo试剂盒。使用I•Cryo试剂盒冷冻五种近交系小鼠精子后，精子活力保护率（>60%）和快速前向运动精子比例（>45%）均得到良好维持。与基础CPA相比，5种近交系小鼠冻融精子的2细胞期胚胎发育率显著提高11,6。

使用该试剂盒时，用户可通过将每个品系的2只雄性小鼠的精子冷冻，制备高浓度的精子悬液。仅需冷冻15根麦管，操作过程快速、简便，且占用更少的储存空间，适用于短期或长期保存。大多数情况下，仅需解冻1至2根麦管即可恢复小鼠品系。

披露

作者是该试剂盒制造商查尔斯河（Charles River）的员工。

致谢

本研究所述工作由查尔斯河实验室（Charles River）资助。作者对基因工程模型与服务团队以及胚胎学工作人员在动物护理和激素注射方面提供的帮助表示最诚挚的感谢。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
CPA查尔斯河实验室随试剂盒提供
STM查尔斯河实验室随试剂盒提供
IVF 培养液查尔斯河实验室随试剂盒提供
0.25 ml 塑料细管查尔斯河实验室随试剂盒提供
精子冷冻罐查尔斯河实验室随试剂盒提供
手杖与高脚杯查尔斯河实验室随试剂盒提供
矿物油Sigma-AldrichM5310应进行胚胎检测
KSOM培养基EMD MilliporeMR-106-D
35 mm 培养皿Falcon BD351008
热封机ABTECTISH-200
4孔多孔培养皿Nalge Nunc International73521-424
移液器Gilson, Inc.
移液器吸头各种
37°C + 5% CO2 培养箱各种
淋巴结2 储存系统各种
37°C 水浴VWR 国际89032-196
体视显微镜尼康仪器公司SMZ800
hCGIntervet Inc.
PMSGEMD Millipore367222
1 ml 注射器配 26G 3/8 针头BD 生物科学BD309625
显微解剖剪Roboz外科器械公司RS-5602
30号针头 ½ 针BD 生物科学305106
剪刀Roboz外科器械公司RS-6802
镊子Roboz外科器械公司RS-5135, RS-5110, RS-5005

参考文献

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