利用籽粒生物测定法量化真菌定殖、产孢及真菌毒素的产生

摘要

种子感染性真菌对谷类作物造成的破坏已促使大量研究致力于深入理解植物与病原体之间的相互作用。为了在实验室条件下研究种子与真菌的相互作用，我们开发了一种可靠的方法，通过籽粒生物测定来定量分析真菌繁殖、生物量及真菌毒素污染情况。

摘要

由种子感染性真菌引起的谷物腐烂对全球谷类作物生产构成了最大的经济挑战之一，更不必说其对人类和动物健康造成的严重风险。在各类谷物生产中，玉米 arguably 是受影响最严重的作物，其籽粒完整性的病原体诱导损失以及种子的霉菌毒素污染尤为突出。对于玉米种植者以及食品和饲料加工业而言，最普遍且最具问题的两种霉菌毒素是黄曲霉毒素和伏马毒素，分别由Aspergillus flavus和Fusarium verticillioides产生。

近期关于植物-病原体分子互作的研究在揭示植物对真菌侵染及真菌毒素污染响应的特定机制方面展现出巨大潜力^1,2,3,4,5,6。由于许多实验室正利用籽粒实验研究植物-病原体互作，因此亟需一种标准化的方法来量化不同的生物学参数，以便不同实验室的结果能够相互比较和解读。为了实现对种子进行稳健且可重复的定量分析，我们开发了实验室内的籽粒实验方法，以及后续用于量化真菌生长、生物量和真菌毒素污染程度的技术流程。实验中，将四粒灭菌的玉米籽粒接种于玻璃小瓶内，加入真菌悬浮液（10⁶）并在预设条件下培养一定时间。随后选取样品小瓶，分别通过血细胞计数板对分生孢子进行计数，利用高效液相色谱法（HPLC）基于麦角固醇含量分析生物量，采用AflaTest荧光光度法测定黄曲霉毒素含量，并通过高效液相色谱法（HPLC）定量伏马菌素含量。

方案

1. 玉米籽粒生物测定

1. 在实验前两周，将真菌病原体接种于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上，在 28 °C 条件下培养。
2. 选择大小和形状相似的籽粒，最好为扁平状，以便其能平稳地平放在生物测定小瓶底部，并将其放入 50 ml 离心管中。所选籽粒应为在同一环境下同期生产的，以确保种子年龄和代谢物组成相近。
3. 在室温下振荡处理，对籽粒进行表面灭菌：先用 70% 乙醇处理 5 分钟，再用无菌水洗涤 1 分钟，接着用 6% 次氯酸钠处理 10 分钟。随后继续振荡，用无菌水冲洗三次，每次 5 分钟。将籽粒在经高压灭菌的毛巾上轻轻吸干。
4. 为促进黄曲霉（Aspergillus flavus）的侵染，使用 18 号针头在籽粒胚部一侧制造深度约为 0.5 cm 的微小伤口。然而，根据我们的经验，轮枝镰刀菌（Fusarium verticillioides）侵染需要更大的伤口，因此应使用剃须刀片在胚部一侧切出深度为 0.5 mm 的切口。
5. 通过在约 5 ml 经高压灭菌的 0.01% Tween-20 溶液中刮取培养平板上的菌落以释放孢子，并使用至少四层经高压灭菌的纱布进行重力过滤以去除菌丝体，从而制备接种孢子悬液。使用血细胞计数板测定孢子浓度，并将其调整至每毫升含 10⁶ 个孢子，适用于黄曲霉（A. flavus）或轮枝镰刀菌（F. verticillioides

讨论

本文所述方法已得到广泛验证，能够稳定地获得可量化的真菌定植、产孢及真菌毒素生成结果。此外，这些方法也适用于其他易受产毒真菌污染的植物种子（如花生、小麦、棉花、开心果等）。为确保植物与病原菌互作分析的有效性，必须保持种子的活性。在籽粒胚部一侧制造微小伤口，有助于接种感染，同时维持种子的存活能力。

有效进行的籽粒检测已被证明可与田间试验结果相一致。在之前的一项研究中⁴，籽粒生物测定显示，lox3-4突变体品系比野生型植株更易受到黄曲霉毒素污染。该结果与四项独立田间试验所观察到的结果完全一致⁴。这表明，籽粒生物测定可能是用于确定和/或预测大规模条件下植物-病原物互作结果的有效工具。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
马铃薯葡萄糖琼脂	Fisher Scientific	S71659A
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-100
塑料培养容器	Sterilite	1713LAB06
搅拌器	Vicam	20200
24 cm 折叠滤纸	Vicam	31240
1.5 μm 玻璃微纤维	Vicam	31955
Afla Test 柱	Vicam	G1024
Afrla 测试开发人员	Vicam	32010
甲醇	Vicam	35016
乙腈	Fisher Scientific	AC14952-0025
乙醇	Fisher Scientific	AC39769-0025
C-18 固相萃取柱（Prep SEP SPE C18 柱）	Fisher Scientific	60108-304
邻苯二甲醛（OPA）	Sigma-Aldrich	79760-5g
硼酸	Fisher Scientific	BP168-500
硼砂	Fisher Scientific	RDCS0330500
巯基–乙醇	Fisher Scientific	45-000-231
岛津高效液相色谱 LC-20AT（泵）	岛津公司	LC-20AT
Zorbax ODS 色谱柱（4.6×150 mm）	安捷伦科技	443905-902
Shimatzu RF-10Axl 荧光检测器	岛津公司	RF-10AXL
磷酸钠	Fisher Scientific	AC38987-0010
FB1 标准品	Sigma-Aldrich	F1147-1mg
氯仿	VWR 国际公司	MK444410
13 毫米针筒式滤器，配有 0.45 微米尼龙膜（HPLC）	Pall Corporation	4426
麦角固醇	Sigma-Aldrich	45480-50G-F
闪烁瓶	VWR 国际公司	66021-602
氯化钠	Vicam	G1124