利用籽粒生物测定法量化真菌定殖、产孢及真菌毒素的产生

摘要

种子感染性真菌对谷类作物造成的破坏已促使大量研究致力于深入理解植物与病原体之间的相互作用。为了在实验室条件下研究种子与真菌的相互作用，我们开发了一种可靠的方法，通过籽粒生物测定来定量分析真菌繁殖、生物量及真菌毒素污染情况。

摘要

由种子感染性真菌引起的谷物腐烂对全球谷类作物生产构成了最大的经济挑战之一，更不必说其对人类和动物健康造成的严重风险。在各类谷物生产中，玉米 arguably 是受影响最严重的作物，其籽粒完整性的病原体诱导损失以及种子的霉菌毒素污染尤为突出。对于玉米种植者以及食品和饲料加工业而言，最普遍且最具问题的两种霉菌毒素是黄曲霉毒素和伏马毒素，分别由Aspergillus flavus和Fusarium verticillioides产生。

近期关于植物-病原体分子互作的研究在揭示植物对真菌侵染及真菌毒素污染响应的特定机制方面展现出巨大潜力^1,2,3,4,5,6。由于许多实验室正利用籽粒实验研究植物-病原体互作，因此亟需一种标准化的方法来量化不同的生物学参数，以便不同实验室的结果能够相互比较和解读。为了实现对种子进行稳健且可重复的定量分析，我们开发了实验室内的籽粒实验方法，以及后续用于量化真菌生长、生物量和真菌毒素污染程度的技术流程。实验中，将四粒灭菌的玉米籽粒接种于玻璃小瓶内，加入真菌悬浮液（10⁶）并在预设条件下培养一定时间。随后选取样品小瓶，分别通过血细胞计数板对分生孢子进行计数，利用高效液相色谱法（HPLC）基于麦角固醇含量分析生物量，采用AflaTest荧光光度法测定黄曲霉毒素含量，并通过高效液相色谱法（HPLC）定量伏马菌素含量。

方案

1. 玉米籽粒生物测定

1. 在实验前两周，将真菌病原体接种于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上，在 28 °C 条件下培养。
2. 选择大小和形状相似的籽粒，最好为扁平状，以便其能平稳地平放在生物测定小瓶底部，并将其放入 50 ml 离心管中。所选籽粒应为在同一环境下同期生产的，以确保种子年龄和代谢物组成相近。
3. 在室温下振荡处理，对籽粒进行表面灭菌：先用 70% 乙醇处理 5 分钟，再用无菌水洗涤 1 分钟，接着用 6% 次氯酸钠处理 10 分钟。随后继续振荡，用无菌水冲洗三次，每次 5 分钟。将籽粒在经高压灭菌的毛巾上轻轻吸干。
4. 为促进黄曲霉（Aspergillus flavus）的侵染，使用 18 号针头在籽粒胚部一侧制造深度约为 0.5 cm 的微小伤口。然而，根据我们的经验，轮枝镰刀菌（Fusarium verticillioides）侵染需要更大的伤口，因此应使用剃须刀片在胚部一侧切出深度为 0.5 mm 的切口。
5. 通过在约 5 ml 经高压灭菌的 0.01% Tween-20 溶液中刮取培养平板上的菌落以释放孢子，并使用至少四层经高压灭菌的纱布进行重力过滤以去除菌丝体，从而制备接种孢子悬液。使用血细胞计数板测定孢子浓度，并将其调整至每毫升含 10⁶ 个孢子，适用于黄曲霉（A. flavus）或轮枝镰刀菌（F. verticillioides）。若使用其他病原菌或寄主物种，需评估适宜的接种浓度以实现有效侵染。
6. 在塑料容器（29.2 cm × 18.7 cm × 8.3 cm）内铺设五层纸巾并加入 100 ml 无菌水，以构建一个湿度培养箱。该培养箱无需密封防漏或密闭，实验过程中需定期补充水分以保持纸巾湿润。
7. 将四粒籽粒放入经高压灭菌的 20 ml 玻璃闪烁瓶中，并记录其质量。加入 200 μl 孢子悬液进行接种，盖紧瓶盖后涡旋振荡，使孢子悬液均匀覆盖籽粒表面。随后略微松开瓶盖以保证空气自由交换，并将小瓶置于湿度培养箱中。

注意：对于本方法中未描述的种子或真菌，所需的接种量可能不同，应通过实验确定。

8. 将种子在28 °C、12小时光照/12小时黑暗的光周期条件下培养7天，或培养至达到所需状态为止。

2. 分生孢子计数

1. 感染期结束后，向含有感染籽粒的闪烁瓶中加入 5 ml 经高压灭菌的 0.01% Tween-20，充分涡旋振荡 1 分钟。
2. 使用宽口移液器吸头，立即用移液器分别将两份 200 μl 的孢子悬液转移至含有 1.8 ml 0.01% Tween-20 的 2.0 ml Eppendorf 管中，进行稀释（可根据感染程度按需调整稀释倍数）。
3. 使用血细胞计数板对每份 200 μl 的孢子悬液重复计数两次⁴，并比较不同处理间的分生孢子数量水平。

3. 黄曲霉毒素定量

1. 将1个样品的籽粒加入50 ml搅拌杯中，加入20 ml 80%甲醇和0.05 g NaCl，盖上盖子，高速搅拌1分钟。
2. 将一张褶皱滤纸置于干净的收集容器上，将提取液倒入滤纸中进行过滤。
3. 转移10 ml滤液至干净容器中，加入20 ml蒸馏H₂O，并充分混匀。
4. 将样品通过1.5 μm玻璃微纤维滤膜过滤至干净的杯子中。
5. 取1 ml过滤后的提取液加入Afla Test柱中，使用压缩空气以每秒1-2滴的速度将提取液强制通过层析柱，直至完全排空。
6. 用1 ml蒸馏H₂O洗涤层析柱两次，每次以每秒1-2滴的速度使液体通过柱体，直至空气通过。
7. 用1 ml HPLC级纯甲醇以每秒1-2滴的速度洗脱层析柱，洗脱液收集至玻璃比色皿中。
8. 向洗脱液中加入1 ml Afla Test显色剂，充分混匀。将比色皿放入已校准的荧光计中，于60秒时读数。

注意：使用 Aflatest FGIS 方案时，荧光计的测量值是基于最初用 100 ml 溶剂提取 50 克样品计算得出的。如果考虑用水稀释样品的情况，则上柱的 1 ml 溶液相当于 0.166 克样品。因此，在修改方案时，必须考虑样品量和初始提取液的差异。例如，将 2 克籽粒用 20 ml 80% 甲醇提取，相当于 0.1 克/毫升。当取 1 ml 该样品与 2 ml 水混合后，液体中样品的比例变为 0.033 克/毫升。如果该样品的荧光计读数为 100 ppb，则实际浓度应基于样品比例与 0.166 克之间的关系进行换算，即 ppb = (0.166 克 × 100 ppb) / 0.1 克，结果为 166 ppb。有关其他黄曲霉毒素定量方法，请参见参考文献 7。

4. 烟曲霉毒素B1（FB1）分析

1. 当真菌在玉米粒上培养时，在室温下用10 ml乙腈/水（50/50，v/v）不搅拌地过夜提取样品。随后，将提取液（2 ml）与去离子水（6 ml）混合，并直接将此混合液（8 ml）上样至C-18固相萃取柱。
2. 上样前，先用2 ml乙腈冲洗C-18固相萃取柱，再用2 ml水冲洗，以进行预处理。
3. 上样后，依次用2 ml水和2 ml乙腈/水（15/85，v/v）洗涤柱子。使用2 ml乙腈/水（70/30，v/v）洗脱用于HPLC分析的样品（含FB1）。
4. 将0.1 ml柱洗脱液转移至含有0.1 ml硼酸盐缓冲液（0.05 M硼酸/0.05 M硼砂[50/50，v/v]，pH 8.5）和0.1 ml邻苯二甲醛（OPA）（0.1 mg/ml溶于含0.5%巯基乙醇的乙腈中）的样品瓶中，对FB1进行OPA衍生化。
5. 加入0.5 ml乙腈/0.01 M硼酸（40/60，v/v）终止反应，反应时间为10分钟。
6. 使用配备分析型Zorbax ODS柱（4.6 × 150 mm）和可变波长Shimadzu RF-10Axl荧光检测器（激发波长335 nm，发射波长440 nm）的Shimadzu HPLC LC-20AT系统分析FB1。
7. 采用线性梯度洗脱（流动相A：乙腈/0.1 M磷酸钠（40/60），pH 3.3；流动相B：乙腈/0.1 M磷酸钠（60/40），pH 3.3），梯度程序如下：10分钟内从100% A线性升至100% B，保持100% B 5分钟。
8. 通过HPLC分析FB1标准品，利用峰面积绘制标准曲线。随后，通过将样品的峰面积与FB1标准曲线比较，定量样品中FB1的含量。

5. 麦角固醇分析

1. 将真菌在玉米粒上培养 7-14 天。
2. 培养结束后，向每个小瓶中加入 10 ml 氯仿:甲醇（2:1, v/v）。加入后充分振荡样品，然后将小瓶置于室温避光条件下孵育 24 小时。
3. 24 小时后，离心样品，收集上清液并通过 0.45 µm 尼龙膜过滤。
4. 将样品直接注入配备 4.6 U ODS-C18 柱（200 Å, 250 ± 4.6 mm）和 Shimadzu SPD-20A UV/VIS 检测器（设定检测波长为 282 nm）的 Shimadzu HPLC LC-20AT 系统中。
5. 以甲醇（100%）作为流动相，流速为 1.5 mL/min。通过将样品的峰面积与由 HPLC 级麦角固醇生成的标准曲线进行比较，确定样品中麦角固醇的含量。

6. 典型结果

接种后，在湿度培养箱中培养两到三天，真菌菌丝应开始在籽粒上出现。处理后七天，处理组植株上的营养生长应清晰可见，而对照组植株应无感染迹象（图1B，顶部）。更长时间的培养有利于更旺盛的营养生长（图1B，底部）。在本文所述条件下（图2G），A. flavus 野生型菌株NRRL 3357的定殖、黄曲霉毒素积累和分生孢子产生的最大值分别出现在第8、第6和第8天（图2，A-C）。然而，当以单位麦角固醇为基准比较真菌毒素污染水平和分生孢子形成时，其最高水平分别出现在第4天和第6天（图2，D-E）。图2F总结了这些依赖于真菌生物量的最大值观察结果。有趣的是，在接种后4至6天期间，籽粒发生核酸降解，这可通过时间进程样品中的总RNA变化观察到（图2H，底部）。

包括我们自身研究在内的多项研究已探讨了F. verticilliodies对玉米籽粒的侵染^{2,8,9,10,11,12}，并成功将7至13天作为观察的时间点。采用本文所述方法，伏马菌素含量范围为3,500–8,000 ng/g籽粒^4,13，麦角固醇含量范围为5,000–10,000 ng/g籽粒^14,13。图3展示了高效液相色谱图中伏马菌素（上图）和麦角固醇（下图）的代表性峰。麦角固醇的测定也可通过吸光度光谱法进行¹⁵。

图 1. 子囊菌生物量、产孢及真菌毒素产量的定量流程图，以及籽粒生物测定中营养生长的代表性结果。A) 描述用于定量评估玉米籽粒上真菌致病性的基本生物学参数的方法流程图。B) 籽粒生物测定的代表性结果。上方：在B73遗传背景下，A. flavus (NRRL3357) 在玉米籽粒上的营养生长情况。种子接种200 μl浓度为10⁶ 孢子/mL的孢子悬液，接种后7天拍摄照片。下方：B73遗传背景的玉米籽粒接种F. verticillioides后13天的感染情况。接种方式为每粒籽粒接种200 μl浓度为10⁶ 孢子/mL的孢子悬液。

图 2. 黄曲霉菌籽粒生物测定的时间进程。B73 玉米籽粒接种 200 μl 浓度为 10⁶ 个孢子/ml 的 Aspergillus flavus 分生孢子悬浮液，于 2–8 天内培养（G）。所有数值均基于 4 粒籽粒的干重平均值（n = 3–4；均值 ± 标准误）。A）定殖程度（以麦角固醇为指标）、（B）黄曲霉毒素含量和（C）产孢量通过上述方法进行定量。E）黄曲霉毒素和（F）产孢量以麦角固醇测定的真菌生物量为函数进行展示。F）麦角固醇、黄曲霉毒素积累量和产孢量的最大值相对于真菌生物量的变化——每种物质观测到的最大值设为 100%。（H）时间进程样品中每泳道 1 μg 总 RNA。

图3. 从感染了Fusarium verticillioides（M3125）的籽粒中分离得到的伏马菌素B1（上图）和麦角甾醇（下图）的代表性高效液相色谱（HPLC）色谱图。

讨论

本文所述方法已得到广泛验证，能够稳定地获得可量化的真菌定植、产孢及真菌毒素生成结果。此外，这些方法也适用于其他易受产毒真菌污染的植物种子（如花生、小麦、棉花、开心果等）。为确保植物与病原菌互作分析的有效性，必须保持种子的活性。在籽粒胚部一侧制造微小伤口，有助于接种感染，同时维持种子的存活能力。

有效进行的籽粒检测已被证明可与田间试验结果相一致。在之前的一项研究中⁴，籽粒生物测定显示，lox3-4突变体品系比野生型植株更易受到黄曲霉毒素污染。该结果与四项独立田间试验所观察到的结果完全一致⁴。这表明，籽粒生物测定可能是用于确定和/或预测大规模条件下植物-病原物互作结果的有效工具。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
马铃薯葡萄糖琼脂	Fisher Scientific	S71659A
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-100
塑料培养容器	Sterilite	1713LAB06
搅拌器	Vicam	20200
24 cm 折叠滤纸	Vicam	31240
1.5 μm 玻璃微纤维	Vicam	31955
Afla Test 柱	Vicam	G1024
Afrla 测试开发人员	Vicam	32010
甲醇	Vicam	35016
乙腈	Fisher Scientific	AC14952-0025
乙醇	Fisher Scientific	AC39769-0025
C-18 固相萃取柱（Prep SEP SPE C18 柱）	Fisher Scientific	60108-304
邻苯二甲醛（OPA）	Sigma-Aldrich	79760-5g
硼酸	Fisher Scientific	BP168-500
硼砂	Fisher Scientific	RDCS0330500
巯基–乙醇	Fisher Scientific	45-000-231
岛津高效液相色谱 LC-20AT（泵）	岛津公司	LC-20AT
Zorbax ODS 色谱柱（4.6×150 mm）	安捷伦科技	443905-902
Shimatzu RF-10Axl 荧光检测器	岛津公司	RF-10AXL
磷酸钠	Fisher Scientific	AC38987-0010
FB1 标准品	Sigma-Aldrich	F1147-1mg
氯仿	VWR 国际公司	MK444410
13 毫米针筒式滤器，配有 0.45 微米尼龙膜（HPLC）	Pall Corporation	4426
麦角固醇	Sigma-Aldrich	45480-50G-F
闪烁瓶	VWR 国际公司	66021-602
氯化钠	Vicam	G1124