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方法文章

从小鼠气管中分离基底细胞和黏膜下腺导管细胞

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DOI：

10.3791/3731

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2012年9月14日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, David Geffen School of Medicine at UCLA

本文内容

摘要

本文展示了从小鼠气管中分离基底细胞和黏膜下腺导管细胞的实验方案。同时，我们还演示了将干细胞注射至小鼠背部脂肪垫以构建异位组织模型的方法。 体内 黏膜下腺体再生模型

摘要

大气道直接与环境接触，因此容易受到吸入毒素和病原体的损伤 1因此，大气道需要一种高效的修复机制来保护我们的身体。这种修复过程来源于气道中的干细胞，分离这些气道干细胞对于理解修复与再生机制至关重要。同时，也有助于理解可能导致气道疾病的异常修复过程。 2该方法的目的是从小鼠气管黏膜下腺导管中分离出一种新型干细胞群体，并将这些细胞置于 体外 和 体内 用于研究黏膜下腺体修复与再生机制的模型系统 3本视频展示了从大气道中分离和检测导管细胞及基底干细胞的方法。 3这将使我们能够研究气道疾病，例如囊性纤维化、哮喘和慢性阻塞性肺疾病。目前尚无分离黏膜下腺导管细胞的方法，也尚无 体内 用于研究黏膜下腺体再生的模型。

方案

步骤概述

1. 气管解剖

2. 清洗气管并将其切割

3. 酶消化及单细胞悬液制备

4. FACS 染色与分选

5. 分选细胞的后续处理 体内 和 体外 模型

1. 气管解剖

  1. 通过腹腔注射 0.1 mg/0.2 cc 戊巴比妥对小鼠实施安乐死。
  2. 切开腹壁，将肠管移向一侧以暴露腹主动脉，随后进行解剖。
  3. 从两侧切开膈肌和前胸壁以打开胸腔，暴露心脏和肺。继续向上切至颈部，去除脂肪组织和唾液腺，暴露气管。
  4. 移除胸腺，切断肺下方和后方的连接。用镊子插入气管与食管之间，将其分离，然后在气管与喉连接处上方的最顶端切断气管。用镊子夹住气管，从其附着处向下解剖，将气管、心脏和肺整块取出。在肺门附近切除心脏和肺，以包含大部分左、右主支气管。
  5. 将气管置于含有冰上收集液的小型培养皿中。

2. 清洗气管并进行切割

  1. 在解剖显微镜下，使用精细尖头镊子（No. 5）和Vannas Tubingen剪刀（FST 15003-08 finescience.com）将气管上附着的所有其他组织清除干净。这些组织包括：淋巴结、喉返神经、脂肪、甲状腺以及残留的肺血管。气管的上部需要特别注意，应小心去除较大的喉软骨，同时避免损伤位于环状软骨与第一气管软骨环（C1）之间、紧邻的最大团块状唾液腺组织（SMG）4。
  2. 在C4与C5之间将气管分为上部和下部，然后沿气管腔将这两部分分别剪开。

3. 酶消化及单细胞悬液（SCS）制备

  1. 将气管下部放入含有1 ml 16 U分散酶的离心管中，在室温（RT）下孵育30分钟，操作如前所述5。然后加入含0.5 mg/ml DNase I的DMEM，在室温下继续孵育20分钟。
  2. 将消化后的气管转移至无菌培养皿中的新鲜收集培养基中，在解剖显微镜下剥离表面上皮。使用移液器将含有剥离上皮的培养基转移至50 ml锥形管中。
  3. 在4 °C下以1,000 × g离心收集剥离的上皮细胞，弃去上清液，加入0.1%胰蛋白酶/EDTA，在37 °C振荡培养箱（200 rpm）中振荡孵育30分钟。孵育结束后，使用1,000 μl枪头反复吹打，以打散细胞团块，形成单细胞悬液。
  4. 将气管上部放入含有1 ml 0.15%蛋白酶的锥形管中，于4 °C孵育4小时。
  5. 轻轻涡旋振荡管子，然后将气管转移至新鲜收集培养基中，并在解剖显微镜下确认表面上皮（SE）已完全脱落。
  6. 使用精细剪刀剪碎气管，以打开黏膜下腺（SMG）结构，随后在室温下以缓慢振荡方式在蛋白酶中再孵育1小时。
  7. 离心收集气管组织，弃去蛋白酶，加入0.1%胰蛋白酶/EDTA，按上述方法在37 °C振荡孵育30分钟。
  8. 使用10 ml注射器依次通过20G、23G和26G针头反复吹打消化后的细胞、细胞团块及残留的腺体组织。每种规格的针头需重复吹打数次后再更换更细的针头。此时，大多数细胞应已形成单细胞悬液（SCS）。
  9. 将细胞悬液通过40 μm细胞筛过滤，冲洗细胞筛并离心收集细胞。随后用适当体积的培养基重悬细胞，计数后立即进行FACS染色与分选。切勿将细胞在4 °C或冰上放置数小时，因我们发现这会影响细胞活力，并显著降低类球体形成效率。

4. FACS 染色与分选

  1. 取足够细胞用于制备未染色和单染补偿管，其余细胞用一抗（山羊来源的Trop2和大鼠来源的ITGA6）在室温下避光孵育15分钟。随后用PBS或收集培养基洗涤，小心移除上清液，并重悬细胞沉淀。
  2. 加入相应的二抗进行染色，在室温下避光孵育10分钟，洗涤并去除上清液，然后重悬细胞沉淀。
  3. 在FACS ARIA仪器上调整电压和补偿后，设门排除碎片、极小细胞、细胞双联体以及死细胞。此时，来自SE的大多数细胞应为TROP2阳性，而SMG细胞中约有20–50%为TROP2+ 6。
  4. 针对SE来源的Trop2+ITGA6+细胞（基底细胞）以及SMG来源的Trop2+细胞（ITGA6阳性或阴性，即±ITGA6）设置分选门。

5. 分选细胞的处理步骤： 体外 培养与 体内 模型

5.1 体外 成球形成 5-9 培养

  1. 将100 μl“生长因子减少型Matrigel”与含有最多50,000个分选细胞的100 μl完全培养基10,11（见表1）混合，然后将该混合物加入24孔Trans-well的上室中。在下室中加入400 μl完全培养基，于37 °C培养。每隔一天更换下室中的培养基，每周或在Matrigel变薄时更早补充100 μl Matrigel。

5.2 体内 模型

  1. 将分选后的细胞沉淀重悬于完全培养基与Matrigel按1:1混合的溶液中，细胞浓度为每50 μl含5,000–10,000个细胞。
  2. 对受体C57/BL6小鼠进行麻醉，并皮下注射卡洛芬（Carprofen，5 mg/kg）作为镇痛剂。对其背部进行剃毛和消毒，然后在上背部做一条中央纵向皮肤切口。切口应足够大，以便识别脂肪垫注射部位以及注射后形成的隆起。使用剪刀的钝端在皮肤与胸壁之间向两侧钝性分离，形成皮下袋，以最大限度地暴露操作视野。
  3. 通过将小鼠前肢向上并向后推，观察肩胛骨移动，从而确定其内侧边界。用300 μl BD胰岛素注射器吸取50 μl细胞悬液，将其注射至肩胛骨内侧、脊柱外侧的脂肪垫中。注射后应可见局部隆起（bleb），若不可见则说明进针过深。在另一侧重复相同操作，随后用钉合或缝合方式闭合皮肤切口。术后每24小时检查小鼠，并皮下注射卡洛芬（5 mg/kg）连续48小时。
  4. 3周后，通过腹腔注射戊巴比妥钠（pentobarbatol，0.1 mg/0.2 cc）处死小鼠，按上述方法切开皮肤，从两侧完整剥离脂肪垫组织，保留足够的安全边缘，以避免遗漏可能已形成并向外延伸的组织结构。用PFA固定后进行石蜡包埋12。在修块和切片过程中需格外小心，防止跳过或遗漏任何结构。最佳操作方法是：先修去40 μm，然后切下一张4 μm切片，置于载玻片上，显微镜下检查该部分是否存在“上皮样结构”。若未见任何结构，则再次修去40 μm，重复上述步骤。

6. 代表性结果

小鼠气管去上皮化后将导致气管裸露，光镜下可见，如图1A所示。图1B显示了上皮剥离后气管的明场图像，其中黏膜下腺体从组织中释放出来，形似一串串葡萄。

Pronase 会去除 ITGA6 表位，因此无法将 TROP2 阳性的导管细胞分离为 ITGA6+ 和 ITGA6- 两个群体。然而，dispase 虽能保留 ITGA6 表位，但即使孵育时间很短，也会消化全部的表面上皮和导管细胞，因此不能用于分离导管细胞与基底细胞3。单细胞悬液的流式细胞术结果应显示前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）图，如图2A所示。在流式细胞术中使用 Trop2 抗体进行荧光激活细胞分选（FACS）时，应能清晰区分导管细胞与气管其他细胞，如图2B所示。培养约1周后，Matrigel 中应可见呈致密形态的细胞球，如图3所示。该过程的效率约为1-2%，Matrigel 中仍会存在单个细胞，这些细胞可能来源于不具备自我更新能力的黏膜下腺导管。将导管干细胞注射至小鼠脂肪垫后，可形成类似黏膜下腺的结构，如图4所示。这些结构即使未经 H&E 染色，在组织块中亦可见到，呈球形，具有中央腔。为避免遗漏这些上皮结构，需对脂肪垫进行多个横切面的连续切片观察。

组织学，酶处理比较；Dispase 30分钟 vs. Pronase 4小时；组织消化。
图1. 气管上皮的酶消化。黑色箭头显示表面的上皮细胞被去除，绿色箭头显示黏膜下腺导管中的细胞被去除。经Dispase消化30分钟和Pronase消化4小时后，通过光学显微镜可见去除了上皮细胞的气管。

显示SSC与FSC及TROP2分布数据分析的流式细胞术图谱；结果图表。
图 2A. i. 单细胞悬液的流式细胞术分析，显示小鼠气管经上皮表面剥离后具有代表性的前向散射（FSC）与侧向散射（SSC）图谱。ii. 小鼠气管导管细胞中TROP2表达的代表性流式细胞分选（FACS）图谱。

流式细胞术分析示意图；SSC 与 FSC、TROP2、ITGA6 的散点图；细胞分选结果。
图 2B. i. 来自小鼠气管下三分之二段剥离的表面上皮的单细胞悬液的流式细胞术分析，显示典型的前向散射（FSC）与侧向散射（SSC）散点图。ii. 表面上皮中 ITGA6 表达的典型 FACS 图。iii. 表面上皮前向散射与侧向散射的另一代表性 FACS 图，显示以绿色标示的基底细胞群的反向设门结果。iv. 表达 ITGA6 和 TROP2 的细胞群（以绿色标示）的典型图谱。

小鼠导管和基底细胞球随时间生长的过程图，显微镜图像。
图3. 细胞球发育的时间过程。A. 导管细胞球。培养约1周后，Matrigel中应可见细胞球，且几乎所有细胞球均呈致密外观。也可观察到未形成细胞球的单个细胞。（比例尺 = 50 μm）。B. 基底细胞球体积较大，呈腔样外观。也可观察到未形成细胞球的单个细胞。（比例尺 = 50 μm）。

显示100 µm尺度下组织样本的组织学显微图像；细胞形态学分析。
图 4. 将导管干细胞注射到小鼠脂肪垫中可形成类似黏膜下腺体的结构。图中显示了脂肪垫中的代表性结构，其中一些结构经阿利新蓝-过碘酸雪夫染色后显示出产生黏蛋白（浅蓝色）的现象。

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讨论

从气道中分离导管细胞和基底细胞的技术对于增进我们对气道修复与再生以及气道疾病的理解具有重要意义。此处描述的技术包括几个关键步骤：首先是优化的酶消化时间；其次是通过依次使用孔径逐渐减小的针头进行连续传代，以形成单细胞悬液，从而防止细胞剪切损伤并有效解离细胞团块；第三是使用适当的抗体进行流式细胞术（FACS）分析及细胞分选门控。

由于某些酶会去除表面表位（如 ITGA6 和 NGFR），一种可能的改进方法是调整酶消化方案，以保护这些表位。通过更换针对特定细胞类型表面标志物的特异性抗体，该方案也可用于分离气管内皮细胞或其他间充质细胞。

分离导管细胞和基底细胞的局限性与目前缺乏能够区分导管细胞与基底细胞的表面标志物有关，同时也需要进行上皮表面剥离，且有可能残留部分基底细胞。未来若能鉴定出导管细胞特异性的表面标志物，将使该过程更为简便，并消除对上皮表面剥离步骤的需求，同时也可避免必须使用气管下三分之二段来获得纯基底细胞的需要。

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致谢

我们感谢Broad干细胞研究中心FACS实验室，特别感谢Jessica Scholes和Felicia Codrea在细胞分选方面的帮助。本研究由CIRM RN2-00904-1、K08 HL074229、美国胸科学会/COPD基金会ATS-06-065、Concern基金会、加州大学洛杉矶分校Jonsson综合癌症中心胸部肿瘤学项目/肺癌SPORE、加州大学癌症研究协调委员会以及Gwynne Hazen Cherry纪念实验室（BG）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
完全培养基 10:
DMEM-F-12，50/50，1X 		Mediatech15-090-CV
Hepes (15 mM)Invitrogen15630
碳酸氢钠（3.6 mM 或 0.03%）Invitrogen25080
L-谷氨酰胺（4 mM）美迪特25-005-Cl
青霉素（100 U/ml）Mediatech30-001-CI
链霉素（100 μ克/米美迪特30-001-CI
胰岛素（10 μg/mlSigmaI6634
转铁蛋白（5 μg/mlSigmaT1147
霍乱毒素（0.1 μg/mlSigmaC8052
表皮生长因子（25 ng/ml）BD354001
牛垂体提取物（30 μg/mlInvitrogen13028-014
胎牛血清（5%）FisherSH3008803HI
视黄酸（0.05 μM)SigmaR2625
生长因子减少型 MatrigelBD354230

表1. 完全培养基组分

Pronase罗氏10165921001使用浓度为0.15%：
4°C 下离心 °C 消化法用于分离总气管细胞（用于气液界面培养）
-4 小时消化 4 °C 分离 SMG
DispaseBD Biosciences354235使用16单位：室温下30分钟
DNase ISigmaDN25使用浓度为 0.5 mg/ml：
室温下20-30分钟

表2. 用于气管酶解消化的酶。

参考文献

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