从小鼠气管中分离基底细胞和黏膜下腺导管细胞

摘要

本文展示了从小鼠气管中分离基底细胞和黏膜下腺导管细胞的实验方案。同时，我们还演示了将干细胞注射至小鼠背部脂肪垫以构建异位组织模型的方法。 体内 黏膜下腺体再生模型

摘要

大气道直接与环境接触，因此容易受到吸入毒素和病原体的损伤 ¹因此，大气道需要一种高效的修复机制来保护我们的身体。这种修复过程来源于气道中的干细胞，分离这些气道干细胞对于理解修复与再生机制至关重要。同时，也有助于理解可能导致气道疾病的异常修复过程。 ²该方法的目的是从小鼠气管黏膜下腺导管中分离出一种新型干细胞群体，并将这些细胞置于 体外 和 体内 用于研究黏膜下腺体修复与再生机制的模型系统 ³本视频展示了从大气道中分离和检测导管细胞及基底干细胞的方法。 ³这将使我们能够研究气道疾病，例如囊性纤维化、哮喘和慢性阻塞性肺疾病。目前尚无分离黏膜下腺导管细胞的方法，也尚无 体内 用于研究黏膜下腺体再生的模型。

方案

步骤概述

1. 气管解剖

2. 清洗气管并将其切割

3. 酶消化及单细胞悬液制备

4. FACS 染色与分选

5. 分选细胞的后续处理 体内 和 体外 模型

1. 气管解剖

1. 通过腹腔注射 0.1 mg/0.2 cc 戊巴比妥对小鼠实施安乐死。
2. 切开腹壁，将肠管移向一侧以暴露腹主动脉，随后进行解剖。
3. 从两侧切开膈肌和前胸壁以打开胸腔，暴露心脏和肺。继续向上切至颈部，去除脂肪组织和唾液腺，暴露气管。
4. 移除胸腺，切断肺下方和后方的连接。用镊子插入气管与食管之间，将其分离，然后在气管与喉连接处上方的最顶端切断气管。用镊子夹住气管，从其附着处向下解剖，将气管、心脏和肺整块取出。在肺门附近切除心脏和肺，以包含大部分左、右主支气管。
5. 将气管置于含有冰上收集液的小型培养皿中。

2. 清洗气管并进行切割

1. 在解剖显微镜下，使用精细尖头镊子（No. 5）和Vannas Tubingen剪刀（FST ....

讨论

从气道中分离导管细胞和基底细胞的技术对于增进我们对气道修复与再生以及气道疾病的理解具有重要意义。此处描述的技术包括几个关键步骤：首先是优化的酶消化时间；其次是通过依次使用孔径逐渐减小的针头进行连续传代，以形成单细胞悬液，从而防止细胞剪切损伤并有效解离细胞团块；第三是使用适当的抗体进行流式细胞术（FACS）分析及细胞分选门控。

由于某些酶会去除表面表位（如 ITGA6 和 NGFR），一种可能的改进方法是调整酶消化方案，以保护这些表位。通过更换针对特定细胞类型表面标志物的特异性抗体，该方案也可用于分离气管内皮细胞或其他间充质细胞。

分离导管细胞和基底细胞的局限性与目前缺乏能够区分导管细胞与基底细胞的表面标志物有关，同时也需要进行上皮表面剥离，且有可能残留部分基底细胞。未来若能鉴定出导管细胞特异性的表面标志物，将使该过程更为简便，并消除对上皮表面剥离步骤的需求，同时也可避免必须使用气管下三分之二段来获得纯基底细胞的需要。

....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
完全培养基 10: DMEM-F-12，50/50，1X	Mediatech	15-090-CV
Hepes (15 mM)	Invitrogen	15630
碳酸氢钠（3.6 mM 或 0.03%）	Invitrogen	25080
L-谷氨酰胺（4 mM）	美迪特	25-005-Cl
青霉素（100 U/ml）	Mediatech	30-001-CI
链霉素（100 μ克/米	美迪特	30-001-CI
胰岛素（10 μg/ml	Sigma	I6634
转铁蛋白（5 μg/ml	Sigma	T1147
霍乱毒素（0.1 μg/ml	Sigma	C8052
表皮生长因子（25 ng/ml）	BD	354001
牛垂体提取物（30 μg/ml	Invitrogen	13028-014
胎牛血清（5%）	Fisher	SH3008803HI
视黄酸（0.05 μM)	Sigma	R2625
生长因子减少型 Matrigel	BD	354230
表1. 完全培养基组分
Pronase	罗氏	10165921001	使用浓度为0.15%： 4°C 下离心 °C 消化法用于分离总气管细胞（用于气液界面培养） -4 小时消化 4 °C 分离 SMG
Dispase	BD Biosciences	354235	使用16单位：室温下30分钟
DNase I	Sigma	DN25	使用浓度为 0.5 mg/ml： 室温下20-30分钟
表2. 用于气管酶解消化的酶。