近年来，高通量测序技术显著提高了染色质免疫沉淀（ChIP）实验的灵敏度，并推动了其在纯化细胞或显微解剖组织中的应用。本文详细阐述了一种在Drosophila组织中使用ChIP技术的方法，该方法可用于研究在一个生物学特征明确的系统中内源性染色质状态。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
表观遗传学是一个快速发展的研究领域，致力于探索染色质状态如何在不同发育阶段的各类细胞类型中导致基因表达的差异。表观遗传调控参与多种生物学过程，包括胚胎发育过程中的细胞分化以及成年期的稳态维持。表观遗传学研究的一项关键策略是探究各种组蛋白修饰和染色质因子如何调控基因表达。为实现这一目标，染色质免疫沉淀（Chromatin Immunoprecipitation, ChIP）技术被广泛用于获取特定因子在目标细胞中与DNA结合情况的快照。
ChIP 技术通常使用培养细胞作为起始材料，这类细胞易于大量获取且具有较高均一性，可产生可重复的数据。然而，该方法存在若干局限性：首先，培养皿中细胞生长的环境与体内环境存在差异 体内因此可能无法反映活体生物细胞中内源性的染色质状态。其次，并非所有类型的细胞都能进行培养 离体可用于ChIP实验的细胞系种类有限，人们难以从中获得足够的材料。
在此，我们介绍一种使用ChIP实验的方法 果蝇 组织。起始材料来自活体动物的解剖组织，因此能够准确反映内源性染色质状态。该方法适用于多种不同类型的组织，可使研究人员解决更多与表观遗传调控相关的生物学问题 体内1, 2将该方法与高通量测序技术（ChIP-seq）相结合，可进一步使研究人员获得表观基因组全景图谱。
方案
（整个ChIP实验过程大约需要两天时间。用于高通量测序的ChIP文库构建还需额外2-3天。）
1. 解剖并制备用于ChIP实验的组织（约100万个细胞）
- 在冷 PBS + 1×蛋白酶抑制剂（将1片蛋白酶抑制剂混合物溶于1.5 mL 1×PBS中，配制成7×储存液）+ PMSF（终浓度为100 μg/mL）中解剖目标组织（例如200对Drosophila睾丸）。用上述缓冲液清洗组织两次，然后将组织重悬于200 μL含抑制剂的相同PBS溶液中。
- 为固定样品，加入5.5 μL 37%甲醛（使用前在37 °C水浴中预热1分钟）。在37 °C孵育15分钟，期间每5分钟涡旋混匀一次。
- 将样品置于冰上，使组织沉降2分钟。用450 μL PBS（含蛋白酶抑制剂和PMSF）清洗两次。样品现可储存于-20 °C。可重复多次解剖以获得足够的ChIP实验材料。
2. 为染色质免疫沉淀（ChIP）实验制备含蛋白质-DNA 复合物的上清液
- 将步骤1.3中足量的样品加入一个1.75 mL离心管中。
- 从组织样本中移除 PBS。添加 200 μL 裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.6，1 mM CaCl2，0.2% Triton X-100 或 NP-40，5 mM 丁酸钠，以及 1× 蛋白酶抑制剂混合物）。向裂解缓冲液中加入新鲜的 PMSF 储存液（PMSF 终浓度为 0.5 mM）。使用蓝色匀浆器（Fisher Cat# 749521-1590）充分匀浆，直至组织完全解离且无任何聚集，于室温（RT）孵育 10 分钟。
- 超声处理：使用微探头超声仪（Misonix HS-XL200），功率设为20。超声10秒，冰上静置50秒，重复4–5次（最佳超声时间需根据经验确定，较长的超声时间会产生更小的片段）。在使用针对组蛋白修饰抗体的ChIP实验中，通常将染色质超声至约200–300 bp；对于转录因子或染色质调控蛋白（如Polycomb蛋白）的ChIP，则通常将染色质超声至200–1000 bp。然而，最佳片段大小应通过实验经验确定。注意：超声过程中也必须始终将离心管置于冰上，以防止样品过热！
- 加入1.8 mL RIPA缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 7.6，1 mM EDTA，0.1% SDS，0.1% 脱氧胆酸钠，1% Triton X-100，含蛋白酶抑制剂和PMSF，浓度与前文所述相同）稀释样品。保存 40 μL 作为输入对照，通过添加 2 μL 5M NaCl，孵育于 65 °C 过夜（O/N）以逆转交联。
- 将抗体与磁珠偶联时，加入 40 μL 将蛋白A磁珠加入一个1.5 ml离心管中，然后添加 600 μL PBS 和岩石在 4 °C 2 分钟后，将磁珠置于磁力架上，移除上清液。加入 100 μL PBS 和目标抗体（抗体用量需通过实验确定）。室温孵育 1 小时或 4 °C 4小时。
- 用磁铁去除珠子上的上清液，向珠子中加入1 mL来自步骤2.4的染色质提取物。旋转孵育于 4 °C 过夜
- 将ChIP样品置于磁力架上，弃去上清液。用以下缓冲液洗涤磁珠 4 °C 每次10分钟：
2 次，每次使用 1 mL RIPA 缓冲液 [1.89 mL 'RIPA 缓冲液' + 315 μL 7x 蛋白酶抑制剂 + 20 μL PMSF
用 1 mL RIPA 缓冲液 + 0.3 M NaCl 洗涤 2 次 [1.89 mL RIPA 缓冲液 + 220 μL 3 M NaCl
用 1 mL 的 LiCl 缓冲液（0.25 M LiCl，0.5% NP40，0.5% NaDOC）洗涤 2 次；
1 次，每次使用 1 mL 1x TE + 0.2% Triton X-100
1 次，每次 1 mL 1× TE 缓冲液。 - 为逆转交联，将珠子重悬于 100 μL TE 缓冲液 + 3 μL 10% SDS + 5 μL 蛋白酶K（20 mg/mL）。于 65 °C 过夜
- 将珠子置于磁铁上，转移上清液至新管中。上清液含有您的DNA样本。用 100 μL TE + 0.5 M NaCl 并合并两次上清液。
- 酚-氯仿抽提DNA样品。加入 200 μL 苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）混合后涡旋振荡。室温下14,000 × g离心5分钟。或者，可使用Qiagen PCR纯化试剂盒提取DNA。
- 将上清液/水相转移至新离心管中，加入线性聚丙烯酰胺至终浓度为 20 μg/mL （或者 1 μL 每1 mL上清液可加入20 mg/mL的糖原。糖原用于后续的qPCR或PCR分析，而线性丙烯酰胺用于测序实验。加入 20 μL 3 M NaOAc 500 μL 100% 乙醇。充分混匀，于指定条件下孵育 80 °C 10 分钟。在最大转速下离心 20 分钟，温度为 4 °C.
- 移除上清液并用 300 μL 70% EtOH。空气干燥后，将样品重悬于 50 μL TE 缓冲液。样品现可于 -20 °C. 样品可用于定量PCR（qPCR）检测（图1).
3. 分析 ChIP 富集的 DNA
3a. 使用 qPCR 分析 ChIP 获得的 DNA
- 将基因组DNA按以下浓度稀释以制作标准曲线：未稀释、1/10、1/100、1/1000、1/5000。
- 针对每对引物，在96孔板中设置两个复孔进行qPCR，分别加入步骤3a.1中的基因组DNA、input对照以及ChIP后的DNA：
10 μL 2x SYBR PCR mix（Fermentas，K0222）；
1 μL 10 μM 上游引物；
1 μL 10 μM 反向引物；
x μL ChIP富集的DNA（输入对照或基因组DNA）；
y μL 无核酸酶的 H2O 以调整反应体系的体积至 20 μL. - 使用Mini plate spinner（Labnet）离心96孔板。
- 使用 ABI 7300 实时 PCR 系统（或其他实时 PCR 系统）按照以下条件进行 qPCR：
第1阶段： 50 °C 2 分钟，1 个循环；
第二阶段： 95 °C 10 分钟，1 个循环；
第3阶段： 95 °C 15 秒 60 °C 1 分钟，40 个循环；
第4阶段（解离阶段）： 95 °C 15 秒 60 °C 1 分钟， 95 °C 15 秒。 - 检查解离曲线：熔解曲线图中出现单个峰表明PCR反应产生单一扩增产物；若出现多个峰，则提示引物对存在非特异性扩增，此时不应使用该qPCR数据。
- 通过计算基于3a.1中系列稀释基因组DNA标准曲线的Ct值（循环阈值）来确定每对引物PCR反应指数扩增的线性阶段，从而推导出根据Ct值计算DNA量的公式。
- 如果ChIP DNA和input对照的Ct值处于Ct值的线性范围内，则根据2.4步骤中ChIP DNA与input对照的稀释倍数，计算ChIP DNA相对于input的富集倍数。
3b. 对染色质免疫沉淀的 DNA 进行扩增，用于高通量测序。
- ChIP-ed DNA 混合物的末端修复（使用 Epicentre DNA END-Repair 试剂盒），在冰上配制如下反应体系：
步骤 2.12 中获得的基因组 DNA 1-34 μl（0.1 至 5 μg）
10× End repair 缓冲液 5 μl
2.5 mM dNTP 混合液 5 μl
10 mM ATP 5 μl
H2O x μl，补足反应体系至 49 μl
End-Repair 酶混合液（T4 DNA 聚合酶 + T4 多核苷酸激酶）1 μl
室温孵育 45 分钟。使用 Qiagen MinElute 反应纯化试剂盒纯化反应产物，用 30 μl 洗脱缓冲液（EB）洗脱。 - 在 3' 端添加 A 突出末端：
步骤 3b.1 中洗脱的 DNA 产物 30 μl
10× NEB Buffer #2 5 μl
1 mM dATP 10 μl
dH2O 2 μl
Klenow 片段（3'→5' 外切酶缺陷型），5 U/μl 3 μl
37 °C 孵育 30 分钟。使用 MinElute 反应纯化试剂盒纯化反应产物，用 10 μl EB 洗脱。 - Solexa 接头连接：
步骤 3b.2 中洗脱的 DNA 10 μl
ddH2O 10 μl
10× T4 DNA 连接酶缓冲液 2.5 μl
Illumina 提供的接头寡核苷酸混合物（原液稀释 10 倍）1 μl
T4 DNA 连接酶（400 单位/μl）2.5 μl
室温孵育 1 小时。使用 MinElute 反应纯化试剂盒纯化反应产物，用 20 μl EB 洗脱。样品现可保存于 -20 °C。 - 使用 E-gel 装置对步骤 3b.3 中洗脱的 DNA 样品进行电泳。从凝胶中切下 300-500 bp 的条带，并使用 Qiagen 凝胶回收试剂盒进行纯化（此步骤可去除接头连接过程中形成的约 125 bp 的自连接接头）。用 12 μl EB 洗脱。
- 使用 Illumina 提供的成对末端（PE）引物扩增文库：
步骤 3b.4 中洗脱的 DNA 10.5 μl
2× Phusion HF 主混合液（Finnzymes）12.5 μl
PE1 PCR 引物 1 1 μl
PE2 PCR 引物 2 1 μl
PCR 反应条件：
98 °C 预变性 30 秒
（98 °C 变性 10 秒，65 °C 退火 30 秒，72 °C 延伸 30 秒），重复 20 个循环
72 °C 最终延伸 5 分钟。 - 步骤 3b.5 中的样品可通过标准 2% 琼脂糖凝胶选择适当大小的 DNA（300-500 bp）后用于 ChIP-seq 分析。样品现可保存于 -20 °C。为避免交叉污染，建议每个 ChIP 样品单独跑胶。样品可提交进行高通量测序。
3c. Solexa 流程分析
- 从 Illumina Genome Analyzer (GA) 流程中获得 25-bp 的测序读段。
- 使用 ELAND（高效局部核苷酸序列比对）软件将所有读段比对至黑腹果蝇（Drosophila）基因组（dm3），允许与参考序列最多两个错配。
- 保留唯一比对的读段用于后续分析。对于多个完全相同的读段，最多保留三个拷贝，以降低 PCR 扩增引入偏差的可能性。
- 将 GA 流程的输出结果转换为浏览器可扩展数据（BED）文件。
- 为生成用于上传至 UCSC 浏览器进行可视化的 wig 文件，我们使用了一个此前文献3中描述的 Python 脚本，窗口大小设为 4 bp，DNA 片段大小设为 160 bp。
- 为将黑腹果蝇（Drosophila）基因分类为沉默基因和表达基因，我们使用了一种称为 RPKM（每千碱基合并外显子区域每百万比对读段数）的数字指标。RPKM = 0 的基因归类为沉默组，RPKM ≥ 1 的基因归类为表达组；表达组可进一步分为低、中、高表达水平三个亚组，每组包含大致相同数量的基因。
- 为比较组蛋白修饰水平与基因表达水平，我们使用了一个此前文献3中描述的 Python 脚本。
4. 典型结果
使用bam (bag of marbles)突变型睾丸进行ChIP-qPCR实验的结果示例如图14所示。在bam突变型睾丸中，精原细胞无法从增殖状态转变为分化状态的精母细胞5, 6。我们利用bam突变型睾丸作为未分化生殖细胞的来源，因为这类细胞在此组织类型中富集。在bam突变型睾丸中，精子分化所必需的分化相关基因（如male-specific transcription factor 87（mst87F）、don juan（dj）和fuzzy onion（fzo））均不表达。这些基因在染色质上表现出高水平的抑制性组蛋白修饰H3K27me37（图1A），但缺乏活性组蛋白修饰H3K4me38（图1B），这种染色质修饰模式被称为“单价”（monovalent）7。H3K27me3或H3K4me3的富集程度是通过与组成型表达的周期蛋白A（Cyclin A, CycA）基因进行归一化分析确定的4。
使用相同的一组抗体（即抑制性标记 H3K27me3 和活性标记 H3K4me3）进行 ChIP-seq 分析， bam 突变型睾丸（图2) 验证了图中所示的 qPCR 结果 图1. 对于三种经测试的终末分化基因 mst87F，dj 和 fzo，它们的基因组区域富含H3K27me3，但不含H3K4me3（图 2A-2C）。相比之下，组成型表达的 CycA 基因在其转录起始位点（TSS）附近具有显著的 H3K4me3 修饰，但几乎无 H3K27me3 结合（图 2D).
此外，四种不同表达基因类别在转录起始位点（TSS）附近H3K27me3和H3K4me3的ChIP谱图与各自组蛋白修饰的功能一致。如图3A所示，TSS下游H3K27me3的富集程度与基因表达水平呈负相关。沉默基因的H3K27me3水平最高，而高表达基因则无H3K27me3结合。这些数据与H3K27me3在基因表达中的抑制作用一致。相反，TSS周围H3K4me3的富集表现出与基因表达水平的正相关关系（图3B），符合H3K4me3在基因表达中的激活作用。
图 1. 利用针对抑制性组蛋白修饰 H3K27me3（A）或活性组蛋白修饰 H3K4me3（B）的抗体，对富集未分化细胞的 bam 突变型睾丸中进行 ChIP-DNA 的 qPCR 分析。（A）在 bam 睾丸中，分化相关基因（Mst87F, dj, fzo）富集了抑制性组蛋白修饰 H3K27me3。（B）分化相关基因中 H3K4me3 活性标记水平降低。目标基因（Mst87F, dj 或 fzo）处的 ChIP DNA（ChIP DNA/input）水平首先以对照基因 CycA 处的 ChIP DNA 水平进行标准化。误差线表示三次独立生物学重复实验的标准差。
图2. H3K27me3和H3K4me3在整个基因组区域富集情况的UCSC基因组浏览器快照：(A) Mst87F、(B) dj、(C) fzo 和 (D) CycA 基因。 图(D)中圈出的H3K27me3富集区域反映了重叠基因CG7264的染色质状态，该基因在bam睾丸中表达水平较低（RPKM=1），而在野生型睾丸中表达水平较高（RPKM=130）8（ChIP-seq数据来自7）。图1中ChIP结果的定量PCR分析所用引物在各图底部标出。点击此处查看高清大图。
图3. 在 bam 精巢中使用 H3K27me3 和 H3K4me3 进行 ChIP-seq 分析7。根据 RNA-seq 结果8，将4组基因（共7,509个基因）按其基因表达水平进行分类。针对每组基因，绘制其转录起始位点（TSS）上游3 kb至下游3 kb序列范围内特定组蛋白修饰的富集情况。由此生成各组中（A）H3K27me3（K27）和（B）H3K4me3（K4）ChIP-seq 分析的富集谱。 点击此处查看高清大图。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本方案中讨论的ChIP分析的多功能性可用于不同组织，从而为在具有生物学相关性的系统中研究染色质状态提供了机会。使用培养系统中的细胞进行ChIP实验操作方便，因为可轻松获得大量细胞。然而，培养细胞未必能反映多细胞环境中的真实细胞状态。通过利用活体动物分离的组织开发该技术，我们可以解答许多培养细胞无法回答的问题。
尽管本方案具有实用性，但仍存在一些注意事项。例如，所分离的组织仍含有多种不同类型的细胞，具有异质性。虽然可获得相对均一的细胞，但 黑腹果蝇 组织如成虫盘，以及其他含有有限数量成体干细胞的组织，如肠道、睾丸和卵巢，均具有异质性。这一复杂性可通过使用强大的 果蝇 遗传学。例如，尽管成体干细胞在上述组织中仅以少量群体存在，且极难分离出足够数量用于ChIP分析，但可通过遗传突变背景来富集干细胞群体。 bam 基因对于干细胞分化是必需的 果蝇 生殖系谱系5,6因此 bam 突变型性腺是富集未分化生殖细胞的良好来源。通过使用ChIP方法 bam 突变体，我们能...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
作者谨此感谢美国国立卫生研究院/国立心肺血液研究所（NIH/NHLBI）Keji Zhao 博士实验室在提供测序结果方面给予的帮助。同时，我们还要感谢加州大学圣克鲁兹分校（UCSC）基因组项目提供基因组浏览器，用于可视化比对后的测序读段。
本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）独立之路奖R00HD055052、美国国立儿童健康与人类发育研究所（NICHD）R01HD065816项目、Lucile Parkard基金会以及约翰斯·霍普金斯大学启动资金对X.C.的资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 完全型微型蛋白酶抑制剂混合液 | Roche Group | 11836153001 | |
| 甲醛（37%） | Supelco, Sigma-Aldrich | 47083-U | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 78830 | |
| Kontes 组织研磨杵 | Fisher Scientific | K749521-1590 | |
| PCR 纯化试剂盒 | Qiagen | 28104 | |
| 线性聚丙烯酰胺 | Sigma-Aldrich | 56575-1ML | |
| 糖原 | Qiagen | 158930 | |
| SYBR Green/ROX qPCR 预混液 | Fermentas | K0223 | |
| 微型离心板旋转器 | Labnet International | Z723533 | |
| 实时荧光定量 PCR 系统 | Applied Biosystems | 4351101 | |
| 小体积超声波处理器 | Misonix | HS-XL2000 | 型号已停产 |
| Dynabeads 蛋白 A 磁珠 | Invitrogen | 100-01D | |
| Dynamag 磁力架 | Invitrogen | 123-21D | |
| 苯酚:氯仿:异戊醇 | Invitrogen | 15593-049 | |
| Epicentre DNA 末端修复试剂盒 | Epicentre Biotechnologies | ER0720 | |
| MinElute 反应纯化试剂盒 | Qiagen | 28204 | |
| Klenow 片段（3’→5’ 外切酶缺陷型） | New England Biolabs | M0212S | |
| T4 DNA 连接酶 | Promega Corp. | M1794 | |
| 接头寡核苷酸 | Illumina | PE-400-1001 | |
| 成对末端引物 1.0 和 2.0 | Illumina | 1001783 1001 784 | |
| E-Gel 电泳系统 | Invitrogen | G6512ST | |
| 2× Phusion HF 预混液 | Finnzymes | F-531 |
参考文献
- Kharchenko, P. V., Alekseyenko, A. A., Schwartz, Y. B., Minoda, A., Riddle, N. C., Ernst, J., Sabo, P. J., Larschan, E., Gorchakov, A. A., Gu, T. Comprehensive analysis of the chromatin landscape in Drosophila melanogaster. Nature. 471, 480-485 (2011).
- Filion, G. J., van Bemmel, J. G., Braunschweig, U., Talhout, W., Kind, J., Ward, L. D., Brugman, W., de Castro, I. J., Kerkhoven, R. M., Bussemaker, H. J., van Steensel, B. Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells. Cell. 143, 212-224 (2010).
- Barski, A., Cuddapah, S., Cui, K., Roh, T. Y., Schones, D. E., Wang, Z., Wei, G., Chepelev, I., Zhao, K. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129, 823-837 (2007).
- Chen, X., Lu, C., Prado, J. R., Eun, S. H., Fuller, M. T. Sequential changes at differentiation gene promoters as they become active in a stem cell lineage. Development. 138, 2441-2450 (2011).
- Gonczy, P., Matunis, E., DiNardo, S. bag-of-marbles and benign gonial cell neoplasm act in the germline to restrict proliferation during Drosophila spermatogenesis. Development. 124, 4361-4371 (1997).
- McKearin, D. M., Spradling, A. C. bag-of-marbles: a Drosophila gene required to initiate both male and female gametogenesis. Genes Dev. 4, 2242-2251 (1990).
- Gan, Q., Schones, D. E., Eun, S. H., Wei, G., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. Monovalent and unpoised status of most genes in undifferentiated cell-enriched Drosophila testis. Genome Biol. 11, 42-42 (2010).
- Gan, Q., Chepelev, I., Wei, G., Tarayrah, L., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. Dynamic regulation of alternative splicing and chromatin structure in Drosophila gonads revealed by RNA-seq. Cell Res. 7, 763-783 (2010).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
