使用 Drosophila 组织进行染色质免疫沉淀（ChIP）

摘要

近年来，高通量测序技术显著提高了染色质免疫沉淀（ChIP）实验的灵敏度，并推动了其在纯化细胞或显微解剖组织中的应用。本文详细阐述了一种在Drosophila组织中使用ChIP技术的方法，该方法可用于研究在一个生物学特征明确的系统中内源性染色质状态。

摘要

表观遗传学是一个快速发展的研究领域，致力于探索染色质状态如何在不同发育阶段的各类细胞类型中导致基因表达的差异。表观遗传调控参与多种生物学过程，包括胚胎发育过程中的细胞分化以及成年期的稳态维持。表观遗传学研究的一项关键策略是探究各种组蛋白修饰和染色质因子如何调控基因表达。为实现这一目标，染色质免疫沉淀（Chromatin Immunoprecipitation, ChIP）技术被广泛用于获取特定因子在目标细胞中与DNA结合情况的快照。

ChIP 技术通常使用培养细胞作为起始材料，这类细胞易于大量获取且具有较高均一性，可产生可重复的数据。然而，该方法存在若干局限性：首先，培养皿中细胞生长的环境与体内环境存在差异 体内因此可能无法反映活体生物细胞中内源性的染色质状态。其次，并非所有类型的细胞都能进行培养 离体可用于ChIP实验的细胞系种类有限，人们难以从中获得足够的材料。

在此，我们介绍一种使用ChIP实验的方法 果蝇 组织。起始材料来自活体动物的解剖组织，因此能够准确反映内源性染色质状态。该方法适用于多种不同类型的组织，可使研究人员解决更多与表观遗传调控相关的生物学问题 体内^{1, 2}将该方法与高通量测序技术（ChIP-seq）相结合，可进一步使研究人员获得表观基因组全景图谱。

方案

（整个ChIP实验过程大约需要两天时间。用于高通量测序的ChIP文库构建还需额外2-3天。）

1. 解剖并制备用于ChIP实验的组织（约100万个细胞）

1. 在冷 PBS + 1×蛋白酶抑制剂（将1片蛋白酶抑制剂混合物溶于1.5 mL 1×PBS中，配制成7×储存液）+ PMSF（终浓度为100 μg/mL）中解剖目标组织（例如200对Drosophila睾丸）。用上述缓冲液清洗组织两次，然后将组织重悬于200 μL含抑制剂的相同PBS溶液中。
2. 为固定样品，加入5.5 μL 37%甲醛（使用前在37 °C水浴中预热1分钟）。在37 °C孵育15分钟，期间每5分钟涡旋混匀一次。
3. 将样品置于冰上，使组织沉降2分钟。用450 μL PBS（含蛋白酶抑制剂和PMSF）清洗两次。样品现可储存于-20 °C。可重复多次解剖以获得足够的ChIP实验材料。

2. 为染色质免疫沉淀（ChIP）实验制备含蛋白质-DNA 复合物的上清液

1. 将步骤1.3中足量的样品加入一个1.75 mL离心管中。
2. 从组织样本中移除 PBS。添加 200 μL 裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.6，1 mM CaCl2，0.2% Triton X-100 或 NP-40，5 mM....

讨论

本方案中讨论的ChIP分析的多功能性可用于不同组织，从而为在具有生物学相关性的系统中研究染色质状态提供了机会。使用培养系统中的细胞进行ChIP实验操作方便，因为可轻松获得大量细胞。然而，培养细胞未必能反映多细胞环境中的真实细胞状态。通过利用活体动物分离的组织开发该技术，我们可以解答许多培养细胞无法回答的问题。

尽管本方案具有实用性，但仍存在一些注意事项。例如，所分离的组织仍含有多种不同类型的细胞，具有异质性。虽然可获得相对均一的细胞，但 黑腹果蝇 组织如成虫盘，以及其他含有有限数量成体干细胞的组织，如肠道、睾丸和卵巢，均具有异质性。这一复杂性可通过使用强大的 果蝇 遗传学。例如，尽管成体干细胞在上述组织中仅以少量群体存在，且极难分离出足够数量用于ChIP分析，但可通过遗传突变背景来富集干细胞群体。 bam 基因对于干细胞分化是必需的 果蝇 生殖系谱系^5,6因此 bam 突变型性腺是富集未分化生殖细胞的良好来源。通过使用ChIP方法 bam 突变体，我们能.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
完全型微型蛋白酶抑制剂混合液	Roche Group	11836153001
甲醛（37%）	Supelco, Sigma-Aldrich	47083-U
PMSF	Sigma-Aldrich	78830
Kontes 组织研磨杵	Fisher Scientific	K749521-1590
PCR 纯化试剂盒	Qiagen	28104
线性聚丙烯酰胺	Sigma-Aldrich	56575-1ML
糖原	Qiagen	158930
SYBR Green/ROX qPCR 预混液	Fermentas	K0223
微型离心板旋转器	Labnet International	Z723533
实时荧光定量 PCR 系统	Applied Biosystems	4351101
小体积超声波处理器	Misonix	HS-XL2000	型号已停产
Dynabeads 蛋白 A 磁珠	Invitrogen	100-01D
Dynamag 磁力架	Invitrogen	123-21D
苯酚:氯仿:异戊醇	Invitrogen	15593-049
Epicentre DNA 末端修复试剂盒	Epicentre Biotechnologies	ER0720
MinElute 反应纯化试剂盒	Qiagen	28204
Klenow 片段（3’→5’ 外切酶缺陷型）	New England Biolabs	M0212S
T4 DNA 连接酶	Promega Corp.	M1794
接头寡核苷酸	Illumina	PE-400-1001
成对末端引物 1.0 和 2.0	Illumina	1001783 1001 784
E-Gel 电泳系统	Invitrogen	G6512ST
2× Phusion HF 预混液	Finnzymes	F-531