使用特异性糖苷酶从糖蛋白中去除糖链，随后进行SDS-PAGE，是检测蛋白质样品上聚糖修饰的一种有效方法，也是开展初步糖生物学研究的良好选择。去糖基化后的变化可通过凝胶电泳迁移率的改变或使用对聚糖敏感的染色试剂进行染色来检测。
本文内容
摘要
摘要
糖基化是指共价连接糖分子的修饰过程，是蛋白质主要的翻译后修饰之一，可显著影响细胞黏附、分子转运、清除作用以及信号转导等生物学过程1-4。在真核生物中，分泌途径中最常见的糖基化修饰发生在天冬酰胺残基上的共有序列位点（N-连接）；或发生在丝氨酸或苏氨酸残基上（O-连接）（图1）。N-聚糖合成的起始过程在真核生物中高度保守，而最终产物则在不同物种、组织或蛋白质之间存在显著差异。某些糖链保持未修饰状态（“高甘露糖型 N-聚糖”），或在高尔基体中进一步加工（“复杂型 N-聚糖”）。O-聚糖具有更高的多样性，在动物细胞中通常以 N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）残基起始，但在低等生物中有所不同1。
对蛋白质糖基化的详细分析本身就是一个独立的领域，需要大量的资源和专业知识才能正确实施。然而，在常规实验室条件下，利用多种可去除糖链的酶（糖苷酶），可以大致了解蛋白质的糖基化状态。本文以一种模型糖蛋白——重组人绒毛膜促性腺激素β亚基（hCGβ）为例，演示糖苷酶在糖基化分析中的应用。该蛋白含有两个N-聚糖和四个O-聚糖5。该技术仅需简单的仪器和常规耗材，且可轻松扩展用于多种糖蛋白样品的分析。
可同时使用多种酶来研究糖蛋白。PNGase F 能够去除几乎所有类型的 N-连接的聚糖6,7。对于 O-糖链，目前尚无可用的酶能够从蛋白质骨架上切割下完整的寡糖链。相反， O-糖链被外切糖苷酶修剪为短的核心结构，随后可被轻易去除 O-糖苷酶。蛋白质去糖基化试剂混合物含有PNGase F， O-糖苷酶，神经氨酸酶（唾液酸酶），β1-4 半乳糖苷酶，和 β-N-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶。用于同时去除 N-糖链和某些 O-糖链8 最后，向去糖基化混合液中添加了其他外切糖苷酶的混合物（α-N乙酰半乳糖胺酶，α1-2 岩藻糖苷酶，α1-3,6 半乳糖苷酶和 β1-3 半乳糖苷酶），有助于去除某些情况下可能存在的、通常难以清除的单糖 O-糖链
SDS-PAGE/考马斯亮蓝染色用于观察糖苷酶处理前后蛋白质迁移的差异。此外，糖特异性染色方法ProQ Emerald-300可显示随着糖链逐步被去除，信号逐渐减弱。本方案适用于微量糖蛋白（0.5至2 μg）的分析，但酶法去糖基化反应可根据需要放大以适应较大量的蛋白质样品。
方案
1. 酶法去糖基化
- 使用 PCR 管以尽量减少因蒸发造成的水分流失。将一组试管标记为 1 至 7。
- 解冻 10X G7 缓冲液、10X 糖蛋白变性缓冲液和 10% NP-40，并轻轻弹击管壁以混匀内容物。置于室温保存。
- 将含酶的小瓶置于冰上。尽量减少冻融循环。
- 将 hCGβ 小瓶中的内容物（150 μg）溶解于 600 μl dH2O 中，并置于冰上保存。
- 通过将 10X 储存液用 dH2O 稀释来配制 1 ml 的 1X G7 缓冲液。
- 将 0.5 μl PNGase F 用 25 μl 1X G7 缓冲液稀释，并置于冰上保存。
- 通过混合 α-N-乙酰半乳糖胺酶、α1-2 岩藻糖苷酶、β1-3 半乳糖苷酶和 α1-3,6 半乳糖苷酶各 2 μl，制备外切糖苷酶混合液（EG 混合液）。
- 按如下所示设置 PCR 管：
| 试管/样品编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| hCGβ (0.25mg/ml) | 9μl | 9μl | 9μl | 9μl | -- | -- | -- |
| 10X 糖蛋白变性缓冲液 | 1μl | 1μl | 1μl | 1μl | 1μl | 1μl | 1μl |
| dH2O | -- | -- | -- | -- | 9μl | 9μl | 9μl |
- 盖上管盖，轻轻混匀，放入PCR仪中，关闭盖子，在94°C孵育10分钟以使蛋白质变性，随后在4°C保持（使用PCR仪中的PCR管可显著防止小体积样品蒸发）。
- 从PCR仪中取出管子，离心以去除任何可见的冷凝液。
- 按指示加入以下试剂：
| 样品编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| 10% NP-40 | 2.5μl | 2.5μl | 2.5μl | 2.5μl | 2.5μl | 2.5μl | 2.5μl |
| 10X G7 缓冲液 | 2.5μl | 2.5μl | 2.5μl | 2.5μl | 2.5μl | 2.5μl | 2.5μl |
| PNGase F 1:50 稀释液 | -- | 2μl | -- | -- | 2μl | -- | -- |
| 去糖基化混合液 | -- | -- | 2μl | 2μl | -- | 2μl | 2μl |
| EG 混合液 | -- | -- | -- | 2μl | -- | -- | 2μl |
| dH2O | 10μl | 8μl | 8μl | 6μl | 8μl | 8μl | 6μl |
| 总反应体积 | 25μl | 25μl | 25μl | 25μl | 25μl | 25μl | 25μl |
- 使用新盖子盖紧PCR管（丢弃用过的盖子，因为经过一次孵育循环后它们无法正确密封）。
- 轻轻敲击管壁4次以混匀溶液，然后短暂离心使液体沉降至管底。
- 将PCR管放入热循环仪中，在37 °C孵育4小时，随后将样品冷却至4 °C。
2. 去糖基化样品的SDS-PAGE
- 通过加入 4 μl 的 1.25 M DTT，配制 130 μl 新鲜的 3X 还原性 SDS 上样缓冲液。
- 向每个样品中加入 12.5 μl 新配制的 3X 还原性 SDS 上样缓冲液。
- 用新盖子盖紧管子，并轻轻敲击混匀。
- 将管子置于热循环仪中，在 94°C 孵育 5 分钟，然后冷却至 4 °C。
- 在 10–20% Tris-甘氨酸凝胶上，每份样品上样 30 μl，同时上样 10 μl 蛋白质标记物。将剩余样品保存用于第 3.1 部分。上样 10 μl ColorPlus 预染蛋白质标记物。
- 在室温下以 130 伏电压进行电泳，直至染料前沿迁移至凝胶底部附近。
- 电泳结束后，将凝胶从模具中取出，放入一个小塑料盒中，加入足量考马斯亮蓝染色液以覆盖凝胶。
- 在轻微振荡条件下染色 1 小时。
- 用 50 ml 脱色液将凝胶洗涤三次，每次 30 分钟。
- 使用白光透射仪或扫描仪记录图像。或者，也可将凝胶夹在玻璃纸之间，置于框架中干燥。
3. 使用 Pro-Q Emerald 300 染色法检测 SDS-PAGE 凝胶中的糖基化蛋白
- 与步骤2.1中的凝胶同时，将剩余样品上样至一块10-20% Tris-甘氨酸凝胶中，并上样10μl ColorPlus预染蛋白质Marker。
- 在电泳进行的同时，用DMF溶解Pro-Q Emerald试剂，并根据试剂盒提供的产品说明书，配制Pro-Q Emerald 300染色所需的固定液（Fix）、洗涤液（Wash）和氧化液（Oxidizing）储备液。
- 电泳完成后，将凝胶从制胶模具中取出，放入一个塑料盒中。
- 加入100 ml固定液，在室温下轻轻振荡固定过夜。
- 用100 ml洗涤液在室温下轻轻振荡洗涤凝胶10至20分钟，更换新鲜洗涤液后重复洗涤一次。
- 将凝胶置于25 ml氧化液中，在室温下轻轻振荡孵育30分钟，以氧化碳水化合物。
- 按照步骤3.5所述方法再次洗涤凝胶。
- 在凝胶洗涤过程中，取步骤3.2中溶解的Pro-Q Emerald 300试剂溶液500 μl，加入试剂盒提供的25 ml染色缓冲液中，新鲜配制Pro-Q Emerald 300染色液。
- 加入25 ml步骤3.8中配制的染色液，避光条件下轻轻振荡孵育90至120分钟，对凝胶进行染色。
- 重复步骤3.5中所述的两次洗涤步骤。
- 使用300 nm紫外透射仪记录图像。利用被Pro-Q Emerald Green标记的80 kDa蛋白Marker，将紫外图像与显示预染蛋白Marker梯度的白光图像进行叠加比对。
- 比较步骤2.10中考马斯亮蓝染色凝胶的图像与步骤3.11中Pro-Q Emerald染色凝胶的图像。
4. 代表性结果
酶法去糖基化后蛋白质迁移率的变化如图2所示。将对照样品（图A，第1道）与PNGase F处理（去除N-糖链，第2道）以及去糖基化混合酶（PNGase F；加上内切和外切糖苷酶以去除O-糖链，第3道）进行比较。在额外添加糖苷酶消化后未观察到分子量进一步降低（第4道）。除分子量变化外，随着糖链的去除，条带变得更清晰。位于17 kDa标记物下方的一条条带（星号）代表完全去糖基化的hCGβ多肽（分子量：16 kDa）。其他条带可能源于去糖基化不完全，或hCGβ样品中存在的多种未鉴定蛋白质（见第1道）。第5至第7道（对照）显示了对应于糖苷酶的条带。
Emerald Green 对糖蛋白的染色结果如 B 图所示。该试剂可氧化并染色蛋白质分子中存在的所有糖链。因此，随着 hCGβ 经酶法去糖基化，信号强度逐渐减弱（泳道 1 至泳道 4）。泳道 3 和 4 中残留的信号表明存在对所用酶具有抗性的糖链基序。泳道 4 中额外添加的糖苷酶可去除少量额外的糖残基：蛋白质迁移位置相同，但染色强度略有降低。抗性糖基团并非存在于所有蛋白质种类中：某些条带未被 Emerald Green 检测到（紫外图像中缺失，括号内所示），表明这些蛋白质已被广泛去糖基化。其他数据进一步支持 hCGβ 存在异质性糖基化的结论。泳道 2 中的下部条带（箭头所示）在 Emerald Green 成像中信号较弱，而上部条带信号较强，表明仍保留大量糖基团。这些结果支持如下结论：在小鼠细胞中表达的重组 hCGβ 含有多种糖型9。这些不同的糖型源于糖基化固有的异质性，即某些多肽链在每个共识位点并未都连接糖链，和/或某些糖链发生了延伸，而同一蛋白质上的其他糖链则未延伸。
图1. 分泌型或细胞表面糖蛋白的典型糖基化模式。
图 2. SDS-PAGE 凝胶显示 hCGβ 的酶法去糖基化结果。图 A 为考马斯亮蓝染色结果，图 B 为 Pro-Q Emerald 300 染色结果，用于可视化糖基化蛋白。样品编号：1，hCGβ 对照；2，PNGase F 消化；3，去糖基化混合酶消化；4，去糖基化混合酶加外切糖苷酶消化；样品 5 至 7 为试剂对照（O-Glyc，O-糖苷酶；GNA，β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶；Gal/Fuc，β1-3 半乳糖苷酶、α1-3,6 半乳糖苷酶和 α1-2 岩藻糖苷酶；GalNA，α-N-乙酰半乳糖胺苷酶；Neu，神经氨酸酶；PNGase，PNGase F）
讨论
本文所述利用酶法去糖基化和SDS-PAGE的方法可提供有关目标蛋白糖基化状态的重要信息，而糖链特异性试剂有助于数据的解读。本方案适用于蛋白质糖基化的初步研究，尤其适用于哺乳动物细胞来源的分泌型和膜结合型糖蛋白：本实验所选用的酶可特异性地去除所有N-糖链，或去除N-糖链以及构成O-糖链核心的最常见延伸糖类。与化学去糖基化方法相比，糖苷酶具有额外优势，即反应条件温和，能够保持糖类和蛋白质骨架的完整性。
为了阐明占据率（哪些氨基酸被糖基化）、糖基化的程度或确定糖链的精细结构，需要采用更复杂的技术，例如质谱法、液相色谱法或核磁共振波谱法。
由于该实验方案操作简便，其中多个步骤可根据不同的实验需求进行调整、替换和/或组合。然而，为了获得可明确解释的结果，理解该方法的优势与局限性至关重要。首先，糖苷酶的特异性和纯度极为关键：必须使用经过充分表征、且已验证不含蛋白酶及其他污染活性的酶制剂。遗憾的是，目前尚无统一的糖苷酶酶活性单位定义；使用者应根据生产商提供的说明确定合适的替代方案。其次，检测方法的选择必须谨慎：a) 蛋白质染色试剂仅在去糖基化导致分子质量发生显著变化时才有效。如本实验所示的清晰结果并非总能获得。在其他情况下，我们曾观察到去糖基化后出现异常迁移现象（远离预测的分子量，甚至出现迁移更慢的情况）。这一现象尚未被充分理解，但可以认为，迁移行为的任何改变均表明蛋白质已发生去糖基化。b) 使用抗体检测糖链存在独特挑战，限制了其应用范围。开发广谱性抗糖链抗体非常困难；这些抗体通常针对复杂的糖链结构制备，因而应用受限。此外，多种抗糖链单克隆抗体表现出非预期的交叉反应性10。c) 凝集素（具有内在糖结合能力的蛋白质）适用于糖链检测，并可提供有关糖链结构的信息。然而，并非所有凝集素都具有高度特异性；许多凝集素的特性仅被部分阐明（意味着它们可能具有未知的结合特性）。因此，凝集素阳性染色仅能提示某种糖的存在，而不能作为确证。d) 化学标记试剂盒（基于糖的高碘酸氧化反应）是染色所有糖蛋白的首选方法，因此非常适合用于追踪去糖基化过程。
处理未知样品时，建议包含糖蛋白对照。胎球蛋白（Fetuin）是一种易于获得的N-和O-糖蛋白；人绒毛膜促性腺激素（两个亚基）也是一个良好的选择。牛血清白蛋白（BSA）可用作阴性对照。但需注意，某些非糖基化蛋白质也可能与Pro-Q Emerald 300发生轻微反应，尤其是在高浓度使用时。非糖基化分子量标准品（例如本实验方案中使用的预染蛋白标记物）具有条带清晰的优点。其中仅有一种蛋白（80 kDa）偶然对Pro-Q Emerald 300产生反应。因此，用户可能更倾向于使用糖蛋白标准品梯度，例如Invitrogen公司的Candy-Cane糖蛋白标准品。
最后，利用单克隆抗体结合β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶进行特异性对照，可实现对核质糖蛋白（仅被单个O-GlcNAc修饰）的简单凝胶内检测11。该技术的详细描述超出了本文范围，但鉴于糖苷酶是研究细胞中许多其他糖蛋白和糖缀合物的有用工具，此处应予提及。所有已知糖基化形式的全面论述可参见《糖生物学精要》第二版，该书可在NCBI图书架免费在线获取（图书架编号：NBK1908；PMID：20301239）12。
披露
作者受雇于 New England Biolabs，该公司生产本文所用的多种试剂。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 人绒毛膜促性腺激素 β | Sigma-Aldrich | C6572 | |
| PCR管 | VWR international | 20170-004 | |
| PCR扩增仪 | Applied Biosystems | 4359659 | |
| PNGase F | New England Biolabs | P0704 | 随缓冲液提供 |
| 蛋白质去糖基化混合酶 | New England Biolabs | P6039 | 随缓冲液提供 |
| α-N-乙酰半乳糖胺酶 | New England Biolabs | P0734 | 随缓冲液提供 |
| α1-2岩藻糖苷酶 | New England Biolabs | P0724 | 随缓冲液提供 |
| α1-3,6半乳糖苷酶 | New England Biolabs | P0731 | 随缓冲液提供 |
| β1-3半乳糖苷酶 | New England Biolabs | P0726 | 随缓冲液提供 |
| 10X G7缓冲液（500 mM 磷酸钠） | New England Biolabs | --- | 随PNGase F或去糖基化混合酶提供 |
| 10X 糖蛋白变性缓冲液（5% SDS，400 mM DTT） | New England Biolabs | --- | 随PNGase F或去糖基化混合酶提供 |
| 10% NP-40 | New England Biolabs | --- | 随PNGase F或去糖基化混合酶提供 |
| 3X SDS上样缓冲液（187.5 mM Tris-HCl pH 6.8，6% SDS，30%甘油，0.03%溴酚蓝） | New England Biolabs | B7703 | 随1.25M DTT提供 |
| ColorPlus预染蛋白Marker | New England Biolabs | P7709 | |
| 10-20% Tris-甘氨酸多胶 | Cosmo Bio Co. | DCB-414893 | |
| 胶盒式电泳装置 | Cosmo Bio Co. | DCB-303111 | |
| 电泳电源 EPS 301 | GE Healthcare | 18-1130-01 | |
| Pro-Q Emerald 300糖蛋白染色试剂盒 | Invitrogen | P-21857 | |
| 亮蓝R | Sigma-Aldrich | B0149 | |
| AlphaImager HP成像系统 | Cell Biosciences | 92-13823-00 |
参考文献
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重印与许可
