使用同位素标记质谱法分析硫醇氧化还原蛋白质组

摘要

当细胞遇到应激条件时，活性氧水平会升高。本文以Pseudomonas syringae处理的番茄叶片为例，展示3'-3'二氨基联苯胺染色以及cysTMT标记结合质谱技术对氧化还原蛋白质组进行分析的方法。

摘要

Pseudomonas syringae pv. tomato 菌株 DC3000 不仅可引起Solanum lycopersicum的细菌性斑点病，还可感染Brassica属植物以及遗传操作便利的模式植物Arabidopsis thaliana^1,2。接种DC3000后子叶中活性氧（ROS）的积累表明，ROS在番茄细菌性斑点病导致的坏死性细胞死亡过程中具有调控作用³。过氧化氢是ROS的一种组分，在番茄植株接种Pseudomonas后产生³。过氧化氢可通过组织化学染色剂3'-3'二氨基联苯胺（DAB）进行检测⁴。DAB染色与过氧化氢反应后在叶片组织上形成棕色沉淀⁴。ROS在调节细胞氧化还原环境方面具有重要作用，可改变某些蛋白质的氧化还原状态⁵。半胱氨酸是一种对氧化还原变化敏感的重要氨基酸。在轻度氧化条件下，半胱氨酸巯基的可逆性氧化可作为氧化还原感应器和信号转导分子，调控多种生理过程^6,7。串联质谱标签（TMT）试剂能够利用串联质谱技术同时鉴定并进行多个样本中蛋白质的多重定量分析^8,9。半胱氨酸反应性TMT（cysTMT）试剂可实现对来自最多六个生物学样本的含半胱氨酸肽段的选择性标记和相对定量。每种同量异位素cysTMT标签具有相同的标称母离子质量，由一个巯基反应基团、一个质谱中性间隔臂和一个质谱/质谱（MS/MS）报告离子组成¹⁰。标记完成后，样品经蛋白酶消化处理。利用含有抗TMT抗体的树脂富集标记了半胱氨酸的肽段。在MS/MS分析过程中，一系列报告离子（即126–131 Da）出现在低质荷比区域，提供相对定量信息。该工作流程可有效降低样品复杂性、提高动态范围，并用于研究半胱氨酸的修饰变化。本文介绍了采用cysTMT技术对Pst DC3000处理的番茄（Rio Grande）叶片进行氧化还原蛋白质组学分析的方法。这一高通量方法有望应用于其他受氧化还原调控的生理过程的研究。

方案

1. 幼苗培养与细菌制备

1. 将幼苗在生长室中（光照强度为160 μmol photons m^-2s^-1，光周期为每天8小时光照（22 °C）和16小时黑暗（20 °C））的MetroMix 500土壤混合物（BWI Companies）中培养1周。相对湿度设定为70%。根据需要浇灌自来水，以防止土壤变干。
2. 选取两株大小相近的幼苗，移栽至装有MetroMix 500土壤的4英寸直径花盆中，并在与步骤1.1相同的条件下继续培养3周。
3. 将丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae，Pst）初始以T型划线法接种于Kings B培养基（KBM）平板上（每升含：20 g蛋白胨，0.1975 g MgSO₄，1%甘油，1.5 g K₂HPO₄，18 g琼脂），在28 °C下培养两天。挑取单菌落，混入300 μL液体Kings B培养基（20 g蛋白胨，0.1975 g MgSO₄，10 mL甘油，10 mL 100x K₂HPO₄储备液（1.5 g K₂HPO₄溶于10 mL H₂O））中，涂布于Kings B培养基平板，于28 °C过夜培养。
4. 通过将培养后的细菌从KBM平板上刮下并悬浮于20 mL H₂O中制备细菌接种液。用1 L接种缓冲液（10 mM MgCl₂ + 400 μL Silwett-70）将菌液调至OD₆₀₀为0.03（约10⁶ cfu/mL）。以不含细菌的接种缓冲液作为空白对照溶液。

2. 用Pst接种番茄及H₂O₂组织化学染色

1. 将四周大的植株浸入上述接种液中30秒进行接种。接种后立即用透明塑料袋覆盖植株。
2. 使用前3天配制3'-3'二氨基联苯胺（DAB）染色液¹¹（1 mg/ml DAB 溶于 H₂O，用 HCl 调 pH 至 3.8），以确保完全溶解。溶液在室温下轻轻摇动混匀。
3. 处理24小时后，取完全展开的叶片，将表皮朝上置于DAB染色液中，真空渗透15分钟。随后将叶片于室温避光条件下染色过夜。
4. 叶片在95%乙醇中煮沸10分钟，然后保存于75%乙醇中。

3. 蛋白质提取

1. 收获后，将番茄叶片在液氮中用研钵和研杵研磨成细粉。
2. 每0.5 g组织，加入1.25 mL Tris pH 8.8缓冲酚和1.25 mL / 0.5 g提取缓冲液（0.1 M Tris-HCl pH 8.8，10 mM EDTA，0.9 M蔗糖），然后在通风橱中继续研磨数分钟。
3. 将提取物转移至Oakridge离心管（Thermo Fisher Scientific Nalgene Company），室温下振荡2小时。
4. 在5,000×g、15 °C条件下离心10分钟。将上层酚相转移至新的洁净离心管中。
5. 用等体积的提取酚缓冲液反向萃取水相；在摇床上振荡30分钟。离心后将提取物转移至新的Falcon管中。
6. 重复上述步骤一次，并将提取物转移至新的Oakridge管中。
7. 通过加入5倍体积的含0.1 M乙酸铵的100%甲醇（-20 °C保存）沉淀酚相提取的蛋白质。涡旋混匀后于-20 °C过夜孵育。
8. 在20,000×g、4 °C条件下离心20分钟，收集蛋白沉淀。
9. 用冷的含0.1 M乙酸铵的甲醇洗涤沉淀2次，再用80%冷丙酮洗涤2次。向沉淀中加入1.5 mL冷的70%乙醇并悬浮，转移至2 mL微量离心管（USA Scientific）中，在14,000 rpm、4 °C条件下离心20分钟。弃去乙醇。
10. 将沉淀在SpeedVac浓缩仪中短暂干燥，然后溶解于蛋白提取缓冲液中，例如ReadyPrep蛋白提取试剂盒试剂3（8 M尿素，4% CHAPS，40 mM Tris碱，2 M硫脲）（Bio-Rad）。在14,000 rpm、20 °C条件下离心30分钟以形成沉淀，收集上清液。
11. 根据制造商说明书（Geno Technology），使用CB-X蛋白测定法测定蛋白浓度。

4. 样品制备及使用 cysTMTs 进行肽段标记

1. 将蛋白样品配制为浓度 2-5 μg/μL。本实验中，每种质量标签使用 100 μg 蛋白，样品体积为 20 μl-50 μL。本实验共使用了全部 6 种标签。
2. 向蛋白样品中加入等体积的烷基化缓冲液（100 mM Tris-HCl pH 7.5，200 mM 碘乙酰胺），以封闭游离巯基。缓冲液需现配现用。在 37 °C 下反应 1 小时完成烷基化。
3. 加入 1 mL 预冷的 80% 丙酮于 -20°C 过夜沉淀蛋白。在 4 °C 下以 14,000 rpm 离心 20 分钟收集蛋白沉淀。每次用 80% 丙酮洗涤沉淀 3 次，每次均涡旋混匀。弃去上清液，将沉淀置于冰上晾干。
4. 将沉淀重悬于 50 μL 裂解缓冲液（6 M 尿素，50 mM Tris 碱，1 mM EDTA）中。然后加入 0.5 μL 的 100 mM 三(2-羧乙基)膦（TCEP），室温孵育 1 小时以还原二硫键。
5. 向试剂管中加入 20 μL 乙腈以溶解标签，充分涡旋并短暂离心至管底。
6. 使用 Microcon 3KD 离心过滤装置（Millipore）去除多余的 TCEP。将 50 μL 样品加入 Microcon 3KD 柱中，再加入 50 μL 裂解缓冲液。在 10,000×g、4 °C 下离心 15 分钟，重复此步骤共三次。移除滤柱并倒置插入洁净离心管中，在 1,000×g、4 °C 下离心 5 分钟以回收滤出液。
7. 检测 pH 值。如需要，用 1 M HCl 将 pH 调整至 7.0–8.0。
8. 向每个样品中加入 5 μL 的 cysTMT 试剂（cysTMT 试剂盒提供的标签可处理最多 500 μg 蛋白，共 20 μL。本方法使用 100 μg 蛋白，因此使用五分之一的标签量）。室温反应 2 小时。
9. 将样品与 Laemmli 样品缓冲液（Bio-Rad）按 1:1 体积比混合。

5. 未反应标签样品组分的去除

1. 样品在 95°C 下煮沸 5 分钟，随后在预制的 12% 聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Rad）上进行电泳分离。凝胶用经滤膜过滤的 H₂O 冲洗三次，每次 5 分钟。₂O 并用考马斯亮蓝（Bio-Rad）染色 1 小时。凝胶用 H₂O.
2. 从每条凝胶泳道中收集十二个组分。组分根据蛋白质条带的浓度确定。将各组分切成1 mm大小的碎片，收集至1.5 mL离心管中。
3. 胶块使用含50%乙腈和0.1 M碳酸氢铵的H₂O溶液进行脱色₂此步骤需重复进行，直至凝胶块中的蓝色完全去除（约3–4次，每次15分钟）。
4. 脱色后的凝胶条用100%乙腈（覆盖凝胶条）干燥15分钟，移除上清液后，再用SpeedVac干燥。
5. 将胰蛋白酶（Promega）以1:10（胰蛋白酶：蛋白质）的比例溶解于与混合标记样品相同体积的25 mM碳酸氢铵溶液中。例如， 600 μg 体积为的蛋白质样品 500 μL 需求 60 μg 胰蛋白酶溶解于 500 μL 25 mM 碳酸铵
6. 将胰蛋白酶溶液加入凝胶碎块中，置于冰上进行再水合。若凝胶碎块未被完全覆盖，可补充50 mM碳酸氢铵缓冲液。再水合后，于 37 °C 12-16 小时。
7. 从孵育后的样品中移除液体蛋白提取物。
8. 终止反应，并用含5%甲酸、50%乙腈的溶液覆盖胶粒以去除残留的蛋白质消化产物。室温下振荡胶粒20分钟。将上清液转移至5.7步骤中获得的蛋白质样品管中。重复提取步骤两次。使用SpeedVac真空离心浓缩仪干燥提取的肽段。

6. cysTMT 标记肽段样品富集

1. 向0.5 mL离心管中加入抗TMT树脂梯度，制成50%悬液。（树脂用量根据分级凝胶中条带浓度确定：若分级组分中含有深色条带，则需要更多树脂；条带较弱的组分所需树脂较少，因其蛋白含量较低。）
2. 用一柱体积的1×Tris缓冲盐水（TBS）（25 mM Tris，0.15 M NaCl，pH 7.2）（Thermo Scientific Pierce Protein Research Products）将树脂洗涤三次。
3. 向每个样品中加入200 μL 1×TBS。然后将样品加入抗TMT树脂（Thermo Scientific Pierce Protein Research Products）中，室温下振荡孵育2小时，随后在4 °C下轻摇过夜。
4. 将样品加入层析柱（Thermo Scientific Pierce Protein Research Products）中。
5. 用1×200 μL TBS对每根层析柱洗涤三次，随后用含0.05% CHAPs的1×TBS洗涤三次。
6. 再用含4 M尿素的1×TBS对层析柱洗涤三次。然后用200 μL H₂O洗涤层析柱三次。
7. 每个样品用200 μL 50%洗脱缓冲液（50%乙腈，0.4% TFA）洗脱三次。
8. 然后将样品在真空浓缩仪中干燥。

7. 质谱分析

1. 将样品重悬于12 μL含0.1%甲酸的3%乙腈中，并直接进样5 μL至Eksigent NanoLC-1D高压液相色谱柱（AB SCIEX，USA）。
2. 使用Proteopep II C18柱（75 μm内径 × 20 cm，New Objective，USA）分离肽段，采用4–60%梯度（A相：3%乙腈，0.1%甲酸；B相：97%乙腈，0.1%甲酸），流速为3 μL/min，运行时间为60 min。
3. 采用Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL质谱仪进行肽段检测，实验模式为top 2 x 3，即单次一级质谱（MS）扫描后，依次采集3次高能C阱解离（HCD）的二级质谱（MS/MS）和3次碰撞诱导解离（CID）的二级质谱，用于蛋白质鉴定。该模式下的参数设置如下：母离子隔离宽度：3.0 m/z；碰撞能量：50%（分两步，每步10%）；仅选择双电荷和三电荷肽段进行碎裂。动态排除参数设置为：重复计数 = 1；重复持续时间 = 60；排除列表大小 = 500；排除持续时间 = 28。目标值设置如下：MS = 5 e⁵；MS/MS（HCD）= 1 e⁵。离子传输时间设置为：FTMS为500，MS/MS（HCD）为300。HCD谱图需累积2次微扫描。

8. 数据库搜索与定量分析

1. 使用赛默飞世尔科技 Proteome Discoverer 软件 1.2（Thermo Scientific Pierce 蛋白质研究产品）对获得的 CID 和 HCD 数据进行分析，采用分支式工作流程，通过报告离子定量器（碎片离子质量容差为 20 ppm）来量化比值。另一分支通过谱图选择器、谱图归一化器和谱图分组节点对 MS² 谱图进行处理。
2. 随后将数据提交至 SEQUEST 搜索引擎进行检索，设定质量容差为 20 ppm。固定修饰设定为 cysTMT 试剂（304.18 Da），动态修饰包括磷酸化和甲硫氨酸氧化（15.99 Da）。在两种情况下均使用基于哈佛大学 RNA 数据构建的番茄（Solanum lycopersicum）自定义数据库（包含约 350,000 条序列）¹³。

9. 代表性结果

对照番茄植株叶片与接种Pseudomonas后的叶片代表性图像如图1所示。可观察到对照处理叶片与Pseudomonas处理叶片之间的差异。在叶片经DAB染色并去除叶绿素后，脱色过程使组织化学染色能够显示叶片组织中活性氧（ROS）的存在迹象（图2）。图2A代表未染色的对照叶片。图2B代表经Pseudomonas处理后显示H₂O₂生成阳性染色的叶片。差异性氧化还原调控蛋白的Proteome Discover数据分析结果示例如图3所示。该蛋白为已知的氧化还原调控蛋白ferredoxin-1¹⁴，已被证实参与抵御Pseudomonas syringae pv tomato¹⁵的过程。通过比较对照样本与接种样本的峰强度进行相对定量分析，结果显示ferredoxin-1的氧化还原调控发生显著变化（p< 0.05）。高强度峰表明该蛋白在病原菌处理后发生氧化。图4为Proteome Discover数据分析结果的另一个示例，显示某一蛋白在对照样本与接种样本之间具有相似的氧化还原调控模式。强度相近的峰提示存在二硫键，但其形成不受处理条件变化的调控。该方法将彻底改变科学家检测氧化还原响应性半胱氨酸及二硫键的方式¹⁰。

图1. 接种了对照溶液（A）和Pseudomonas（B）的番茄叶片代表性图像。

图2. 接种番茄叶片经对照溶液（A）和Pseudomonas（B）处理后的DAB染色代表性图像。叶片使用3'-3'二氨基联苯胺进行染色，通过在95%乙醇中煮沸去除叶绿素。深色染色表明H₂O₂的存在。仅接种细菌培养物的叶片出现深色染色。

图 3. 铁氧还蛋白-1 的蛋白质组学发现软件数据分析结果示例，该蛋白为差异性氧化还原调控蛋白¹⁴。各峰上方的峰强度用于绝对定量，对照样品与接种样品之间的峰强度用于相对定量。

图 4. 蛋白质组学发现数据分析输出示例，显示某一蛋白质在对照样本与接种样本之间具有相似的峰强度。峰强度相似表明存在二硫键，且该二硫键不受处理条件变化的调控。

讨论

本方案提供了进行DAB染色以及cysTMT标记的氧化还原半胱氨酸定量的方法。这些技术在研究接种Solanum lycopersicum与Pseudomonas syringae后活性氧（ROS）的产生及其对蛋白质调控的影响方面具有重要意义。本方案所述方法能够以对叶片组织造成最小损伤的方式，检测整片叶片样本中的ROS。标记步骤通过半胱氨酸标记技术，可用于分析可能受氧化还原调控的蛋白质，对于研究胁迫响应的早期阶段尤为有益。

同位素编码亲和标签（ICAT）和cysTMT等方法可用于检测生物样品中潜在的氧化还原调控蛋白。ICAT技术可实现对两个样品的标记与比较¹²。这两种方法均可标记游离的半胱氨酸残基，并用于蛋白质定量^10,12。然而，cysTMT方法能够降低实验变异性，并支持多重检测¹⁰。可用标签的数量使研究人员能够在实验设计中纳入重复样本或多组样品。增加样本数量有助于提高被鉴定蛋白质的总数。cysTMT技术的一个主要缺点是，由于对cysTMT标记肽段进行选择性富集的步骤（6.5–6.6），会降低蛋白质鉴定的整体质量。用于蛋白质鉴定的肽段数量在很大程度上取决于蛋白质序列中半胱氨酸残基的数量。该问题可通过在富集前将部分胰蛋白酶消化的样品直接用于质谱进行蛋白质鉴定来克服。

由于实验设计的性质以及cysTMT方法所采用的标记机制，某些步骤至关重要。在进行蛋白质沉淀和沉淀物洗涤（3.9）时，必须将样品保持在冰上低温环境中，以减少蛋白质降解。在cysTMT标记过程中，去除还原试剂（4.6）十分关键，因为样品可能发生逆向标记；如果样品中残留还原试剂，则可能发生逆向标记。若样品在标记后再次被还原，cysTMT标签可能被移除。一旦将标签加入样品，必须检测pH值（4.7），以确保获得最佳的标记效率。此外，数据分析取决于研究人员的具体需求以及使用该实验方案的最终目标，同时也依赖于所使用的软件，因为不同软件具有不同的算法。

本实验利用病原体作为激发子，以增强番茄中活性氧物质的产生；然而，其他受氧化还原调控的反应也可相应地进行测定。该实验设计可适用于其他植物和动物系统。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
MetroMix 500	BWI 公司	TX-500
3,3'-二氨基联苯胺	Sigma-Aldrich	D8001
ReadyPrep 顺序提取试剂盒 试剂3	伯乐生命医学产品有限公司	163-2104
CB-X 蛋白检测试剂	Geno Technology 公司	786-12x
cysTMT 试剂	赛默飞世尔科技 Pierce 蛋白研究产品	90071
Laemmli 样品缓冲液	伯乐生命医学产品有限公司	161-0737
Bio-Safe 考马斯亮蓝染色液（G-250 染色剂）	伯乐生命医学产品有限公司	161-0786
Microcon 3KD 离心柱	默克密理博公司	42403
固定化抗 TMT 树脂	赛默飞世尔科技 Pierce 蛋白研究产品	90076
离心柱	赛默飞世尔科技 Pierce 蛋白研究产品	89896
Proteopep II C18 柱	New Objective 公司	PFC7515-PP2-10
NanoLC-1D 高效液相色谱仪	AB Sciex 公司	90389
LTQ Orbitrap XL 质谱仪	赛默飞世尔科技有限公司	0020137580
SpeedVac 真空离心浓缩仪	Labconco 公司	7812013
Proteome Discoverer 1.2 软件	赛默飞世尔科技 Pierce 蛋白研究产品
胰蛋白酶	普洛麦格公司	V5111
橡树岭离心管	赛默飞世尔科技 Nalgene 公司	3139-0050
微量离心管（2 ml）	USA Scientific 公司	1620-2700
12% Mini-PROTEAN TGX 预制胶	伯乐生命医学产品有限公司	456-1043
顶部表单 >Bio-Safe 考马斯亮蓝染色液底部表单	伯乐生命医学产品有限公司	161-0786
TMT 富集试剂盒	赛默飞世尔科技 Pierce 蛋白研究产品	90077