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斑马鱼胚胎感染细胞内细菌病原体

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DOI：

10.3791/3781

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2012年3月15日

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1Department of Molecular Cell Biology, Institute of Biology, Leiden University, 2Department of Medical Microbiology and Infection Control, VU University Medical Center, 3Australian Regenerative Medicine Institute, Monash University

本文内容

摘要

透明的斑马鱼胚胎已被证明是研究先天免疫细胞与胞内细菌病原体（如Salmonella typhimurium和Mycobacterium marinum）相互作用的有用模型宿主，可用于可视化观察并进行功能研究。细菌的显微注射以及多色荧光成像是在斑马鱼胚胎感染模型应用中所涉及的关键技术。

摘要

斑马鱼（斑马鱼胚胎作为研究脊椎动物先天免疫系统在宿主-病原体相互作用中功能的模型正日益受到重视 1先天免疫系统的主要细胞类型——巨噬细胞和中性粒细胞——在胚胎发育的最初几天内形成，早于适应性免疫应答所需的淋巴细胞的成熟。斑马鱼模型具有多种优势：易于获取大量胚胎，胚胎体外发育便于操作，胚胎和幼体阶段具有良好的光学透明性，拥有丰富的遗传工具、大量的突变体资源以及多种转基因报告品系，这些特点共同提升了该模型的广泛应用价值。 鼠伤寒沙门氏菌 血清型鼠伤寒沙门氏菌 （S. typhimurium） 和 Mycobacterium marinum 可存在于巨噬细胞内，并常用于研究斑马鱼胚胎中的宿主-病原体相互作用。这两种细菌病原体的感染过程值得比较，因为 S. typhimurium 感染在一天内即表现为急性且致死性，而 M. marinum 感染为慢性，可成像至幼虫阶段 2, 3胚胎内细菌显微注射位点图1）决定了感染是会迅速发展为全身性感染，还是最初仍局限于局部。可通过显微注射将细菌直接注入血液循环，以建立快速的全身性感染，注射部位可选择尾静脉后部的尾部血岛或卵黄囊上连接心脏与躯干血管系统的库维氏管（Duct of Cuvier）。在受精后1天（1 dpf）时，胚胎已具有吞噬活性的巨噬细胞，但中性粒细胞尚未成熟，此时优先选择注入血岛。而在受精后2–3天（2–3 dpf）时，胚胎已发育出具有功能（可产生髓过氧化物酶）的中性粒细胞，此时更推荐将细菌注入库维氏管作为注射位点。为了研究髓系细胞向局部感染部位的定向迁移，可将细菌注射至尾肌、耳囊或后脑室 4-6此外，脊索这一结构通常似乎难以被髓系细胞接触，但极易受到局部感染 7对于高通量应用，一种有效的替代方法是在受精后的最初几小时内将细菌注射到胚胎的卵黄中 8结合荧光标记的细菌与表达荧光蛋白的转基因斑马鱼品系（如标记巨噬细胞或中性粒细胞），可为宿主-病原体相互作用的多色成像提供理想条件。本视频文章将详细描述通过静脉注射和局部接种方式对斑马鱼胚胎进行感染的实验方案。 S. typhimurium 或 M. marinum 细菌以及随后对先天免疫系统细胞相互作用的荧光成像。

方案

1. 准备注射针

  1. 使用微移液管拉制仪（Sutter Instruments Inc.，Flaming/Brown p-97，长尖端设置参数：气压 400；加热 610；拉力 40；速度 50；时间 30；短尖端设置参数：气压 500；加热 510；拉力 100；速度 200；时间 60）制备硼硅酸盐玻璃微量注射毛细管针（Harvard Apparatus，300038，外径 1 mm × 内径 0.78 mm）。
  2. 用精细镊子折断针尖，使尖端开口直径达到 5–10 μm。建议使用微型研磨仪（Narishige Inc.，EG-400）将针尖开口以 45 度角进行斜面打磨，以获得更锐利的尖端。这有助于刺穿表皮层，从而实现比钝头针更可重复且组织损伤更小的注射。长尖端针头更适合尾静脉（步骤 5）和居维叶管（步骤 6.1）注射，而短尖端针头则更适合其他注射方案（步骤 6.2–6.6）。

2. 准备 S. typhimurium 接种物

  1. 从 -80 °C 甘油菌种中将 S. typhimurium 划线接种至 LB 琼脂平板（含适当抗生素以筛选荧光表达载体），于 37 °C 培养过夜。
  2. 挑取单个荧光阳性菌落，用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）重悬至所需浓度（参见方案 5 和 6），可选择性加入 0.085% (v/v) 酚红（Sigma-Aldrich），以辅助观察注射过程。直接使用新鲜菌悬液进行注射，或制备甘油菌种。如需制备甘油菌种，将新制备的菌悬液（含所需细菌浓度）离心，沉淀用起始体积一半的无菌 PBS 中含 20% (v/v) 甘油（Sigma-Aldrich）的溶液重悬，混匀后于 -80 °C 保存。注射前，将甘油菌种用无菌 PBS 按 1:1 (v/v) 稀释，可选择性加入 0.17% 酚红。
  3. 充分涡旋振荡菌悬液，避免结团。
  4. 使用微量移液吸头（Eppendorf, 5242956.003）将接种物吸入显微毛细玻璃针中。
  5. 由于 S. typhimurium 细菌体积相对较大，且在使用 pGMDs3 表达载体3（菌株可按需提供）时具有明亮的 Ds-RED 荧光，因此可通过荧光体视显微镜轻松计数单个细菌细胞，以确定注射剂量。具体操作：将 1 nL 菌液注射至琼脂平板上的 PBS 液滴中，计数荧光细菌数量，并计算获得所需细菌剂量所需的注射体积（建议注射体积控制在 1–2 nL 之间）。通过选定途径对胚胎进行 S. typhimurium 注射（参见方案 5 和 6）。

3. 准备M. marinum接种物

  1. 将 M. marinum 菌株培养于添加了10% 油酸-白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶（OADC，BD and company）、0.5% 甘油以及适当抗生素（用于筛选荧光表达载体，菌株可按需索取9）的 Difco Middlebrook 7H10 琼脂（BD and company）上，以确保始终拥有新鲜的菌种储备。
  2. 挑取一个 M. marinum 菌落，重悬于添加了10% 白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶（ADC，BD and company）、0.05% Tween 80（Sigma-Aldrich）以及适当抗生素的 Difco Middlebrook 7H9 液体培养基（BD and company）中。检测其在600 nm处的光密度（OD）为0.2–0.3，并于28.5 °C静置培养过夜。M. marinum 的世代时间约为4–6小时，具体因菌株而异。
  3. 在注射当日再次测定600 nm处的光密度（OD）。OD600为1时相当于约108 M. marinum/mL（该数值可能因所用菌株不同而有所变化，因此应依据特定菌株的生长曲线确定）。
  4. 在细菌处于对数生长期时收集菌体（OD600不得超过1.00），通过离心并用无菌PBS洗涤三次。
  5. 再次测定PBS中细菌悬液的OD600，离心后重悬于PBS或含2% 聚乙烯吡咯烷酮（PVP40，w/v）的PBS中，以达到所需浓度（参见方案5和6）。添加PVP40可提高细菌悬液的均一性。可加入酚红（Sigma-Aldrich）至终浓度0.085%，以辅助观察注射过程。新鲜制备的悬液应立即用于注射，或用于制备甘油保存菌种。制备甘油保存菌种时，将新鲜制备的含所需浓度细菌的注射用菌液离心，然后将菌体沉淀重悬于初始体积一半的无菌含20%甘油的PBS中，以浓缩菌液。将甘油保存菌种储存于-80 °C。使用时，将甘油保存菌种以1:1（v/v）比例稀释于无菌PBS中，可选择性地加入4% PVP40和/或0.17%酚红。

4. 准备斑马鱼胚胎用于显微注射

  1. 设置斑马鱼繁殖配对，并按照另一篇视频文章中所示方法收集胚胎10。将胚胎置于盛有卵水（60 μg/mL 海盐；约 60 枚胚胎/皿）的培养皿中，在 28.5 °C 条件下培养。
  2. 如需抑制黑色素形成，可在胚胎发育至约 12 hpf 时，在卵水中加入 0.003% N-苯硫脲（PTU，Sigma-Aldrich）。
  3. 受精后约 24 小时（hpf），使用精细镊子（Fine Science Tools Inc.，Dumont #5 镊子 - Inox Biology）去除胚胎的绒毛膜。
  4. 将胚胎置于底部铺有一层 1% 琼脂糖的培养皿中，并加入卵水，以防止胚胎粘附于塑料表面。
  5. 在注射前约 10 分钟，使用 200 μg/mL 缓冲的 3-氨基苯甲酸（Tricaine，Sigma-Aldrich）对胚胎进行麻醉处理。

5. 向一日龄胚胎静脉注射细菌

  1. 在28 hpf时对胚胎进行分期 11 通过检查血液循环是否稳定、眼部色素沉着是否开始、尾部是否伸直，以及心脏是否位于眼部腹侧来判断。
  2. 麻醉胚胎，参见步骤 4.5。
  3. 使用微量加样器吸头将细菌接种物吸入针头中。
  4. 将装有样品的注射针安装到与支架（World Precision Instruments，M10L 磁性支架）相连的显微操作器（Sutter Instrument，MM-33）上，并置于体视显微镜（Leica M50，消色差 1× 物镜，0.15 NA，透射光源底座 TL ST）下。设定注射时间为 0.2 秒，补偿压力为 15 hPa（Eppendorf，Femtojet）。调节注射压力在 700 至 900 hPa 之间，以获得适用于所用注射针的正确注射体积。借助载玻片或目镜中的标尺，调节液滴大小至目标直径。可通过将液滴注入载玻片上的矿物油中测定其大小，或通过向空气中注射并观察悬挂在针尖的液滴来估算大小。1 nL 液滴的半径为 0.062 mm（V = 4/3 π r³）3).
  5. 在注射前，将装有针头的显微操作仪置于正确位置（即大约位于 45° 相对于注射板表面的角度），仅前后移动进行注射。
  6. 将麻醉后的胚胎用移液器转移至平整的1%琼脂糖注射板上，去除多余的卵水，利用表面张力使胚胎在注射过程中保持固定位置。使用毛发环工具（图2用注射板排列胚胎。注射过程中用手调整注射板的方向，使胚胎处于便于插入针头的最佳位置，即让胚胎的尾部朝向针尖。
  7. 将针尖置于靠近泌尿生殖孔的尾静脉正上方图1A），用针尖刺破周皮并注入所需剂量的细菌；我们使用约 250 cfu 的 S. typhimurium 野生型（wt）菌株 SL1027，含有 Ds-RED 表达载体 pGMDs3，以及约 120 个菌落形成单位（cfu）的 M. marinum 菌株 Mma20。注射的细菌悬液将随血流经尾静脉流向心脏。注射后立即观察脉搏后血管系统的容积是否扩张，以判断注射是否成功。 2对于剂量-反应实验，可在不拔出针头的情况下进行2-3次连续注射。
  8. 实验过程中需频繁检查注射体积是否保持一致。为确保整个实验过程中注射的一致性，每注射约30次后，将一滴细菌直接注入细菌生长培养基上的无菌PBS液滴中作为对照。th 胚胎注射。将该液滴涂布于平板，经培养后计数细菌菌落，以确定注射体积中的菌落形成单位（cfu）。
  9. 使用荧光体视显微镜（方案7）观察单个荧光 S. typhimurium 注射后立即在血液循环中的细胞，弃去未正确注射的胚胎。单个荧光 M. marinum 注射后无法通过体视荧光显微镜直接观察到细菌，但感染细胞的荧光聚集体应在感染后2天（dpi）可见，并随时间推移逐渐增大。

6. 感染的其他途径

  1. 库维管注射：将已麻醉的胚胎（2-3 dpf）排列在平坦的1%琼脂糖注射板上，排列方式与尾静脉注射相同（参见5.6）。在注射过程中手动调整注射板方向，使胚胎处于便于插入针头的最佳位置，即以约45°对角线方向放置，从而使针尖从胚胎背侧进入库维管（图1B）。将针头插入库维管起始处，位置位于该导管在卵黄囊上方开始扩张区域的稍背侧，注入100-200个细菌（1-3 nL）。若注射后导管内体积立即扩张且卵黄囊未破裂，则表明注射正确。与尾静脉注射类似（参见5.7），可在不拔出针头的情况下连续进行多次注射。
  2. 后脑室注射：将已麻醉的胚胎（32 hpf）排列在平坦的1%琼脂糖注射板上，使胚胎背侧朝向针尖。从前方位置将针头插入后脑室，避免接触神经上皮（图1C），并注入20-100个细菌（0.5-1 nL）。为练习该操作，可使用荧光染料（如Texas-Red Dextran），方法见另一视频文章13。
  3. 尾肌注射：将已麻醉的胚胎（1-2 dpf）按尾静脉注射的方式排列（参见5.6）。调节装有菌液的显微操作仪，使针头与注射板表面成约65°角。将含有20-50个菌落形成单位（cfu）的细菌悬液（0.5-1 nL）注入尿殖孔上方的肌肉中（图1D），注意避免损伤脊索或血管。
  4. 听囊注射：将已麻醉的胚胎（2-3 dpf）按尾静脉注射的方式排列（参见5.6）。调节装有菌液的显微操作仪，使针头与注射板表面成约65°角。以较低压力将约20个细菌（0.5 nL）注入听囊（图1E），以避免局部组织破裂。
  5. 脊索注射：将已麻醉的胚胎（1-2 dpf）排列在平坦的1%琼脂糖注射板上，使胚胎尾部背离针尖方向。将针头穿过尾部肌肉组织插入脊索（图1F），并注入约20-50个细菌（最多0.5 nL）。注意注射体积不宜过大，以防脊索破裂。
  6. 卵黄注射：将处于16至1000细胞阶段的胚胎卵置于带有矩形或V形通道的1%琼脂糖注射板上，通道可通过通道模具12制备，或参考在线资源 http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt5/5.1.html。将针头刺穿绒毛膜进入卵黄中心（图1G），并注入20-40个细菌（1-2 nL）。使用2% PVP40作为细菌悬液的载体溶液（参见步骤3.5）至关重要，可防止细菌过早扩散至胚胎内部。

7. 感染的立体成像

  1. 将感染的胚胎置于含有三卡因（Tricaine）的卵水中，在底部铺有1%琼脂糖的培养皿中进行麻醉（参见4.5）。
  2. 使用毛发环工具在荧光体视显微镜下将胚胎调整至正确的成像位置（图2）。在鳔充气之前（1–5 dpf），胚胎会自然侧卧，便于进行侧向观察成像。
  3. 若需要不同于侧向视图的成像位置，可将胚胎固定于1.5%甲基纤维素中，并使用毛发环工具调整胚胎至所需位置（图2）。
  4. 成像完成后，将胚胎放回卵水中。

8. 感染的共聚焦成像

  1. 若使用倒置共聚焦显微镜，将一滴低熔点琼脂糖（Lonza Inc.，1.5% (w/v)，溶于卵水）置于WillCo-dish（WillCo Wells, GWSt-5040）的玻璃底部；若使用正置共聚焦显微镜，则将其置于单腔凹面载玻片（Agar Scientific, L4090）上。
  2. 将麻醉后的胚胎连同少量卵水放入琼脂糖液滴中，并使用毛发环工具调整胚胎位置（图2）。使用倒置显微镜时，需确保胚胎的兴趣区域紧贴成像培养皿的玻璃底面。若使用正置显微镜，可配合水浸物镜或长工作距离干式物镜，应将胚胎调整至兴趣区域尽可能靠近物镜的位置。
  3. 待琼脂糖凝固后，将含三卡因的卵水（见4.5）覆盖于琼脂糖液滴上。若使用正置显微镜，需在凹面腔室上方加盖盖玻片（避免产生气泡）。
  4. 依次采集荧光图像和透射图像。
  5. 如需将胚胎用于后续实验，可用精细镊子小心去除胚胎周围的琼脂糖，并将胚胎放回卵水中。

9. 代表性结果

在受精后1天（1 dpf）将Salmonella typhimurium或Mycobacterium marinum细菌注射至胚胎的血岛区域，可迅速引发巨噬细胞的吞噬作用。mpeg1基因最近被确认为胚胎巨噬细胞的可靠标志物，其表达与已确立的巨噬细胞标志物csf1r（fms）共定位，且不与中性粒细胞标志物如mpx（mpo）和lyz重叠4, 14。为了对细菌吞噬过程进行活体成像，我们使用了转基因品系，其中mpeg1启动子驱动巨噬细胞中荧光蛋白的表达14。这些转基因品系中，mpeg1启动子或直接与gfp基因融合，或采用双组分系统，即mpeg1启动子驱动酵母Gal4转录因子的表达，后者激活含有Gal4识别序列（UAS，上游激活序列）与kaede基因融合的第二转基因。当正确执行血岛注射（方案5；图1A）时，细菌会立即随血液循环分布至整个胚胎。相对较大且荧光强烈的Ds-RED标记的S. typhimurium细菌可直接通过体视荧光显微镜进行成像（图3A），而在感染后2小时（2 hpi）进行共聚焦成像显示，大量细菌已被荧光标记的巨噬细胞吞噬（图3B-C）。即使仅注射25 cfu的野生型S. typhimurium细菌也会导致致死性感染，而同等剂量的无毒株细菌（如Ra株）则可被胚胎免疫系统清除3。在斑马鱼胚胎中，采用250 cfu的注射剂量可检测到对S. typhimurium感染的转录响应，并证实可诱导强烈的促炎性基因表达反应15。相比之下，静脉注射M. marinum细菌不会引发显著的促炎反应，但会导致持续性感染，其中被感染的巨噬细胞形成紧密的聚集体，被认为是结核病特征性肉芽肿的早期阶段2。在Tg(mpeg1:EGFP)gl22品系14中，感染后5天（5 dpi）对类肉芽肿聚集体进行共聚焦成像，显示mCherry标记的M. marinum细菌在绿色荧光巨噬细胞内发生胞内增殖（图3D-E）。

其他感染途径适用于不同的研究目的。可在32小时（hpf）时将细菌注射到后脑室（图1C），该区域缺乏巨噬细胞。向此区域注射20–100个mCherry标记的M. marinum细菌，可迅速引发巨噬细胞浸润并吞噬细菌（图4A）。另一种研究先天免疫细胞定向迁移的方法是将细菌注射至尾部肌肉（图1D）。然而，尾肌注射本身会造成组织损伤，从而引起一定程度的白细胞趋化。若将少量液体（0.5–1 nL）小心地注射至耳囊（图1E），则可避免此类损伤反应。如使用Tg(mpx:EGFP)i114品系16所示，向耳囊注射约20个S. typhimurium菌落形成单位（cfu），可在感染后3小时（hpi）观察到中性粒细胞的趋化（图4D），而磷酸盐缓冲液（PBS）对照注射则未见此反应（图4E）。脊索似乎对白细胞浸润具有抵抗性，是某些在其他组织中严重减毒的M. marinum突变株的适宜生长环境7（图4F）。最后，早期将M. marinum注射至胚胎卵黄中，可作为实现系统性感染的替代方法。我们通常在16细胞期左右进行此类注射（图1G），但也可在更晚阶段（直至1000细胞期）或更早阶段（1–8细胞期，用于与吗啉代寡核苷酸共注射）进行8。在卵黄中注射20–40 cfu剂量的M. marinum后，细菌在数天内扩散至胚胎组织，并形成类似传统静脉注射方法所观察到的类肉芽肿样聚集体8（图4G）。该卵黄注射方法不适用于S. typhimurium感染，因其在卵黄中快速增殖会导致早期死亡。对于M. marinum感染，卵黄注射法适用于高通量应用，因其可通过注射机器人实现自动化8。

斑马鱼胚胎发育阶段示意图；显微镜图像显示生长阶段和结构。
图1. 用于建立斑马鱼胚胎全身性或局部感染的注射方法概述。（A-B）静脉注射用于建立快速的全身性感染，可在受精后1天（1 dpf）时注射至尾静脉的后部血岛区域（A），或在2-3 dpf时注射至库维氏管（B）。（C-E）局部注射用于研究巨噬细胞和中性粒细胞的趋化性，可在1 dpf时注射至后脑室（C），在1-2 dpf时注射至尾部肌肉（D），或在2-3 dpf时注射至耳囊（E）。（F）为建立吞噬细胞难以接近的感染，可在1-2 dpf时向脊索内注射。（G）为利用生长缓慢的细菌（如M. marinum）建立早期全身性感染，可在16-1000细胞期时向卵黄内注射。所有图像均使用Leica M165C显微镜（PLANAPO 1.0x物镜）连接Leica DFC420相机（Leica 10446307 0.8x）拍摄。

电纺丝针头装置；聚合物纤维制备、纳米纤维合成方法、设备示意图。
图 2. 毛发环工具。将一段人类毛发以环状插入巴斯德移液管的开口中，并用强力胶或修正液固定。该工具可用于轻柔地操作脆弱的斑马鱼胚胎。

Zebrafish embryo microscopy, fluorescent staining, developmental biology, cellular distribution, images.
图3. 红色荧光的静脉注射 Salmonella typhimurium 和 Mycobacterium marinum. Ds-RED标记的 S. typhimurium SL1027 细菌（A-C）和 mCherry 标记 M. marinum Mma20 细菌（D-E）被注射到血岛中 Tg(mpeg1:Gal4-VP16)gl24;Tg(UAS-E1b:Kaede)s1999t （A-C）或 Tg(mpeg1:EGFP)gl22 （D-E）28小时孵育的斑马鱼胚胎。（A）立体荧光与明场叠加图像，显示扩散情况 S. typhimurium 在感染后2小时的血液循环中（使用Leica MZ16FA显微镜与Leica DFC420C相机）。(B-C) 显示红色的共聚焦z轴层扫投影 S. typhimurium 绿色巨噬细胞在感染2小时时吞噬的细菌（Leica TCS SPE，HCX APO 40倍 0.8 NA物镜）。仍处于细胞外的细菌也可观察到。（D）共聚焦z轴层扫投影显示类肉芽肿样聚集体 M. marinum Mma20感染与未感染的巨噬细胞在5 dpi时的共聚焦图像（Leica TCS SPE，HCX APO 40x 0.8 NA）。巨噬细胞显示为绿色，细菌为红色。（E）单个巨噬细胞（绿色）及其胞内细菌的共聚焦z轴层叠投影图像 M. marinum 细菌（红色）。D图中白色矩形框所示区域使用更高放大倍数的物镜成像（Leica TCS SPE，HCX PL APO 63x 1.2 NA）。比例尺： 20 μm.

斑马鱼胚胎显微观察；荧光显微镜，蛋白表达分析，细胞成像。
图4. 斑马鱼胚胎感染的替代途径。 （A）将表达mCherry标记的 M. marinum Mma20细菌注射至32小时受精后（hpf）的斑马鱼胚胎后脑室中。荧光与透射光叠加图像显示，在感染后5小时（hpi），巨噬细胞吞噬了mCherry标记的细菌（Leica TCS SPE，HCX PL FLUO TAR 40.0× 0.7 NA）。（B）在1天受精后（dpf）将S. typhimurium注射至尾部肌肉中。通过荧光原位杂交技术4显示，在感染后3小时（hpi），髓系细胞被募集至注射部位（白色圆圈）；（C）而在未注射的胚胎中，该形态学位置通常不存在髓系细胞。尽管此阶段的胚胎尚无成熟中性粒细胞，但可区分出两类髓系细胞：一类表达巨噬细胞标志物mfap4（红色），另一类表达中性粒细胞标志物mpx（绿色）（Leica TCS SPE，HC PL FLUOTAR 10.0× 0.3 NA）。细菌的荧光信号在原位杂交处理后消失。（D）将Ds-RED标记的S. typhimurium细菌注射至2天受精后（dpf）的Tg(mpx:EGFP)i114斑马鱼胚胎的耳囊中。立体荧光与明场图像叠加结果显示，在感染后3小时（hpi），mpx:EGFP标记的中性粒细胞被募集至受感染的耳囊（虚线椭圆）；（E）而在对照组中，向Tg(mpx:EGFP)i114斑马鱼胚胎耳囊注射PBS后，并未观察到中性粒细胞向未感染耳囊（虚线椭圆）的募集（Leica MZ16FA显微镜配Leica DFC420C相机）。（F）将mCherry标记的M. marinum E11 eccCb1::tn减毒突变株17细菌注射至1天受精后（dpf）的斑马鱼胚胎脊索中。在感染后5天（dpi）观察细菌在脊索内的增殖情况（Leica MZ16FA显微镜配DC500相机）。（G）将mCherry标记的M. marinum E11细菌注射至处于16细胞期的Tg(fli1a:EGFP)斑马鱼胚胎卵黄中，该转基因品系在血管和淋巴管的内皮细胞中表达gfp。在感染后5天（dpi）可观察到尾部区域形成类似肉芽肿的感染细胞聚集体（Leica MZ16FA显微镜配Leica DFC420C相机；图像引自8）。

讨论

本文所述的感染方法常用于研究宿主先天免疫基因或细菌毒力基因的功能1。静脉显微注射法（方案5和6.1）是此类研究中最常用的方法。对于1日龄胚胎，最便于进行静脉注射的部位是尾部静脉后部的血岛区域。随着胚胎发育，尾静脉在后期更难穿刺，因此我们更倾向于选择2-3天龄胚胎的库维氏管（Duct of Cuvier）作为静脉注射位点。在所有情况下，关键是要向胚胎注射数量一致的细菌，应通过将注射接种物涂布于平板并进行菌落形成单位（cfu）计数来验证细菌数量。为实现可重复的注射操作，需考虑以下几点：首先，必须使用高质量的玻璃毛细注射针。若针尖过粗，注射会造成较大的穿刺孔，导致出血，且注入的细菌会从血液循环中漏出。其次，细菌必须直接注入血液循环中。若针尖未进入静脉，或注射液扩散至卵黄囊延伸区，则该胚胎必须从实验中剔除。第三，使用PVP40作为注射M. marinum的载体有助于防止细菌在玻璃针内沉降。PVP40可提高悬浮液的均一性，从而在整个注射过程中获得更可重复的接种量。PVP40也可用于S. typhimurium的注射，但在此情况下重要性较低，因为该细菌体积较大且具有明亮的荧光，可在实验过程中通过肉眼观察来监控注射接种量。为练习注射技术，我们推荐使用酚红染料（1% v/v）或不同颜色的1 μm荧光微球（Invitrogen）。一旦掌握该技术，完成50-100个胚胎的注射约需30分钟，包括在琼脂糖平板上排列胚胎以及调整细菌注射体积所需的时间。

尽管向血岛（方案5）或柯氏管（方案6.1）进行静脉注射是最常用的方法，但本视频文章中描述的替代感染途径已被证明在研究巨噬细胞和中性粒细胞趋化性（方案6.2、6.3和6.4）、研究减毒细菌株的生长（方案6.5）以及将斑马鱼感染模型应用于高通量实验（方案6.6）方面具有实用价值4-8。文中所述的显微注射方法也可用于病毒18, 19、真菌孢子14, 20或原生动物寄生虫的注射（Maria Forlenza，个人交流）。本视频文章所述注射方法的一个有益补充是近期报道的一种将细菌皮下注射至斑马鱼胚胎的技术21。该技术已被用于研究中性粒细胞对细菌的吞噬作用，研究发现中性粒细胞能够高效吞噬组织表面的细菌，但与巨噬细胞不同的是，当中性粒细胞被注射至血液或充满液体的体腔时，几乎无法吞噬细菌。进行皮下注射时，胚胎的摆放方式与本视频文章中所述尾肌注射相似，但注射针头需插入皮肤下方，将细菌注入体节区域。

需要认识到，显微注射本质上是一种人工感染途径。然而，早期胚胎对外部细菌病原体的暴露具有高度抗性。事实上，将胚胎浸泡于细菌悬液中的浸染实验在我们操作中无法获得可重复的结果22。尽管部分胚胎在浸染后可能被感染，但我们观察到此类实验中个体胚胎间的死亡率以及炎症标志基因表达存在较大差异。本文所描述的显微注射方法能够实现可重复的感染，特别适用于研究细菌与宿主先天免疫细胞之间的相互作用。一种有效量化单个胚胎内细菌感染水平的方法是使用定制的专用像素定量软件分析感染胚胎的荧光图像17, 23。该方法已被证明与感染胚胎涂板后菌落形成单位（cfu）计数结果具有良好的相关性。类似地，在转基因白细胞荧光报告品系中，可通过数字图像分析量化每个胚胎中白细胞数量的相对变化；该方法可用于评估宿主对感染所引发的白细胞生成反应24。

宿主先天免疫基因的功能可以被高效地研究 体内 通过将所述感染模型与吗啉代敲降技术相结合。吗啉代是一类合成的反义寡核苷酸，可靶向特定RNA，在注入单细胞期斑马鱼胚胎后可降低基因产物的表达，如本期刊其他视频文章所示。 10, 25 在吗啉代寡核苷酸敲低研究中，所有待比较的胚胎组在进行细菌注射前必须准确判定发育阶段。这一点尤为重要，因为胚胎的免疫系统处于发育过程中，其免疫能力会随着时间推移而逐渐增强。

目前已有多种转基因报告基因品系可用于区分斑马鱼胚胎中的主要天然免疫细胞亚群——巨噬细胞和中性粒细胞。mpx 和 lyz 启动子已被用于构建中性粒细胞报告基因品系16, 26, 27，而 csf1r（fms）和 mpeg1 启动子则被用于构建巨噬细胞特异性报告基因品系14, 28。尽管 csf1r（fms）在黄色素细胞中也有表达，mpeg1 的表达则专一局限于巨噬细胞。如本视频文章所示，近年来开发的 mpeg1 报告基因品系在成像巨噬细胞对细菌的吞噬作用方面具有很高的应用价值。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者谨此感谢 Chao Cui、Floor de Kort、Esther Stoop 和 Ralph Carvalho 为图4提供图片，感谢 Ulrike Nehrdich 和 Davy de Witt 提供鱼类饲养支持，并感谢实验室其他成员的有益讨论。本工作由荷兰经济事务部与教育、文化和科学部的 Smart Mix 计划、欧洲委员会第七框架项目 ZF-HEALTH（HEALTH-F4-2010-242048）、欧洲玛丽·居里初始培训网络 FishForPharma（PITN-GA-2011-289209）以及澳大利亚国家健康与医学研究委员会（NHMRC，项目号637394）资助。澳大利亚再生医学研究所得到了维多利亚州政府和澳大利亚政府资助项目的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
酚红Sigma-AldrichP0290
甘油Sigma-Aldrich228210
Difco Middlebrook 7H10 琼脂BD Biosciences262710
BBL Middlebrook OADC 增菌剂BD Biosciences211886
Difco Middlebrook 7H9 肉汤BD Biosciences271310
BBL Middlebrook ADC 增菌剂BD Biosciences211887
吐温 80Sigma-AldrichP1754
聚乙烯吡咯烷酮 (PVP40)Calbiochem529504
N-苯硫脲 (PTU)Sigma-AldrichP7629
3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐 (Tricaine)Sigma-AldrichA5040
甲基纤维素Sigma-AldrichM0387
SeaPlaque 琼脂糖（低熔点琼脂糖）Lonza Inc.50100
FluoSpheres（1.0 μm，红色荧光 (580/605)）InvitrogenF8821
FluoSpheres（1.0 μm，黄绿色荧光 (505/515)）InvitrogenF8823

参考文献

  1. Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Curr. Drug Targets. 12, 1000-1017 (2011).
  2. Davis, J. M. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17, 693-702 (2002).
  3. vander Sar, A. M. Zebrafish embryos as a model host for the real time analysis of Salmonella typhimurium infections. Cell Microbiol. 5, 601-611 (2003).
  4. Zakrzewska, A. Macrophage-specific gene functions in Spi1-directed innate immunity. Blood. 116, 1-11 (2010).
  5. Le Guyader, D. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111, 132-141 (2008).
  6. Herbomel, P., Thisse, B., Thisse, C. Ontogeny and behaviour of early macrophages in the zebrafish embryo. Development. 126, 3735-3745 (1999).
  7. Alibaud, L. A Mycobacterium marinum TesA mutant defective for major cell wall-associated lipids is highly attenuated in Dictyostelium discoideum and zebrafish embryos. Mol. Microbiol. 80, 919-934 (2011).
  8. Carvalho, R. A high-throughput screen for tuberculosis progression. PLoS One. 6, 16779-16779 (2011).
  9. van der Sar, A. M., Spaink, H. P., Zakrzewska, A., Bitter, W., Meijer, A. H. Specificity of the zebrafish host transcriptome response to acute and chronic mycobacterial infection and the role of innate and adaptive immune components. Mol. Immunol. 46, 2317-2332 (2009).
  10. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115-e1115 (2009).
  11. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
  12. Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio). , The University of Oregon Press. Eugene. (1993).
  13. Gutzman, J. H., Sive, H. Zebrafish Brain Ventricle Injection. J. Vis. Exp. (26), e1218-e1218 (2009).
  14. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117, 49-56 (2011).
  15. Stockhammer, O. W., Zakrzewska, A., Hegedus, Z., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Transcriptome profiling and functional analyses of the zebrafish embryonic innate immune response to Salmonella infection. J. Immunol. 182, 5641-5653 (2009).
  16. Renshaw, S. A. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108, 3976-3978 (2006).
  17. Stoop, E. J. Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component. Dis. Model Mech. 4, 526-536 (2011).
  18. Levraud, J. P. Identification of the zebrafish IFN receptor: implications for the origin of the vertebrate IFN system. Journal of Immunology. 178, 4385-4394 (2007).
  19. Levraud, J. P., Colucci-Guyon, E., Redd, M. J., Lutfalla, G., Herbomel, P. In vivo analysis of zebrafish innate immunity. Methods Mol. Biol. 415, 337-363 (2008).
  20. Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth. Eukaryot. Cell. 10, 932-944 (2011).
  21. Colucci-Guyon, E., Tinevez, J. Y., Renshaw, S. A., Herbomel, P. Strategies of professional phagocytes in vivo: unlike macrophages, neutrophils engulf only surface-associated microbes. J. Cell Sci. 124, 3053-3059 (2011).
  22. van Soest, J. J. Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda. BMC Immunology. 12, 58-58 (2011).
  23. Adams, K. N. Drug tolerance in replicating mycobacteria mediated by a macrophage-induced efflux mechanism. Cell. 145, 39-53 (2011).
  24. Ellett, F. L., Lieschke, G. J. Computational quantification of fluorescent leukocyte numbers in zebrafish embryos. Methods in Enzymology. , (2011).
  25. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113-e1113 (2009).
  26. Mathias, J. R. Resolution of inflammation by retrograde chemotaxis of neutrophils in transgenic zebrafish. J. Leukoc. Biol. 80, 1281-1288 (2006).
  27. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Dev. Biol. 7, 42-42 (2007).
  28. Gray, C. Simultaneous intravital imaging of macrophage and neutrophil behaviour during inflammation using a novel transgenic zebrafish. Thromb. Haemost. 105, 811-819 (2011).

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