在卵内 鸡胚视网膜电穿孔技术

摘要

本视频的总体目标是展示如何在汉普格尔和哈密尔顿22-23期（约胚胎发育第4天，E4）对鸡胚视网膜进行靶向视网膜注射以及in ovo电穿孔，将DNA/RNA构建体导入鸡胚视网膜。该技术对于研究鸡胚视网膜发育过程中的基因表达、基因调控及形态学变化非常有用。

摘要

鸡胚视网膜是研究高等脊椎动物视网膜发育的优良模型。由于其体积较大且为体外发育，利用重组DNA/RNA技术对鸡胚视网膜进行操作相对简便。将DNA/RNA构建体电穿孔导入鸡胚视网膜，可有效研究视网膜发育过程中视网膜干细胞/前体细胞的基因调控。通过电穿孔技术，可开展多种类型的实验，如报告基因检测、基因过表达、基因敲低（shRNA）等。本视频展示了在汉密尔顿-哈密尔顿分期22–23期（约胚胎发育第4天，E4）进行的靶向视网膜注射和in ovo电穿孔操作。我们介绍了一种快速、便捷的in ovo电穿孔技术：将表达绿色荧光蛋白（GFP）作为标记的质粒DNA直接注入鸡胚视网膜下腔，随后施加电脉冲，以促进视网膜干细胞/前体细胞对DNA的摄取。在E4阶段进行视网膜注射与电穿孔的新方法，能够可视化所有类型的视网膜细胞，包括晚期生成的神经元¹，而使用传统的E1.5期注射与电穿孔方法则难以实现这一点²。

方案

由于本方案的部分步骤已在其他 JoVE 视频²和论文³中略有修改地描述过，因此此处不再详细讨论。

1. 卵的处理与针头准备

1. 鸡蛋可在约13°C的酒柜中保存长达1周。若温度过高，胚胎将开始异常发育；而温度过低则会导致高死亡率。准备孵化时，将鸡蛋从酒柜中取出，并垂直放置，较大的一端朝上。在将鸡蛋放入37.5°C培养箱前，需在室温下静置至少2小时。
2. 将鸡蛋孵化96至100小时，约为胚胎发育第4天，以获得处于Hamburger和Hamilton第22期的胚胎^4-5。
3. 使用拉制的玻璃毛细管制备微移液针，并在解剖显微镜下用镊子折断针尖，使针尖开口直径约为0.1 μm，锥度为20 mm。针尖过大的针难以刺穿卵黄膜，而针尖过小的针则难以加载和输送DNA溶液。
4. 将针头连接至安装在显微操作仪上的0.1 ml Hamilton气密注射器。使用一小段Masterplex硅胶管连接针头与注射器。由于连接紧密，无需添加矿物油密封。
5. 在一块Parafilm上混合2 μl浓度为3–6 μg/μl的报告质粒DNA溶液与0.2 μl快绿染料（0.025%）。快绿染料有助于观察注射过程。缓慢地将混合液吸入针头中。
6. 为使卵黄膜与内层膜分离，轻轻将鸡蛋旋转约180°，静置数分钟后，再将其转回原始位置，并准备进行电穿孔。
7. 用70%乙醇擦拭镊子和蛋壳，以避免胚胎感染。
8. 使用AA号镊子在气室正上方的蛋壳上开一个小孔。注意不要使蛋壳破裂。逐块移除小片蛋壳以形成一个小窗口。使用镊子小心地去除内层膜，避免接触卵黄膜。

2. 注射与电穿孔

1. 为防止损伤脑部或心脏，应将针头置于进入眼球的主要血管束对侧，并朝向喙部方向。
2. 通过突然而轻柔地推动针头，穿透卵黄膜、巩膜、视网膜及玻璃体。若针头从眼球另一端穿出，只要未损伤任何主要静脉，通常无妨。
3. 缓慢将针头从切口边缘回拉，并使其几乎与眼球外壁相切。
4. 将针头插入巩膜与视网膜之间的视网膜下腔。
5. 注入DNA，直至可见绿色溶液充满眼球一侧，并因形成隆起而将视网膜向内推压。
6. 若针头位置不正确，您会观察到DNA溶液在玻璃体内扩散并填充眼球中央区域；此外，若视网膜损伤过大，则可见DNA溶液自眼球外溢。
7. 缓慢取出针头，立即将电极平行插入蛋内（电极需预先浸入PBS中），轻压电极使其浸入羊水中，确保注射侧眼球位于两电极之间。放置电极时应避免接触任何主要血管或心脏。负极应置于注射侧，以便DNA从视网膜下腔向正极方向迁移进入视网膜。以15V电压进行5次脉冲电穿孔，每次持续50 ms，脉冲间隔950 ms。
8. 小心移除电极，并用透明胶带封闭蛋壳上的开口。
9. 在将注射后的蛋放回孵育箱前，应标记编号并注明日期。通常整个电穿孔过程约需3至5分钟完成。
10. 电穿孔后最早可在8小时观察到GFP表达。然而，您也可等待胚胎发育至所需阶段后再进行取材。

3. 代表性结果

在本研究中，我们使用多种质粒构建体来研究参与视网膜细胞发育的基因表达调控。本视频中使用了pCAG-GFP（转染对照）以追踪注射和电穿孔是否成功。然而，任何带有报告基因（如GFP、RFP等）的质粒构建体均可使用。尽管在电穿孔后8小时即可观察到GFP表达，我们通常从第6天（E6）开始收集鸡胚并持续后续实验。电穿孔后的视网膜组织从胚胎中分离出来，在包埋和切片前先在荧光解剖显微镜下进行观察。通常情况下，一次成功的电穿孔后，至少可在视网膜的四分之一区域观察到报告基因的表达（图1）。转染的视网膜组织进一步通过切片处理，以便清晰观察细胞形态。利用细胞类型特异性标记物（如Brn3a、Pax6等）进行免疫组织化学染色，可对细胞特异性的GFP表达进行表征（图2）。

图1. 报告质粒成功电转染导致GFP阳性表达。鸡胚视网膜在胚胎发育第4天进行注射和电转染，并在第6天收获。至少25%的视网膜成功转染（A=顶视图，B=底视图）。比例尺 = 1 mm。

图2. 利用免疫组织化学法鉴定表达GFP的视网膜细胞。 在E7阶段获取表达GFP的视网膜组织，经固定后切片。随后使用多种细胞特异性标记物对这些切片进行染色。Brn3a用于鉴定神经节细胞（A），而Pax6用于鉴定水平细胞、无长突细胞和神经节细胞（B）。比例尺 = 50 μm。

讨论

在E4阶段对胚胎视网膜进行靶向视网膜注射和in ovo电穿孔，可特异性靶向视网膜前体细胞，从而能够在单细胞水平上可视化所有六种主要的视网膜细胞类型。In ovo电穿孔在HH10期（约E1.5）靶向视泡时，能够转染发育形成眼睛的细胞。然而，此时期细胞更新速度极快，且该方法对视网膜细胞缺乏特异性。高细胞更新率可能阻碍了稳定持续的表达。到E4阶段，胚胎已发育至眼部主要结构均形成，但又足够早期，使得视网膜中大部分细胞仍为视网膜干细胞。该方法也可应用于基因功能获得/缺失研究，通过靶向特定目的基因，以研究视网膜的正常发育和/或疾病机制。

在我们之前发表的论文中公布该技术后¹，该领域的多位科学家联系我们，希望获得有关该技术的进一步帮助。因此，我们决定制作本视频以直观展示该方法。此外，本视频还介绍了我们在该技术上的最新进展。

为了成功实施该技术，以下关键因素值得说明。

最关键的一步是将针头精确地放置在视网膜下腔。首先，需注意将针头...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
无病原体受精白来航鸡鸡蛋	Sunrise Farms (Catskill, NY)
鸡胚孵育箱	GQF Manufacturing	Model-1550	设置为60%湿度和37.5°C。
玻璃毛细管	World Precision Instruments, Inc.	TW150F-4
0.1 ml 注射器	Hamilton Co	Gastight 1710	也可使用1 ml 注射器
Masterflex硅胶（过氧化物）管路	Cole-Parmer	HV-96400-13	剪取一小段（1 cm），用于连接玻璃针头与注射器
镊子	Dumont	AA
显微操作仪	World Precision Instruments, Inc.	M3301-M3
质粒DNA			pCAG-GFP由Dr. Connie Cepko提供
快绿FCF	Sigma-Aldrich	F7252	用PBS稀释至0.025%
脉冲发生器	Harvard Apparatus	BTX ECM 830	方波发生器
电极	Harvard Apparatus	BTX model 514	我们的电极间距为3–5 mm
黑白数字相机	Carl Zeiss, Inc.	Axiocam MRM
荧光解剖显微镜	Leica Microsystems	Leica MZ16FA
直立荧光显微镜	Carl Zeiss, Inc.	Zeiss Axio Imager A1