本视频的总体目标是展示如何在汉普格尔和哈密尔顿22-23期（约胚胎发育第4天，E4）对鸡胚视网膜进行靶向视网膜注射以及in ovo电穿孔，将DNA/RNA构建体导入鸡胚视网膜。该技术对于研究鸡胚视网膜发育过程中的基因表达、基因调控及形态学变化非常有用。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
鸡胚视网膜是研究高等脊椎动物视网膜发育的优良模型。由于其体积较大且为体外发育，利用重组DNA/RNA技术对鸡胚视网膜进行操作相对简便。将DNA/RNA构建体电穿孔导入鸡胚视网膜，可有效研究视网膜发育过程中视网膜干细胞/前体细胞的基因调控。通过电穿孔技术，可开展多种类型的实验，如报告基因检测、基因过表达、基因敲低（shRNA）等。本视频展示了在汉密尔顿-哈密尔顿分期22–23期（约胚胎发育第4天，E4）进行的靶向视网膜注射和in ovo电穿孔操作。我们介绍了一种快速、便捷的in ovo电穿孔技术：将表达绿色荧光蛋白（GFP）作为标记的质粒DNA直接注入鸡胚视网膜下腔，随后施加电脉冲，以促进视网膜干细胞/前体细胞对DNA的摄取。在E4阶段进行视网膜注射与电穿孔的新方法，能够可视化所有类型的视网膜细胞，包括晚期生成的神经元1，而使用传统的E1.5期注射与电穿孔方法则难以实现这一点2。
方案
由于本方案的部分步骤已在其他 JoVE 视频2和论文3中略有修改地描述过，因此此处不再详细讨论。
1. 卵的处理与针头准备
- 鸡蛋可在约13°C的酒柜中保存长达1周。若温度过高，胚胎将开始异常发育；而温度过低则会导致高死亡率。准备孵化时，将鸡蛋从酒柜中取出，并垂直放置，较大的一端朝上。在将鸡蛋放入37.5°C培养箱前，需在室温下静置至少2小时。
- 将鸡蛋孵化96至100小时，约为胚胎发育第4天，以获得处于Hamburger和Hamilton第22期的胚胎4-5。
- 使用拉制的玻璃毛细管制备微移液针，并在解剖显微镜下用镊子折断针尖，使针尖开口直径约为0.1 μm，锥度为20 mm。针尖过大的针难以刺穿卵黄膜，而针尖过小的针则难以加载和输送DNA溶液。
- 将针头连接至安装在显微操作仪上的0.1 ml Hamilton气密注射器。使用一小段Masterplex硅胶管连接针头与注射器。由于连接紧密，无需添加矿物油密封。
- 在一块Parafilm上混合2 μl浓度为3–6 μg/μl的报告质粒DNA溶液与0.2 μl快绿染料（0.025%）。快绿染料有助于观察注射过程。缓慢地将混合液吸入针头中。
- 为使卵黄膜与内层膜分离，轻轻将鸡蛋旋转约180°，静置数分钟后，再将其转回原始位置，并准备进行电穿孔。....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
在E4阶段对胚胎视网膜进行靶向视网膜注射和in ovo电穿孔，可特异性靶向视网膜前体细胞，从而能够在单细胞水平上可视化所有六种主要的视网膜细胞类型。In ovo电穿孔在HH10期（约E1.5）靶向视泡时，能够转染发育形成眼睛的细胞。然而，此时期细胞更新速度极快，且该方法对视网膜细胞缺乏特异性。高细胞更新率可能阻碍了稳定持续的表达。到E4阶段，胚胎已发育至眼部主要结构均形成，但又足够早期，使得视网膜中大部分细胞仍为视网膜干细胞。该方法也可应用于基因功能获得/缺失研究，通过靶向特定目的基因，以研究视网膜的正常发育和/或疾病机制。
在我们之前发表的论文中公布该技术后1，该领域的多位科学家联系我们，希望获得有关该技术的进一步帮助。因此，我们决定制作本视频以直观展示该方法。此外，本视频还介绍了我们在该技术上的最新进展。
为了成功实施该技术，以下关键因素值得说明。
最关键的一步是将针头精确地放置在视网膜下腔。首先，需注意将针头.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
所有动物实验均经罗格斯大学机构动物护理与设施委员会批准。
致谢
我们感谢Maaz Enver先生提供其高清摄像机（Cannon VIXIA HFS100）的使用。本工作部分得到了美国国立卫生研究院（NIH，项目号EY018738）、新泽西州脊髓损伤研究委员会（项目号08-3074-SCR-E-0和10-3091-SCR-E-0）以及Busch生物医学研究奖的资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 无病原体受精白来航鸡鸡蛋 | Sunrise Farms (Catskill, NY) | ||
| 鸡胚孵育箱 | GQF Manufacturing | Model-1550 | 设置为60%湿度和37.5°C。 |
| 玻璃毛细管 | World Precision Instruments, Inc. | TW150F-4 | |
| 0.1 ml 注射器 | Hamilton Co | Gastight 1710 | 也可使用1 ml 注射器 |
| Masterflex硅胶（过氧化物）管路 | Cole-Parmer | HV-96400-13 | 剪取一小段（1 cm），用于连接玻璃针头与注射器 |
| 镊子 | Dumont | AA | |
| 显微操作仪 | World Precision Instruments, Inc. | M3301-M3 | |
| 质粒DNA | pCAG-GFP由Dr. Connie Cepko提供 | ||
| 快绿FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | 用PBS稀释至0.025% |
| 脉冲发生器 | Harvard Apparatus | BTX ECM 830 | 方波发生器 |
| 电极 | Harvard Apparatus | BTX model 514 | 我们的电极间距为3–5 mm |
| 黑白数字相机 | Carl Zeiss, Inc. | Axiocam MRM | |
| 荧光解剖显微镜 | Leica Microsystems | Leica MZ16FA | |
| 直立荧光显微镜 | Carl Zeiss, Inc. | Zeiss Axio Imager A1 |
参考文献
- Doh, S. T. Analysis of retinal cell development in chick embryo by immunohistochemistry and in ovo electroporation techniques. BMC. Dev. Biol. 10, (2010).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Emb....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
