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方法文章

Drosophila 行为测定方法

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DOI：

10.3791/3795

⸱

2012年3月7日

 ,  , 
1Department of Pharmacology and Experimental Therapeutics, Louisiana State University Health Sciences Center, 2Department of Genetics, Louisiana State University Health Sciences Center

本文内容

摘要

Drosophila melanogaster 是一种遗传和行为上易于操作的模式生物系统，一个多世纪以来已被用于研究许多重要生命过程的分子与细胞基础1。Drosophila 被广泛用于深入解析果蝇行为的遗传基础。

摘要

黑腹果蝇，果蝇，已被用于研究多种人类疾病的分子机制，例如果蝇已被用于研究癌症、心血管疾病以及多种神经系统疾病1我们已优化了简单且可靠的幼虫运动行为、成虫攀爬能力（RING实验）以及求偶行为的检测方法。 果蝇 这些行为学实验广泛适用于研究遗传和环境因素对果蝇行为的影响。幼虫爬行能力可被可靠地用于确定幼虫爬行能力在早期阶段的变化。 果蝇 幼虫，以及检测药物或人类疾病基因（在转基因果蝇中）对其运动能力的影响。当某个基因的表达或缺失导致蛹期或成虫期致死时，幼虫爬行实验更具适用性，因为这些果蝇无法存活至成虫阶段，从而无法在成虫中进行评估。该基础实验还可结合强光或应激刺激，用于检测幼虫的其他行为反应。 果蝇 幼虫。求偶行为已被广泛用于研究性行为的遗传基础，也可用于检测活动能力、协调性以及学习与记忆功能。 果蝇 求偶行为涉及雄性和雌性之间多种感官刺激的交换，包括视觉、听觉和化学感受信号，从而引发一系列特征明确的复杂运动行为，最终实现成功交配。传统的成虫攀爬实验（负向趋地性）费时费力，工作量大，且不同试验之间存在显著差异。2-4快速迭代负向重力趋性实验5 与更常用的实验方案相比，该方法具有诸多优势，可对成年个体的运动及负向趋地性行为进行可重复、灵敏且高通量的定量分析。在RING实验中，可同时利用大量个体平行测试多种基因型或药物处理，其高通量特性使其更适用于筛选实验。

方案

1. 幼虫爬行实验

1. 幼虫采集

  1. 准备一个8盎司的果蝇瓶（10-15只雄蝇 + 10-15只雌蝇）。
  2. 让果蝇产卵24小时，然后清除瓶中的成虫。（将成虫转移到新瓶中，必要时重复此操作）。
  3. 将果蝇瓶培养3-4天，或直至观察到三龄幼虫。
  4. 向含有幼虫的瓶中加入50 - 100 ml的20%蔗糖溶液，静置20分钟。幼虫将上浮至液面。
  5. 使用剪去尖端的25 ml血清移液管收集幼虫，并放入网状篮中。
  6. 用去离子H2O将网状篮中的幼虫清洗两次。幼虫现在可用于实验。

2. 用药物处理幼虫

  1. 使用毛刷将所需数量的幼虫转移至含有5%蔗糖加药物溶液的5 ml烧杯中。
  2. 让幼虫取食至少15分钟。
  3. 将药物处理后的幼虫倒入网状篮中并冲洗。此时幼虫已准备好用于后续实验。

3. 运动行为检测（测量总移动距离或体壁收缩）

  1. 使用毛刷将单个幼虫转移至：
    1. 一个直径为15 cm的培养皿，其中含有2%琼脂糖（预先倒入并已凝固），琼脂糖上覆盖带有0.2 cm2方格的坐标纸。
      1. 统计1分钟内幼虫穿过的网格线数量。
    2. 玻璃解剖皿的一个孔中，内含稀释的酵母糊溶液。
      1. 在解剖显微镜下观察，统计1分钟内的蠕动收缩次数（从头部到尾部完成一次完整移动记为1次收缩）。
  2. 重复上述步骤，直至完成所需数量幼虫的计数。

2. 快速迭代负向重力趋性（RING）实验方案

该实验最初由 Gargano et al5 描述。

  1. 在轻度 CO₂ 麻醉下收集新羽化的成年雄性果蝇2 麻醉后放入含有食物（或含药物的食物）的标准小瓶中。
  2. 在室温下（台面上）饲养果蝇。~22 °C）以恢复2-3天2 （以及在适当时达到稳态血药浓度）。
  3. 转移约 25 只果蝇 无需麻醉 加入预处理的聚苯乙烯小瓶中。
  4. 将装有果蝇的小瓶组装到RING装置中（图1）。
  5. 让果蝇在不受干扰的环境中适应15-20分钟。
  6. 在此期间，将数码相机置于装置前方约1米处（必要时放置于平台以使镜头中心与小瓶中部高度对齐），对装置进行对焦和缩放，并将定时器设置为3.0秒。
  7. 用左手小心握住 RING 装置，以免干扰果蝇，同时用右手握住计时器。
  8. 用力将装置在实验台表面垂直叩击三次，确保力度足以使所有果蝇震落到离心管底部。
  9. 在完成第三次敲击的同时，启动3秒倒计时计时器。
  10. 三秒时拍摄一张照片。
  11. 将计时器重置为1分钟并开始计时。在此期间，重置相机并对准装置，同时将计时器的另一通道设置为3秒。
  12. 1分钟后，重复步骤1.7-1.10
  13. 经过总共5-6次试验后，将图像上传至计算机，并使用您常用的照片查看软件打开图像，对每支小瓶中果蝇的平均攀爬高度进行评分。
  14. 对不同组别进行统计分析，比较攀爬的平均高度。

3. 求偶与交配实验

  1. 每天早晨首先清理并挑选出用于实验的产蝇状况良好的培养瓶。
  2. 在当天过程中（每3-4小时一次），收集新羽化且未交配经验的雄性和雌性果蝇：
    1. 将雄蝇单独放入含有培养基的小瓶或试管中。
    2. 每小瓶或试管中放入5-6只雌蝇共同培养。
    3. 将收集的果蝇在25 °C、12小时光照/12小时黑暗条件下隔离培养5天。
    4. 将一只雌蝇转移至交配轮装置的观察室中。
    5. 将一只雄蝇转移至交配轮装置的观察室中。
    6. 在解剖显微镜下观察该对果蝇，记录以下行为：
      1. 定向行为（雄蝇朝向雌蝇）
      2. 触碰行为（雄蝇用前足轻触雌蝇）
      3. 翅膀鸣唱（雄蝇伸展并振动一侧翅膀）
      4. 舔舐行为（雄蝇舔舐雌蝇的生殖器区域）
      5. 腹部弯曲（雄蝇将腹部向下弯曲）
      6. 交配尝试（在尝试爬跨雌蝇的同时进行腹部弯曲动作）
  3. 观察10分钟或直至成功交配完成，记录每种行为发生的时间（潜伏期）、从求偶开始至交配完成的总求偶时间（用于计算求偶指数），以及成功表现出特定行为的果蝇对数（频率）。野生型果蝇通常在5分钟内完成交配的比例接近100%。
  4. 通过将求偶所用时间除以从开始至交配完成的总时间，计算 求偶指数（CI）。对于野生型果蝇对，该指数通常介于0.6–0.8之间。

4. 代表性结果

爬行实验

正常的野生型幼虫爬行速度约为每分钟3厘米，每分钟可发生约40-50次体壁收缩。我们近期建立了一种与FUS/TLS相关的肌萎缩侧索硬化症（ALS）的果蝇模型，该模型表现出幼虫爬行缺陷、寿命缩短以及成虫攀爬能力受损6。我们将野生型和突变型FUS/TLS特异性表达于运动神经元（使用OK-371-gal4驱动子），并进行了幼虫爬行实验。如下所示，野生型幼虫可爬行至多12厘米，而表达野生型FUS的幼虫爬行能力下降至约6厘米。表达FUS/TLS中导致ALS的R521C突变的个体则表现出极为严重的爬行运动障碍（图1），每分钟仅能爬行约1厘米。

负向重力趋性 RING 实验

年轻的野生型成年果蝇在3秒时间内平均攀爬高度应为约4-5 cm（可根据不同品系或活动水平将时间从3秒进行调整，以确定特定品系或处理条件下的平均攀爬高度）。停留在底部的果蝇记为0。每支试管中不建议使用超过25只果蝇，否则将难以准确判断每只果蝇的具体位置以测量其攀爬高度。在我们所采用的连续6次、每次间隔1分钟的试验中，未观察到疲劳或脱敏现象。这一点至关重要 NOT 在初次收集数据后，不得重复使用该检测中的聚苯乙烯测试小瓶，因为放入已使用过的小瓶中的新果蝇其攀爬程度将不及在新小瓶中的果蝇。

离心装置示意图和照片，显示试管、刻度尺和用于颗粒沉降的相机。
图1. RING实验装置。将数码相机放置在装有果蝇的聚苯乙烯小瓶装置前方约1米处；调整相机对准装置并进行变焦；设置定时器为3.0秒。

运动活性比较柱状图；单独驱动组 vs. UAS-FUS WT/R521C；实验结果。

图2. 在运动神经元驱动（OK371-gal4）下异位表达UAS-FUS WT和UAS-FUS R521C的果蝇进行幼虫爬行实验的代表性数据。

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讨论

果蝇 行为受到遗传和环境因素的严格调控。我们及其他研究者此前已使用本文所述的实验方法获取数据，用于研究与果蝇行为相关的基因，以及在果蝇中建模的人类神经退行性疾病相关基因 果蝇5-19在爬行实验中，需仔细选择3rd 三龄幼虫的处理是一个关键步骤。若使用药物处理，药物达到最大效应通常需要10–15分钟（或更长时间，具体取决于药物的种类和性质），前提是药物具有良好的溶解性。因此，我们通常让果蝇摄取药物15分钟，随后再等待额外的15分钟，然后开始测试。然而，为确保准确比较，不同处理组之间的药物溶液浓度和暴露时间必须保持一致。中枢神经系统活性药物通常可维持约45分钟的最大效应。在筛选（或挖掘取食）后，幼虫应充分清洗以去除果蝇食物，并静置适应1分钟，再开始爬行实验。琼脂平板应在室温（约22°C）下放置1小时，因为低温可能影响幼虫的爬行能力。尽管幼虫爬行实验可提供有关活动水平的重要信息，但其并不适用于分析细微的协调功能障碍。因此，作为筛选平台，该方法最适用于初步检测明显的活动能力缺陷。

一种涉及精细运动协调的成年行...

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披露

我们无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢Astha Maltare提供了幼虫爬行数据。我们感谢Nicholas Lanson Jr.博士对本文手稿提出的宝贵意见。本研究得到了约翰霍普金斯大学ALS罗伯特·帕卡德中心（UBP）和肌萎缩侧索硬化症协会（UBP）的资助；以及美国国家心理健康研究所R01MH083689项目（CDN）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
蔗糖Fisher ScientificS5-500
琼脂糖Invitrogen16500-500
6 盎司 Drosophila 瓶Genesee Scientific32-130
画笔（#1）Ted Pella, Inc.11859
玉米粉Fisher ScientificNC9109741
琼脂Genesee Scientific66-104
糖蜜Fisher ScientificNC9349176
丙酸Acros Organics14930-0010
对羟基苯甲酸甲酯Apex20-258
乙醇Fisher ScientificBP2818-4
酵母Genesee Scientific62-107

参考文献

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