使用荧光显微镜和流式细胞术对 Bacillus subtilis 生物膜进行单细胞分析

摘要

微生物生物膜通常由不同类型的特化细胞亚群构成。对这些亚群进行单细胞分析需要使用荧光报告系统。本文中，我们描述了一种利用荧光显微镜和流式细胞术对B. subtilis生物膜中的多个亚群进行可视化和监测的实验方案。

摘要

生物膜的形成几乎是所有细菌的普遍特性 ^1-6。当细菌形成生物膜时，细胞被包裹在主要由蛋白质和胞外多糖以及其他因子组成的胞外基质中^7-10。包裹在生物膜内的微生物群落通常会分化出具有特定功能的不同亚群细胞^11-17。这些亚群在生物膜内共存，并通常表现出空间和时间上的有序结构 ^18-21。

模式生物Bacillus subtilis中的生物膜形成需要分化出具有特定功能的细胞亚群。其中，基质产生亚群负责产生并分泌生物膜的胞外基质，对生物膜的形成至关重要^11,19。因此，基质产生细胞的分化是B. subtilis生物膜形成的一个标志性特征。

我们利用荧光报告基因来观察并量化B. subtilis生物膜中基质产生细胞的亚群^15,19,22-24。具体而言，我们发现基质产生亚群会响应自身产生的胞外信号分子表面活性素而发生分化²⁵。有趣的是，表面活性素由一类特化的细胞亚群产生，该亚群不同于基质产生细胞亚群¹⁵。

本报告详细阐述了在生物膜中可视化和量化基质产生亚群及表面活性素产生亚群所需的技术方法 B. subtilis将用于基质生成和表面活性素生成的基因的荧光报告系统插入染色体中 B. subtilis报告基因仅在特定细胞的亚群中表达。随后，可利用荧光显微镜和流式细胞术对这些亚群进行监测（见图1）。

在细菌多细胞群体中，不同特化细胞亚群共存的现象，使我们对原核生物基因表达调控有了新的认识。本实验方案针对这一现象进行研究，可轻松适配于其他任何研究模型，以阐明微生物群落内表型异质性的分子机制。

方案

1. 标记B. subtilis及生物膜形成实验

1. 通过PCR扩增目的基因的启动子区域。我们以P_tapA的克隆为例，该启动子调控负责产生TasA基质蛋白的基因²⁶。将P_tapA克隆至pkm008载体中（由美国波士顿哈佛医学院Rudner实验室构建）（图2）。
2. 通过酶切消化线性化质粒（推荐使用XhoI酶）。
3. 按照Harwood和Cutting先前描述的一步法协议，诱导枯草芽孢杆菌（B. subtilis）168菌株的自然感受态²⁷。
4. 将线性化质粒加入感受态细胞培养物中，孵育2小时后筛选壮观霉素抗性菌株。
5. 获得的菌株通过双交换重组将构建体插入到枯草芽孢杆菌（B. subtilis）的中性amyE 位点（图4）。为构建双标记菌株，使用图3所示的质粒pDR183，将第二个报告基因整合至中性位点lacA。采用上述用于pKM008克隆报告基因插入的相同技术进行该报告基因的插入。
6. 通过SPP1噬菌体转导协议^28,29，将报告基因从168菌株转移至能够形成生物膜的NCIB3610菌株。在TY培养基（LB+10 mM MgSO₄+10 μM MnSO

讨论

细菌群落中存在表达特定基因组合的细胞亚群，这一事实表明了微生物群落的复杂性^33,34。本方案有助于确定任何目的基因的表达是否局限于微生物群落内特定的特化细胞亚群。由于传统基因表达监测方法或微阵列分析仅能评估整个微生物群落的基因表达水平，通常无法捕捉群落内部基因表达的波动，因此可视化这些亚群需要开发新技术。

荧光显微镜与流式细胞术在细胞类型分析中具有理想的互补性，可结合提供定性与定量信息，从而明确目标亚群的特征。两种技术各自的局限性使得它们在确保测量准确性方面需要相互参照。以荧光显微镜为例，荧光细胞信号的强度（有时还包括亚群的大小）会因激发样品所用曝光时间的不同而变化（通常在50至200毫秒之间）。而对于流式细胞术而言，细菌细胞体积较小限制了检测灵敏度，部分细菌无法被有效监测。由于细胞尺寸的限制，报告基因所发出的荧光信号必须足够强才能被检测到；正因如此，我们在检测低表达水平报告基因的细胞时曾遇到困难。然而，目前新型流式细胞仪具备更高的检测灵敏度，使我们能够更精确地监测细菌群体。此外，检测限的进一步提高还将使细胞分选分析成为可能，从而分离出我们感兴趣的目标细胞亚.......