我们展示了共轭聚合物聚二乙炔（PDA）与连接在PDA脂质体表面的荧光团之间的荧光共振能量转移（FRET），用于生物分子的检测。PDA脂质体的表面还含有可作为探针的生物分子受体分子。配体-受体相互作用导致荧光团与PDA之间FRET效率的变化，这是该传感机制的基础。
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摘要
摘要
FRET 是一种通过长程偶极-偶极相互作用，将能量从激发态的供体分子非辐射地转移至基态受体分子的过程1。在本传感检测中，我们利用了PDA的一种特殊性质：当分析物与连接在PDA上的受体相互作用后，PDA的紫外-可见电子吸收光谱会发生蓝移（图1）2,3,4,7。该PDA吸收光谱的偏移会改变PDA（受体）与罗丹明（供体）之间的光谱重叠（J），从而引起FRET效率的变化。因此，分析物（配体）与受体之间的相互作用可通过供体荧光团与PDA之间的FRET进行检测。具体而言，我们展示了对模型蛋白分子链霉亲和素的传感检测。同时，我们还利用FRET机制演示了牛血清白蛋白（BSA）与脂质体表面的共价结合。这些双层脂质体与蛋白质分子之间的相互作用可实现实时检测。所提出的方法是一种适用于检测小分子化学物质和大分子生物分子的通用传感策略。由于荧光检测本身比比色法更灵敏，该检测方法的检测限可达到亚纳摩尔级别或更低8。此外，PDA可作为FRET中的通用受体，这意味着可以通过在PDA脂质体表面功能化不同的供体和受体，开发出多种基于PDA（受体）的传感器。
方案
A. PDA 脂质体的合成与表征4,5,6
注意 1：在所有实验步骤中，使用铝箔包裹每个容器，以保护 PDA 溶液免受光照。
注2：按照步骤A（PDA脂质体的合成与表征）制备了两组不同的脂质体溶液（B和C）。
1. N-羟基琥珀酰亚胺二炔酸酯（NHS-PCDA）的合成
- 制备脂质体时，需要一种关键成分PCDA-NHS。我们采用以下步骤合成PCDA-NHS：
- 将10,12-二十二碳二炔酸（PCDA）（0.267 g，0.713 mmol）、N-羟基琥珀酰亚胺（0.0914 g，0.786 mmol）和1-(3-(二甲氨基)丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（0.144 g，0.713 mmol）加入到20 ml无水CH2Cl2中。
- 室温下搅拌溶液2小时。
- 使用旋转蒸发仪小心除去溶剂，得到干燥的薄膜。
- 使用分液漏斗，用乙醚（25 ml）和水（25 ml）对残留物萃取三次。
- 用MgSO4（1.0 g）干燥有机层半小时。过滤后，通过旋转蒸发除去溶剂，得到白色固体粉末（0.24 g，>90%）。
- 采用核磁共振（NMR）分析最终化合物。
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讨论
我们利用NHS-胺反应实现了蛋白质赖氨酸残基在脂质体表面的选择性结合。该基于FRET的方法能够实时监测生物素-链霉亲和素结合以及蛋白质（BSA）与脂质体表面的结合过程。类似的方法可应用于研究各种蛋白质与其特异性受体之间相互作用的动力学。在荧光染料的选择上具有灵活性，可根据荧光染料的光谱特性导致不同的J值变化。PDA是一种通用的受体，因此将PDA（受体）与多种荧光染料和受体联用，有望为我们提供多种传感器。我们所构建传感器的灵敏度可达亚纳摩尔水平，经过优化后还可进一步提高。传感器的特异性通过受体与配体之间的分子相互作用进行调控。这些传感器也可用于检测病毒和细菌等较大颗粒。
我们还获得了诸如供体与受体之间的距离、FRET 效率以及J值等有价值的信息。计算得到的供体与受体之间的距离为 2.8 nm，这与我们的预测结果一致。由于临床上迫切需要对隐匿性病毒、细菌及其他有害微生物进行监测，我们希望研制一种便携式设备，能够对有害生物分子进行实时检测。
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致谢
本工作的经费由美国国家科学基金会、美国国立卫生研究院（NIH）、材料技术中心（MTC）以及SIUC的科研发展办公室（ORDA）提供支持。我们感谢国家科学基金会（NSF）提供的资助（CHE-0959568），用于购置场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）。我们感谢Matthew McCarroll教授在讨论中提供的有益建议。Julia Reyes谨此感谢哥伦比亚科学、技术和创新部（COLCIENCIAS）、哥伦比亚高等教育机构以及哥伦比亚 Pedagogica y Tecnologica 大学为其提供的奖学金和经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10,12-二十二碳二炔酸（PCDA） | GFS chemicals | 3261 | 光敏感 |
| N-羟基琥珀酰亚胺（NHS） | Acros Organics | 157270250 | 对湿气敏感 |
| 1-(3-(二甲氨基)丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC） | Chem-impex International | 00050 | |
| 1,2-二肉豆蔻酰基-sn二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱（DMPC） | Avanti Polar Lipids | 850345P | |
| 罗丹明标记的牛血清白蛋白（BSA-Rh） | Sigma Aldrich | A4537 | |
| (1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸–乙醇胺-N-(生物素)(生物素-DOPE) | Avanti Polar Lipids | 870282 |
参考文献
- Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , 3rd ed, Kluwer Academic/Plenum Publishers. (1999).
- Charych, D. H., Nagy, J. O., Spevak, W., Bednarski, M. D. Direct Colorimetric Detection of a Receptor-Ligand Interaction by a Polymerized Bilayer Assembly. Science. 261, 585-....
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