从大脑复杂的细胞异质性中分离原代小胶质细胞，对于研究其在生理和病理条件下的作用至关重要。本方案描述了一种机械分离与混合细胞培养技术，可获得高产量、高纯度且具有活性的原代小胶质细胞 体外 研究及下游应用。
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摘要
摘要
小胶质细胞约占哺乳动物脑内总细胞群体的12%。尽管神经元和星形胶质细胞被认为是神经系统的主要细胞类型，但小胶质细胞通过监测组织中的碎片和病原体，并通过吞噬活动维持实质内的稳态，在正常脑生理中发挥着重要作用1,2。在多种损伤和疾病状态下，包括神经退行性疾病、创伤性脑损伤以及神经系统感染，小胶质细胞会被激活3。在这些激活条件下，小胶质细胞会增强其吞噬活性，发生形态学和增殖性改变，并主动分泌活性氧和氮物质、促炎性趋化因子和细胞因子，常常引发旁分泌或自分泌循环4-6。由于这些小胶质细胞反应参与了神经系统疾病的发病机制，因此针对小胶质细胞的研究具有重要意义。
由于大脑具有细胞异质性，因此在获取高纯度的小胶质细胞样本材料时存在技术上的困难 体内 实验。当前关于小胶质细胞神经保护与神经毒性功能的研究，需要一种常规技术方法，以稳定地获得高纯度、高活力且产量充足的原代小胶质细胞用于研究。本文以文字和视频形式提供一种从混合胶质细胞培养物中分离纯化原代小胶质细胞的实验方案，适用于多种下游应用。简言之，该技术利用新生大鼠脑组织制备单细胞悬液，建立混合胶质细胞培养体系。当混合胶质细胞培养至融合状态后，通过短暂振荡的物理方式，将原代小胶质细胞从培养层中分离。随后，可将获得的小胶质细胞以高纯度接种，用于后续实验研究。
该方法的原理和操作步骤已有文献报道7,8。此外，分离原代小胶质细胞的其他方法也已有详细描述9-12。匀浆后的脑组织可通过密度梯度离心法分离获得原代小胶质细胞12。然而，该离心过程持续时间中等（45分钟），可能导致细胞损伤和活化，并可能富集小胶质细胞及其他细胞群体。另一种方法已被用于从多种生物体中分离原代小胶质细胞，即在培养过程中进行长时间（16小时）振荡9-11。振荡后，收集培养基上清液并离心以分离小胶质细胞。这种较长的两步分离法同样可能干扰小胶质细胞的功能和活化状态。我们在实验室主要采用以下小胶质细胞分离方案，原因如下：（1）与永生化啮齿类小胶质细胞系相比，原代小胶质细胞更能真实模拟in vivo的生物学特性；（2）轻微的机械性破坏可最大程度减少细胞功能障碍或活化的潜在风险；（3）无需传代混合胶质细胞培养物即可获得足够的细胞产量。
需要注意的是，本实验方案使用新生大鼠的脑组织来分离小胶质细胞，而使用较年长大鼠分离小胶质细胞会显著影响所获细胞的产量、活化状态及功能特性。已有证据表明，衰老与小胶质细胞功能障碍、神经炎症加剧以及神经退行性病变相关，因此先前的研究采用离体（ex vivo）成年小胶质细胞，以更深入地理解小胶质细胞在衰老为关键因素的神经退行性疾病中的作用。然而，离体（ex vivo）小胶质细胞无法在体外长期培养。因此，尽管本方案可延长原代小胶质细胞在培养中的存活时间，但仍需注意，这些细胞的行为与成年小胶质细胞存在差异，在将体外（in vitro）研究结果外推至体内（in vivo）环境时应谨慎对待。
方案
1. 新生大鼠脑组织的解剖
- 将Leibovitz的L-15条件培养基（Leibowitz L-15 + 0.1% BSA + 1% Pen/Strep）冷却至 4 °C. 将培养基（DMEM + 10% FBS + 1% 青霉素/链霉素）预热至 37 °C. 在冰上准备4个60x15 mm的培养皿，每皿中加入4-5 ml预冷的L-15条件培养基。用100%乙醇对所有手术器械进行灭菌。
- 用70%乙醇冲洗P2新生大鼠幼崽。（本方案可使用P1-P5日龄的新生大鼠幼崽。）
- 用无菌的锋利剪刀迅速将幼鼠断头，并立即将头部放入70%乙醇中。重复操作，共处理5只幼鼠，然后将头部转移至生理盐水中。
- 从头部取出完整脑组织，置于含有 4 - 5 ml L-15 溶液（Leibowitz L-15 + 0.1% BSA + 1% Pen/Strep）的培养皿中，冰上保存。
- 对同窝剩余的幼崽重复执行步骤 1.2–1.4。
- 去除脑膜并转移所需脑组织（即，大脑皮层、小脑、全脑等）放入新的培养皿中，加入4-5 ml冰上预冷的L-15溶液（Leibowitz L-15 + 0.1% BSA + 1% Pen/Strep）。
2. 混合胶质细胞群体的制备
- 使用10 ml移液管将组织转移至无菌的50 ml锥形管中，注意勿用剪刀或刀片损伤脑组织。
- 在4 °C条件下，以2,500 RCF离心5分钟。
- 吸除上清液，加入4–5 ml新鲜L-15培养基（Leibowitz L-15 + 0.1% BSA + 1% Pen/Strep）。
- 用无菌的10 ml移液管将组织上下吹打10次。
- 将细胞筛（孔径100 μm）置于新的50 ml锥形管上。用无菌的5 ml移液管将组织吹打1次，并将移液管紧贴细胞筛，将样品通过细胞筛排入锥形管中。
- 用4–5 ml新鲜L-15培养基（Leibowitz L-15 + 0.1% BSA + 1% Pen/Strep）冲洗细胞筛。
- 将滤过细胞的锥形管在4 °C条件下，以2,500 RCF离心5分钟。
3. 混合胶质细胞培养物的接种与维持
- 每处理一只大鼠幼崽脑组织，准备1个无菌的T-75培养瓶，向每个培养瓶中加入12 ml培养基（DMEM + 10% FBS + 1%青霉素/链霉素）。
- 吸除细胞沉淀中的上清液，向细胞沉淀中加入5–6 ml培养基。用10 ml移液器上下吹打10次。
- 将等体积的细胞悬液转移至每个T-75培养瓶中。
- 将培养瓶置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育，总时间为1–3周。
- 培养瓶首先孵育5天，第5天时，将每个培养瓶中的培养基更换为12 ml新鲜培养基，并放回培养箱。此后每隔3天，将每个培养瓶中的条件培养基更换为12 ml新鲜培养基，直至细胞融合。操作时必须格外小心，避免触碰培养瓶底部细胞贴壁的区域。
4. 原代小胶质细胞的分离与接种
- 当混合胶质细胞培养物完全汇合后，从培养箱中取出培养瓶，并用 Parafilm 封住瓶盖，以防止与外界空气发生气体交换。
- 在 37 °C 下，以 100 rps 的速度振荡培养瓶 1 小时（Lab Companion SI-600，Jeio Tech）。
- 使用 10 ml 移液器从所有培养瓶中收集培养基，注意不要破坏培养瓶表面的星形胶质细胞层。将收集的培养基置于 50 ml 圆锥形管中。向培养瓶中加入新鲜培养基，并将培养瓶放回培养箱。
- 在 4 °C 下，以 2,500 RCF 离心圆锥形管 5 分钟。
- 吸除所有圆锥形管中的上清液。细胞沉淀即为高纯度的小胶质细胞。将沉淀重悬于 1 ml 小胶质细胞接种培养基（DMEM + 10% FES + 1% 青霉素/链霉素）中。
- 使用血细胞计数板测定重悬液中的细胞密度。
- 加入适量的小胶质细胞接种培养基，使细胞密度达到每毫升 2 × 10⁵ 个细胞。根据实验分析需要进行接种。
- 让小胶质细胞贴壁过夜。
5. 代表性结果
上述方案可获得高纯度的原代小胶质细胞培养物。通过针对巨噬细胞/小胶质细胞特异性标志物（Iba1）的免疫组织化学检测确定，所培养的小胶质细胞纯度达到 > 90% 纯度（图2）。此外，对星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元细胞特异性标志物的染色显示污染极少（图2）。在建立混合神经胶质细胞培养后，可通过连续振荡最多4次来分离小胶质细胞。初次分离小胶质细胞可获得约2.2 × 10⁶ 个细胞/ml，相当于每10个培养瓶约900万个细胞，且每次连续振荡后的预期得率依次下降。利用该方法分离的小胶质细胞已成功用于吞噬能力、功能（如一氧化氮产生）以及神经毒性等研究。图3) 13-14.
图 1. 制备混合胶质细胞培养物及分离原代小胶质细胞的操作流程概览。
图 2. 通过免疫组织化学分析验证高纯度小胶质细胞的分离，使用了小胶质细胞（Iba-1，红色）、星形胶质细胞（GFAP，绿色）、神经元（NeuN，红色）和少突胶质细胞（CC1，红色）的特异性标记物。图中还显示了DAPI（蓝色）对培养细胞DNA的染色结果。
图 3. 采用上述方法分离的小胶质细胞已用于多种检测，包括但不限于吞噬作用检测、功能检测和神经毒性研究。在这些研究中，我们发现小胶质细胞（Iba-1 阳性，绿色）在暴露于对照（A）或 LPS（B）处理的培养基时，对荧光标记乳胶微球（红色）的吞噬作用增强，且该过程可被定量（C）。此外，LPS（1 ng/mL）处理可增加小胶质细胞中一氧化氮的产生（D）。最后，通过 transwell 小室分隔共培养或直接的小胶质细胞-神经元共培养体系，我们发现经 LPS 孵育的小胶质细胞可诱导神经元细胞死亡，该效应通过乳酸脱氢酶（LDH）释放量进行评估（E, F）。
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讨论
尽管该方案通常用于为科研实验制备纯净且健康的小胶质细胞，但在操作关键步骤中仔细注意技术细节可最大限度地减少分离所得小胶质细胞的变异性。首先，在分离新生大鼠幼崽脑组织时，需及时操作，以尽量减少组织缺氧和缺血性损伤。然而，在解剖过程中也必须彻底去除脑表面的脑膜覆盖物，因为脑膜的存在会在此类培养条件下因成纤维细胞快速增殖而导致显著的成纤维细胞污染。
其次，在制备混合胶质细胞培养物时，轻柔操作组织材料对于减少细胞损伤、死亡或小胶质细胞过度活化也至关重要。添加培养基时，应注意避免损伤星形胶质细胞单层。此外，在摇动培养瓶以分离小胶质细胞时，可能需要调整摇动频率，以防止培养基内液体晃动或产生气泡。这些情况可能会增加星形胶质细胞污染或导致培养细胞受损。在实验室建立该技术时，建议初始采用较低强度的物理摇动（例如 100 rpm），并在显微镜下观察细胞培养物及上清液，再逐步增加摇动力度和时间，以获得理想数量的小胶质细胞，同时避免星形胶质细胞污染。
在实验室优化本方案时，另一个需要考虑的问题是：在分离原代小胶质细胞进行铺板之前...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
由统一服务大学校内项目资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 60 mm × 15 mm 培养皿 | Fisher brand | 0875713A | |
| 锋利的解剖剪刀 | Fine Science Tools | 14094-11 | |
| Dumont #7b 镊子—标准尖头，弯曲型，11 cm | Fine Science Tools | 11270-20 | |
| Dumont #5 镊子—标准尖头，直型，11 cm | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| 50 ml 锥形离心管 | VWR | 89039-656 | |
| 5 ml 血清移液管 | Grenier Bio One | 606180 | |
| 10 ml 血清移液管 | Grenier Bio One | 607180 | |
| 100 μm 无菌尼龙细胞筛 | Falcon | 35-2360 | |
| 75 cm2 组织培养瓶 | Corning | 430641 | |
| 杜尔贝科最低必需培养基（DMEM） | Gibco (Invitrogen) | 31053-028 | |
| 莱博维茨 L-15 培养基 | Gibco (Invitrogen) | 11415064 | |
| 胎牛血清 | Gibco(Invitrogen) | 16000-036 | |
| 胎马血清 | Fisher | SH3007402 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco (Invitrogen) | 15140163 | |
| 100% 乙醇 | The Warner Graham Company | 64-17-5 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS），10X，pH 7.4 | Quality Biological, inc. | 119-069-131 | 使用无菌蒸馏水稀释至 1X |
| 生物危害废物袋 | VWR | 14220-028 | |
| 血细胞计数板 | Hausser Scientific | 1492 | |
| 6 孔细胞培养板（带 cellBIND 表面） | Corning | 3335 |
参考文献
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Raivich, G., Bohatschek, M., Kloss, C. U., Werner, A., Jones, L. L., Kreutzberg, G. W. Neuroglial activation repertoire in the injured brain: graded response, molecular mechanisms and cues to physiological function. Brain Res. Brain Res. Rev. 30, 77-105 (1999).
- Loane, D. J., Byrnes, K. R. Role of microglia in neurotrauma. Neurotherapeutics. 7, 245-265 (2010).
- Glass, C. K., Saijo, K., Winner, B., Marchetto, M. C., Gage, F. H. Mechanisms underlying inflammation in neurodegeneration. Cell. 140, 918-934 (2010).
- Pocock, J. M., Liddle, A. C. Microglial signalling cascades in neurodegenerative disease. Prog. Brain Res. 132, 555-565 (2001).
- Block, M. L., Hong, J. S. Chronic microglial activation and progressive dopaminergic neurotoxicity. Biochem. Soc. Trans. 35, 1127-1132 (2007).
- Barger, S. W., Basile, A. S. Activation of microglia by secreted amyloid percursor protein evokes release of glutamate by cystine exchange and attenuates synpatic function. J. Neurochem. 76, 846-854 (2001).
- Ni, M., Aschner, M. Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications. Curr. Protoc. Toxicol. Chapter 12, Unit 12.17(2010).
- Hassan, N. F., Rifat, S., Campbell, D. E., McCawley, L. J., Douglas, S. D. Isolation and flow cytometric characterization of newborn mouse brain-derived microglia maintained in vitro. J. Leukoc. Biol. 50, 86-92 (1991).
- Hassan, N. F., Prakash, K., Chehimi, J., McCawley, L. J., Douglas, S. D. Isolation and characterization of newborn rabbit brain-derived microglia. Clin. Immunol. Immunopathol. 59, 426-435 (1991).
- Hassan, N. F., Campbell, D. E., Rifat, S., Douglas, S. D. Isolation and characterization of human fetal brain-derived microglia in in vitro culture. Neuroscience. 41, 149-158 (1991).
- Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus: immunophenotypic and functional characteristics. J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).
- Byrnes, K. R., Stoica, B., Loane, D. J., Riccio, A., Davis, M. I., Faden, A. I. Metabotropic glutamate receptor 5 activation inhibits microglial associated inflammation and neurotoxicity. Glia. 57, 550-560 (2009).
- Loane, D. J., Stoica, B. A., Pajoohesh-Ganji, A., Byrnes, K. R., Faden, A. I. Activation of metabotropic glutamate receptor 5 modulates microglial reactivity and neurotoxicity by inhibiting NADPH oxidase. J. Biol. Chem. 284, 15629-15639 (2009).
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