通过DNA家族混编技术构建与进化合成腺相关病毒（AAV）基因治疗载体

摘要

我们展示了通过DNA家族洗牌技术对合成腺相关病毒（AAV）基因治疗载体进行分子设计与定向进化的基本方法。此外，我们还提供了在培养细胞或小鼠中筛选和分析具有增强特性的单个嵌合衣壳的一般性指导原则及代表性实例。

摘要

腺相关病毒（AAV）载体因其独特的有益特性组合，被认为是目前最有效且最具前景的人类基因治疗递送工具之一¹包括基础野生型病毒的非致病性，以及用于生产高滴度、高纯度和临床级重组载体的成熟先进方法²腺相关病毒系统相较于其他病毒的另一显著优势在于，存在大量天然的血清型，这些血清型在关键特性上各不相同，但均可通过同一通用方案轻松改造为载体。^1,2此外，包括我们研究组在内的多个团队近期已设计出策略，利用这些天然病毒作为模板，构建合成载体，这些载体可整合多种输入血清型的优点，或增强单一分离株的特性。实现这些目标的相关技术主要包括DNA家族洗牌³, 即 基于部分同源性（通常）对各种 AAV 衣壳基因进行片段化，随后重新组装 >80%（大多数AAV血清型），或肽段展示^4,5, 即 将通常由七个氨基酸组成的肽段插入病毒衣壳的暴露环区，该肽段可理想地介导对特定目标细胞类型的重定向。为了获得最佳效果，这两种方法均以高通量方式进行，即对实验流程进行放大，以构建包含约一百万个不同衣壳变异体的文库。每个克隆要么包含多个亲本病毒的独特组合（DNA家族改组法），要么在同一病毒骨架中携带不同的展示肽段（肽段展示法）。后续的最终步骤是在目标细胞上对文库进行多轮迭代筛选，以富集满足筛选过程大部分甚至全部条件的个别衣壳。该筛选过程优选结合正向选择压力（例如在特定目标细胞类型上的扩增能力）与负向筛选（例如清除所有能与抗AAV抗体发生反应的衣壳）。这种组合策略提高了最终筛选出的合成衣壳满足特定应用需求的可能性，而此类衣壳在自然界存在的AAV分离株中几乎不可能被发现。本文重点介绍两种技术中理论和实验难度更高的DNA家族改组法，详细描述并演示构建与筛选改组AAV文库所需的全部关键步骤。图1），然后讨论在进行分子AAV进化时，为确保成功而需要注意的实验方案中的陷阱与关键要点。

方案

1. 编码 AAV 衣壳基因的质粒组的制备

1. 为了便于常规制备足量的各种 AAV 衣壳帽) 基因用于后续的DNA改组，首先将这些基因亚克隆至一个共用的质粒骨架中。需包含相同的侧翼序列 >20个核苷酸，用于后续巢式PCR的引物结合位点及克隆图 2).
2. 使用合适的引物（参见下表中针对 AAV5 的示例引物），通过 PCR 扩增目标片段 帽 通常包含AAV2的常用AAV质粒中的基因 rep 基因旁边的 帽 目的基因。由于PCR产物将用于标准克隆，约1 μg 纯化产物的量已足够，因此可采用任何常规PCR方案。
3. 消化纯化的PCR产物（例如，使用琼脂糖凝胶纯化或标准PCR纯化试剂盒）以及含有与引物中所用识别位点相对应的限制性内切酶的受体质粒 帽 扩增（1.1）以及在受体质粒中。在我们的实验室中，我们使用 Pac I 和 Asc I 位点（图 2因为它们在大多数AAV中不存在。

2. 基于DNase的Cap基因片段化

1. 从步骤1.1–1.3中构建的质粒中PCR扩增所选的cap基因。如下所述的一次反应可产生约3 μg的PCR产物。根据文库中拟包含的cap基因数量，该产物量足以进行最多六次洗牌反应。
2. 进行PCR时，配制50 μl反应体系，其中包含200 ng cap质粒、每种引物终浓度为2 μM、10 μl 5× Hifi缓冲液和1 μl Hifi聚合酶。先在95 °C孵育5分钟，随后进行40个循环：94 °C变性15秒、57 °C退火30秒、68 °C延伸3分钟，最后在72 °C延伸10分钟。通过凝胶电泳或试剂盒纯化PCR产物，然后进行受控的DNase消化，以产生用于重组成嵌合体的cap基因片段。
3. 将不同来源的cap PCR产物等量混合，总体积为54 μl H₂O，总DNA量为4 μg。向反应体系中加入6 μl DNase反应缓冲液和0.5 μl DNase I，轻轻弹击管壁三次，短暂离心后立即置于25 °C加热块上。孵育1至2分钟（可设置多个平行反应，并以15秒为间隔依次终止），然后加入6 μl 25 mM EDTA，短暂涡旋混匀，并在75 °C孵育10分钟以终止反应。
4. 在标准的1%琼脂糖凝胶上纯化cap片段。理想情况下，应在100至500个碱基对之间观察到弥散条带。由于DNase I是一种活性极强的酶，此步骤中的操作手法和时间控制至关重要，可能需要在步骤2.3中尝试多种不同的孵育时间以获得最佳结果（图3）。使用标准试剂盒纯化洗脱的DNA，并测定其浓度。

3. DNA家族改组

1. 首先，重新组装 帽 通过基于部分同源性的自引发PCR，将片段扩增为全长序列。因此，设置一个 50 μl 与500 ng纯化片段反应（步骤2.4）， 10 μl 10x Phusion缓冲液， 1 μl 10 mM dNTPs 1.5 μl DMSO 和 0.5 μl Phusion II 聚合酶。30 秒，孵育 98 °C 然后运行40个循环，每个循环10秒 98 °C，30 秒 42 °C 和 45 秒 72 °C，最后在10分钟步骤 72 °C.
2. 在随后的第二轮PCR中，扩增重新组装的 帽 用于后续克隆的基因，使用结合保守侧翼序列的引物（图 2）。因此，建立一个 50 μl 含有反应 2 μl 第一轮PCR（步骤3.1）中，每种引物的终浓度为 2 μM, 0.5 μl MgCl2 10 μl 5x Hifi 缓冲液和 1 μl 高保真聚合酶。建议进行16–24个PCR反应，以确保获得足够高的产量用于后续克隆。合并PCR产物并纯化全长产物 帽 条带（凝胶或试剂盒）
3. 消化纯化的 帽 基因库与 Pac I 和 Asc I 用于克隆至携带AAV ITRs（反向末端重复序列；复制与包装信号）以及AAV2的具有复制能力的AAV质粒中 rep 基因。后者应包含相同的位点，以便容纳 帽 基因库 “在阅读框内”（参见 图 2 有关详细信息，请参见正文。为实现PCR产物的完全消化，需使用过量酶过夜孵育。
4. 连接 帽 片段和经适当切割的 AAV ITR/rep 骨架以3:1的摩尔比混合。制备 40 μl 总体积为总反应体系（足够进行20次转化），最终DNA浓度为50 ng/μLμl 并在过夜孵育于 16 °C.
5. 将连接反应混合物在冰上混合后进行转化 2 μl 与 30 μl 电转感受态 E. coli （使用商业来源的细胞，按任一标准方案制备成感受态细胞）。将细胞加入预冷的电穿孔比色皿（1 mm 间隙）中，置于冰上。在1.8 kV、200 Ω条件下进行电穿孔 25 μF时间常数应接近5 ms。立即加入1 ml预热的SOC培养基，并转移至250 ml的锥形瓶中。进行20次此类电穿孔可获得多样性约为1×10的文库⁶ 不同的克隆
6. 加入1体积预热的SOC培养基至混合的转化产物中，振荡培养 37 °C 180 rpm 下孵育 1 小时。然后用含氨苄青霉素的 LB 培养基补至总体积为 800 ml（终浓度为 50 μg/ml）并在相同条件下继续孵育16小时。使用质粒DNA纯化试剂盒纯化文库质粒DNA 例如. 一个Qiagen大提纯试剂盒。

步骤3.6中的可选操作：为计算文库的确切多样性，取800 ml溶液的一份等分试样（在16小时孵育前）涂布于LB-氨苄青霉素平板（例如, 10 μl 在10 cm培养皿上）并次日计数菌落。同时，为验证高效的shuffling效率，进行测序 例如 24 个克隆并将其与亲本序列比对 帽 基因（另见 图 8）。最后，为确认文库的活力及高功能性多样性，随机挑取亚克隆 帽 将基因插入AAV辅助质粒，并利用其小规模生产与分析重组载体图 4-5）（另见下文步骤 5.4）。

4. 病毒文库的制备

1. 将HEK293T细胞以每皿4.5×10⁶个细胞的密度接种于10个15 cm²培养皿中，48小时后转染220 μg AAV文库和220 μg腺病毒质粒（AAV扩增所需）。因此，提前将PEI（聚乙烯亚胺）和300 mM NaCl预热至37 °C。然后将7.9 ml NaCl与DNA混合，并加H₂O至总体积15.8 ml。在另一管中，混合3.52 ml PEI、7.9 ml NaCl和4.38 ml H₂O（以上体积适用于十次转染）。将两种混合液合并（涡旋混匀），室温孵育10分钟，然后均匀分配至各培养皿中（每皿3 ml）。
2. 48小时后，将细胞刮入培养基中，1200 rpm离心15分钟。用6 ml裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 8.5，50 mM NaHCO₃）重悬细胞沉淀，并进行5次冻融循环（-80/37 °C）。加入每毫升50 U的苯甲酸酶，37 °C孵育1小时，然后3750 rpm离心20分钟以去除细胞碎片。
3. 用PBS-MK（1×PBS，1 mM MgCl₂，2.5 mM KCl）将60%碘克沙醇（OptiPrep溶于PBS-MK）储备液稀释为15%、25%和40%的溶液（每种溶液中加入2.5 μl/ml酚红）。
4. 使用巴斯德吸管将5 ml病毒悬液加入Beckman Quick-Seal离心管（14×89 mm）中，随后依次加入1.5 ml 15%、25%和40%碘克沙醇溶液，构建用于AAV纯化的梯度。最后用裂解缓冲液补满梯度顶部。
5. 在Beckman Ti70.1转子中，4 °C条件下以50,000 K超速离心2小时。然后用70%乙醇清洁管壁外表面，在管顶插入针头通气，并用针头吸取1.2 ml 40%碘克沙醇组分。注意避免吸取25%组分，因其含有空的AAV衣壳。

5. 筛选与选择

1. 此时，可以在培养的细胞或动物体内对整个文库进行迭代扩增，直至出现具有理想特性的嵌合衣壳（图6-11).
2. 在培养细胞中进行筛选时，将文库的不同等份样品共同感染例如1、10 和 100 μl）以及腺病毒-5以支持AAV的增殖。由于无法预测文库在特定细胞类型中的感染效率，因此测试多种文库与腺病毒辅助系统的组合至关重要。感染约3天后收集细胞，通过冻融法提取扩增后的AAV，并在30分钟内将腺病毒灭活 56 °C 并重新感染新的细胞。重复此过程最多5次，直至明显富集衣壳（通过测序验证）。
3. 在动物中进行筛选时，用文库感染后约1周提取目标组织或细胞类型。不要与腺病毒共感染，因为这会导致动物产生不良毒性。使用与之前相同的引物通过PCR回收病毒DNA图 2），重新克隆 帽 混合，制备新的文库并重复，直至富集出明显的衣壳（通过测序验证）。
   1. 筛选的精确条件（体积、滴度、途径） 体内 将取决于所关注的目标组织。对于肝脏，小鼠通常感染 1x10¹¹ 至 1×10¹² 总反应体积中的病毒颗粒 200 μl 通过尾静脉注射 PBS（IV）。通常限制因素是原始制备物的病毒滴度，因为注射 1×10¹² AAV 在 200 μl 需要至少 5x10 的滴度¹²/毫升，并非所有实验室都能常规达到这一浓度。因此，尽管较高的滴度有利于首次感染（因为文库尚未在特定组织中富集出高效衣壳，整体感染效率可能相对较低），我们仍建议至少使用1×10¹¹ 每只小鼠用于肝脏筛选的颗粒数。
   2. 如果有多个小鼠可用，建议注射不同数量的颗粒，类似于培养细胞中的选择，并且每组使用多只小鼠（随后将每组收集的肝脏合并），以减少变异并提高成功率，例如每组3只小鼠，分别注射1×10¹¹ 以及3只小鼠在1×10¹² 颗粒
   3. 由于AAV是一种非致病性且无辅助病毒时无法复制的病毒，因此在不存在腺病毒的情况下，无需观察不良反应。
   4. 为实施安乐死，先使用异氟烷麻醉机对动物进行麻醉，随后通过颈椎脱位法处死。
   5. 在确认动物安乐死后，采集组织（本实验中为肝脏）。通常情况下，无需对动物进行灌注，也无需在动物死亡前采集AAV感染的器官，因为AAV DNA具有稳定性，可轻松从冷冻的细胞/组织中回收。
4. 为研究单个衣壳（来自文库（步骤3.6）或筛选后（步骤5.2–5.3）），制备编码报告基因的AAV载体（例如，gfp⁶）的操作步骤 4.1–4.5。因此，克隆 帽 目的基因插入标准AAV辅助质粒²在步骤4.1中，用三种质粒共转染细胞 14.7 μg 每种AAV载体（编码报告基因）、AAV辅助病毒和腺病毒辅助病毒。用纯化的病毒以不同剂量感染培养细胞或动物，并测定转导效率 例如 通过流式细胞术或显微镜检查。

6. 代表性结果

使用此处所述方案通常可获得多样性约为1x10的病毒文库⁶ 具有独特衣壳的病毒颗粒，随后可针对特定细胞系或动物体内展示大部分或全部理想特性的单个颗粒进行筛选。下文将提供此类实验结果的代表性示例 体外 或 体内 筛选。

然而在此之前，我们认为有必要再次强调分析原始质粒文库中单个克隆的功能性和多样性的重要性（可在步骤 3.6 中选择性执行）。这是因为后两个参数是成功筛选由质粒文库构建的实际病毒文库的至关重要的前提条件。因此，可随机挑选单个重排的 cap 基因，并利用其生成表达易于检测和定量的报告基因的重组 AAV 载体（粗提物或纯化的病毒颗粒，取决于所需的精确程度）。随后，比较不同衣壳变异体的典型检测方法是荧光显微镜分析，如 图 4 中的代表性示例所示。

另一种方法是基于流式细胞术（FACS）检测荧光报告基因的表达，该方法具有额外优势：既可测定单个细胞的基因表达水平，也可用于悬浮细胞。图5展示了利用基于FACS的方法分析多种细胞类型中粗制AAV载体裂解液的典型结果。

由于上述选择单个cap嵌合体的方法具有随机性和局限性，因此实际上并不适用于富集目标候选样本。相反，在动物的靶细胞或靶组织中对病毒文库进行筛选则更为合适。由于不同应用的条件和参数各不相同，我们仅简要介绍一些具有代表性的指导原则和结果。

最简便的筛选方法是在培养的细胞系或原代细胞中进行迭代文库扩增（步骤 5.2）。由于 AAV 的扩增需要腺病毒共感染，因此目标细胞必须对腺病毒具有易感性。随后即可培养并感染这些细胞 例如 在6孔板中培养，每孔需保证足够的细胞数量，以确保文库的完全覆盖。第二个重要概念是AAV与腺病毒之间的比例关系较为敏感：AAV过多会抑制腺病毒，而腺病毒过量则会在AAV复制之前导致细胞死亡（与AAV不同，腺病毒会引起裂解性感染）。

然而，由于文库在特定细胞类型中的感染效率未知，需要对文库与腺病毒辅助病毒的不同剂量组合进行平行测试，以确定两者均能有效扩增的“合适”AAV：腺病毒比例。例如，10:1、1:1 和 1:10）。腺病毒高效感染的良好指标是在病毒接种后三天出现细胞病变效应，表现为细胞变圆并脱落，如图所示 图 6. 反之亦然一种用于检测AAV感染和扩增的有效方法是通过Western blot检测衣壳蛋白，使用B1抗体识别高度保守的AAV衣壳表位（图7)⁷.

接下来一个重要决定是选择哪些粗提的 AAV 样品用于后续对新鲜细胞的再感染（步骤 5.2）。理想情况下，应选择 AAV 衣壳条带最不明显的样品（图 7），因为这表明基因型与表型之间的关联较为紧密。所谓紧密的基因型-表型关联，是指编码特定衣壳变体的基因组被实际包装进对应的衣壳之中。实现并维持这种紧密的基因型-表型关联对于成功筛选出单个病毒候选株至关重要，因为它可确保具有理想特性的衣壳在连续感染过程中将相应的遗传模板递送至细胞内。因此，我们建议选择衣壳表达量适中的粗提物用于再感染，并使用最小用量。这两项措施共同作用，可防止新感染的细胞被过多不同的衣壳/基因组组合所过载，否则当再感染的病毒开始复制并将其基因组重新包装进非对应衣壳时，可能会破坏原有的基因型-表型关联。

此外，通过DNA测序监测在多轮重复感染过程中文库多样性的变化至关重要。理想情况下，应观察到个别克隆组成发生改变，表明成功实现了筛选，即特定血清型片段富集而其他片段减少，如图8所示。在理想情况下，最终仅检测到少数甚至单一克隆，随后可按照上述方法进行分析。然而，若经过四到五次传代后仍未观察到克隆组成的变化，则应考虑增加筛选压力（见讨论部分），或考虑所使用的细胞系可能不适宜，因其可能对过多血清型过于敏感。

用于文库扩增 体内 （步骤5.3），相同的原则和考虑因素适用，但存在两个关键区别：首先，由于成本和伦理问题，不会在动物体内随机筛选克隆。其次，不会与辅助腺病毒共感染，因为辅助病毒会在动物体内引发毒性或致死效应，且腺病毒的嗜性会限制筛选仅限于易感辅助病毒的细胞。取而代之的是，将AAV文库注入动物体内，随后通过PCR从靶细胞/组织中回收图 9然后重新克隆并重新包装以进行新一轮感染。与培养中的筛选类似，此过程重复进行，直至获得单个候选克隆。

无论采用何种筛选方法，最后一步都是在适当的系统中验证富集后的衣壳变体。图10和图11展示了我们此前筛选腺相关病毒（AAV）嵌合体时获得的代表性结果，这些嵌合体在细胞培养或小鼠肝脏中均表现出优异性能。如图10所示，某一特定克隆（AAV-DJ³）在多种细胞系中均显著优于八种天然AAV野生型病毒。此外，在培养的肝癌细胞系中筛选出的另一克隆，在成年小鼠外周注射后对小鼠肝脏具有更高的趋向性，且脱靶效应较对照组强效的AAV8载体更低（图11）。需要注意的是，尽管AAV-DN对肝脏更具特异性，但其在该器官中的转导效率实际上略低于AAV8。在这方面，AAV-DN是AAV进化与筛选结果的一个典型代表：最终获得的候选载体通常具备多项理想特性，但未必在所有方面都达到完美。

图1. 示意图：通过DNA家族混编及后续在细胞或动物中筛选，实现合成AAV衣壳的工程化改造。方案步骤以灰色高亮显示。

图2. AAV 帽 本实验室用于DNA家族改组和文库构建的基因供体质粒与受体质粒。需注意，此处仅列出代表性示例，具体位点和序列可根据需要定制。我们的基础供体质粒源自 commercially available pBlueScript II KS(+) 载体，经改造后含有图示的引物结合位点以及限制性酶切位点，分别以箭头和三角形表示。随后我们克隆了 帽 AAV血清型1-9的基因（使用引物capF/R扩增）插入该质粒，使其两侧被 Pac I 和 Asc I 限制性酶切位点。引物 T3 和 T7 用于 帽 在步骤2.2中进行分离，而重新组装的嵌合序列的后续扩增（步骤3.2）可使用引物对SAF/R或CUF/R，或两者结合进行巢式PCR。具有复制能力的受体质粒携带AAV反向末端重复序列（ITRs，复制与包装信号），其两侧为在AAV p5启动子控制下的AAV2 rep基因。 Pac I 和 Asc I 下游的 rep 限制性酶切位点可用于对重排文库进行“同框”克隆 帽 基因。所示的Lseq引物结合位点是有用的 帽 基因测序（步骤 3.6）。

图3. cap 基因（AAV2、8 和 9）的 DNase I 消化示例。图中显示了使用不同孵育时间（以分钟:秒表示）消化 cap 基因后产物的琼脂糖凝胶电泳分析结果。泳道 U 为未经消化的输入 cap 片段混合物，作为对照。泳道 M 中 DNA 标记条带的大小以千碱基（kb）表示。在此示例中，孵育时间为 1:45 或 2:00 分钟时获得理想的消化效果，产生主要集中在 100 至 500 个碱基对之间的主峰（黄色框内）。

图4. 利用基于AAV2、AAV8和AAV9原始文库中随机选择的重排cap基因构建的五种不同表达Yfp的重组AAV载体（顶部为名称），对三种人类细胞系进行基于显微镜分析的示例。

图 5. 基于流式细胞术（FACS）分析四种细胞类型感染（按连续十倍稀释）18种不同表达Yfp的重组AAV载体（顶部标注名称，包括来自图 4的载体）的示例，这些载体使用从原始文库（AAV2、8和9）中随机选择的重排cap基因制备。Yfp表达水平采用颜色编码以便于可视化。图中显示的是转导细胞的百分比，其中黑色始终代表0%，白色代表每种细胞类型中测得的最高值。克隆B2（红色）代表整体效能较差的克隆，这在未经筛选的衣壳中可以预期。请注意，流式细胞术分析更为敏感，也可用于对显微镜观察不敏感的悬浮细胞（如SupT1）。hu，人源；mu，鼠源。

图6. AAV与腺病毒 productive 共感染后，细胞（本例为HeLa细胞）中细胞病变效应的典型形态。细胞未感染（左上图）或以指定数量（每个细胞的病毒颗粒数）的腺病毒感染。

图 7. 通过 Western blot 检测 AAV 衣壳蛋白表达，用于评估文库感染与扩增效果。左侧印迹显示细胞共感染了不同体积（以 μl 计）的 AAV 文库和辅助腺病毒。前两道是 AAV 蛋白表达 barely detectable 的良好示例，表明 AAV 感染与扩增程度适中，既充分又不过度，从而实现了理想的基因型-表型紧密关联。因此，将这些上清液的 0.1、1 或 10 μl 用于再次感染新鲜细胞（右侧印迹）。C 道细胞仅感染 AAV，作为阴性对照（由于缺乏辅助病毒，无可见表达）。

图8. 基于AAV2、AAV8和AAV9构建的文库中AAV克隆在筛选前后蛋白质序列的比对（数字表示氨基酸位置）。红色线条上方的序列为亲本AAV序列。紫色箭头表示同源重组事件。红色箭头标记了在所有筛选获得的克隆中均发现的AAV2与AAV9之间的交叉位点。

图9. 通过PCR从小鼠组织中回收成功感染的AAV克隆。在此示例中，使用引物对SAF/R（图2）从小鼠肝脏中提取基因组DNA，并在周围组织文库灌注一周后扩增AAV cap 基因。泳道1显示预期的2.2 kb条带，泳道2为无模板对照。经Pac I 和 Asc I 限制性酶切后，将扩增的片段重新克隆至原始受体质粒（图2）中，用于后续次级文库的构建与再灌注。泳道M中DNA标记物条带的大小以kb表示。

图10. 富集获得的AAV嵌合体在培养细胞中表现出更优性能的示例。克隆AAV-DJ此前已被我们报道过³；它主要为AAV血清型2、8和9的杂交体，是从包含这三种及另外五种血清型的文库中，在人肝细胞中以混合人抗血清存在条件下筛选获得的。为将其效率与八种天然AAV血清型（上方标注为1-6、8和9）进行比较，所有cap基因均用于制备纯化的自互补Gfp表达载体^8,19。这些载体经标准化处理，使其每毫升含有2×10⁹个病毒基因组，随后以十倍系列稀释法用于转导所示细胞系。三天后，统计表达Gfp的细胞数量，并结合稀释倍数计算感染性滴度。与图5中的编码方式相反，此处颜色越深表示每个病毒粒子的感染性越高。显然，所选的AAV-DJ嵌合体优于所有天然AAV野生型，体现了所采用筛选策略的成功。fibr，成纤维细胞；ha，仓鼠；hu，人；mu，小鼠；si，猴。

图11. 在小鼠肝脏中分析选定AAV嵌合体的示例。克隆AAV-DN在小鼠肝癌细胞上筛选获得，随后用于生产表达luciferase的重组载体⁸。图中显示的是外周输注等剂量该载体或基于野生型AAV8的对照载体后一周的小鼠代表性图像（每组三只），野生型AAV8是目前已知在小鼠肝脏中转导效率最高的天然分离株之一⁹。需要注意的是，尽管AAV-DN克隆在肝脏中的总体表达略低（图（I）），但其对肝脏的靶向特异性更高，因为在通过成像软件校正肝脏表达水平后，其在非肝组织中的脱靶表达显著减少（图（II））。

讨论

本文概述了通过DNA家族改组技术进行AAV衣壳工程改造，以及在细胞或动物体内进行进化的关键实验步骤和指导原则。本质上，这些方案是我们于2008年首次在AAV领域报道的实验流程的标准化版本³。尽管此后许多后续研究报道了大量改进方法e.g.，^10-13，我们目前提供的版本仍代表了可重复、易于放大并可根据不同需求进行调整的基础性策略。

尽管我们努力对整个实验流程进行标准化，但某些步骤仍需通过试错法进行优化。这尤其适用于cap基因的片段化，因为DNase I对反应条件（如孵育时间）极为敏感（参见图3中的示例）。我们获得的最佳起始片段长度范围为100至500个碱基对，因此建议尝试多种DNase反应条件（例如，酶的用量和孵育时间），直至凝胶电泳结果与图3中加框的泳道相似为止。

在细胞培养过程中，对文库筛选的各个步骤进行完全标准化同样是不可能的。如前所述，一个关键问题是新文库或...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DNase I	Invitrogen	18068-015
聚乙烯亚胺（PEI）	Sigma-Aldrich	408727
限制性内切酶	New England Biolabs	多种
T4 DNA 连接酶	New England Biolabs	M0202T
凝胶回收试剂盒	Qiagen	28704
Phusion II 聚合酶试剂盒	Finnzymes	F-540S
HotStar Hifi 聚合酶试剂盒	Qiagen	202602
DMSO	Finnzymes	F-540S（试剂盒组分）
EDTA（25 mM）	Invitrogen	18068-015（试剂盒组分）
Tris	Carl Roth Gmbh	4855.2
氨苄青霉素钠盐	Carl Roth Gmbh	K029.2
dNTPs（10 mM，100 μl）	Invitrogen	18427013
碘克沙醇（OptiPrep）	Axis-Shield	1114739
酚红	Merck & Co., Inc.	107241
质粒大提试剂盒	Qiagen	12181
超速离心机	Beckman Coulter Inc.	Optima L90K
Quick-Seal 离心管	Beckman Coulter Inc.	342414
电穿孔仪	Bio-Rad	GenePulserXcell
PCR 仪	Eppendorf	Vapo Protect
加热金属块	BIOER	MB-102
荧光显微镜	Olympus Corporation	IX81
FACS 分析仪	Beckman Coulter Inc.	Cytomics FC500 MLP
MegaX DH10B T1R 感受态细胞	Invitrogen	C640003
苯甲酸酶（Benzonase）	Merck & Co., Inc.	101695
腺病毒-5	ATCC	VR-5
pBlueScript II KS(+) 质粒	Stratagene, Agilent Technologies	212207
cap5F（黄色标注 Pac I 位点，加粗部分为 cap5 特异性序列）：GACTCTTAATTAACAGGTATGTCTTTTGTTGATCACCCTCC	IDT	定制引物
cap5R（绿色标注 Asc I 位点，加粗部分为 cap5 特异性序列）：GTGAGGGCGCGCCTTAAAGGGGTCGGGTAAGGTATC	IDT	定制引物