我们展示了通过DNA家族洗牌技术对合成腺相关病毒（AAV）基因治疗载体进行分子设计与定向进化的基本方法。此外，我们还提供了在培养细胞或小鼠中筛选和分析具有增强特性的单个嵌合衣壳的一般性指导原则及代表性实例。
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方法文章
通过DNA家族混编技术构建与进化合成腺相关病毒（AAV）基因治疗载体
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
腺相关病毒（AAV）载体因其独特的有益特性组合，被认为是目前最有效且最具前景的人类基因治疗递送工具之一1包括基础野生型病毒的非致病性，以及用于生产高滴度、高纯度和临床级重组载体的成熟先进方法2腺相关病毒系统相较于其他病毒的另一显著优势在于，存在大量天然的血清型，这些血清型在关键特性上各不相同，但均可通过同一通用方案轻松改造为载体。1,2此外，包括我们研究组在内的多个团队近期已设计出策略，利用这些天然病毒作为模板，构建合成载体，这些载体可整合多种输入血清型的优点，或增强单一分离株的特性。实现这些目标的相关技术主要包括DNA家族洗牌3, 即 基于部分同源性（通常）对各种 AAV 衣壳基因进行片段化，随后重新组装 >80%（大多数AAV血清型），或肽段展示4,5, 即 将通常由七个氨基酸组成的肽段插入病毒衣壳的暴露环区，该肽段可理想地介导对特定目标细胞类型的重定向。为了获得最佳效果，这两种方法均以高通量方式进行，即对实验流程进行放大，以构建包含约一百万个不同衣壳变异体的文库。每个克隆要么包含多个亲本病毒的独特组合（DNA家族改组法），要么在同一病毒骨架中携带不同的展示肽段（肽段展示法）。后续的最终步骤是在目标细胞上对文库进行多轮迭代筛选，以富集满足筛选过程大部分甚至全部条件的个别衣壳。该筛选过程优选结合正向选择压力（例如在特定目标细胞类型上的扩增能力）与负向筛选（例如清除所有能与抗AAV抗体发生反应的衣壳）。这种组合策略提高了最终筛选出的合成衣壳满足特定应用需求的可能性，而此类衣壳在自然界存在的AAV分离株中几乎不可能被发现。本文重点介绍两种技术中理论和实验难度更高的DNA家族改组法，详细描述并演示构建与筛选改组AAV文库所需的全部关键步骤。图1），然后讨论在进行分子AAV进化时，为确保成功而需要注意的实验方案中的陷阱与关键要点。
方案
1. 编码 AAV 衣壳基因的质粒组的制备
- 为了便于常规制备足量的各种 AAV 衣壳帽) 基因用于后续的DNA改组，首先将这些基因亚克隆至一个共用的质粒骨架中。需包含相同的侧翼序列 >20个核苷酸，用于后续巢式PCR的引物结合位点及克隆图 2).
- 使用合适的引物（参见下表中针对 AAV5 的示例引物），通过 PCR 扩增目标片段 帽 通常包含AAV2的常用AAV质粒中的基因 rep 基因旁边的 帽 目的基因。由于PCR产物将用于标准克隆，约1 μg 纯化产物的量已足够，因此可采用任何常规PCR方案。
- 消化纯化的PCR产物（例如，使用琼脂糖凝胶纯化或标准PCR纯化试剂盒）以及含有与引物中所用识别位点相对应的限制性内切酶的受体质粒 帽 扩增（1.1）以及在受体质粒中。在我们的实验室中，我们使用 Pac I 和 Asc I 位点（图 2因为它们在大多数AAV中不存在。
2. 基于DNase的Cap基因片段化
- 从步骤1.1–1.3中构建的质粒中PCR扩增所选的cap基因。如下所述的一次反应可产生约3 μg的PCR产物。根据文库中拟包含的
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讨论
本文概述了通过DNA家族改组技术进行AAV衣壳工程改造，以及在细胞或动物体内进行进化的关键实验步骤和指导原则。本质上，这些方案是我们于2008年首次在AAV领域报道的实验流程的标准化版本3。尽管此后许多后续研究报道了大量改进方法e.g.，10-13，我们目前提供的版本仍代表了可重复、易于放大并可根据不同需求进行调整的基础性策略。
尽管我们努力对整个实验流程进行标准化，但某些步骤仍需通过试错法进行优化。这尤其适用于cap基因的片段化，因为DNase I对反应条件（如孵育时间）极为敏感（参见图3中的示例）。我们获得的最佳起始片段长度范围为100至500个碱基对，因此建议尝试多种DNase反应条件（例如，酶的用量和孵育时间），直至凝胶电泳结果与图3中加框的泳道相似为止。
在细胞培养过程中，对文库筛选的各个步骤进行完全标准化同样是不可能的。如前所述，一个关键问题是新文库或.......
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披露
所有作者均声明无任何利益冲突。
致谢
作者衷心感谢海德堡大学卓越细胞网络集群（Cluster of Excellence CellNetworks）以及奇卡和海因茨·夏勒（Chica and Heinz Schaller, CHS）基金会对本实验室、团队成员及研究工作的大力支持。我们注意到，自三年前我们首次发表相关成果以来，通过DNA家族重排进行腺相关病毒（AAV）分子进化的研究已发展成为一个极为活跃的领域，因此，由于篇幅限制未能在此引用所有相关研究者的文献，我们深表歉意。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DNase I | Invitrogen | 18068-015 | |
| 聚乙烯亚胺（PEI） | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| 限制性内切酶 | New England Biolabs | 多种 | |
| T4 DNA 连接酶 | New England Biolabs | M0202T | |
| 凝胶回收试剂盒 | Qiagen | 28704 | |
| Phusion II 聚合酶试剂盒 | Finnzymes | F-540S | |
| HotStar Hifi 聚合酶试剂盒 | Qiagen | 202602 | |
| DMSO | Finnzymes | F-540S（试剂盒组分） | |
| EDTA（25 mM） | Invitrogen | 18068-015（试剂盒组分） | |
| Tris | Carl Roth Gmbh | 4855.2 | |
| 氨苄青霉素钠盐 | Carl Roth Gmbh | K029.2 | |
| dNTPs（10 mM，100 μl） | Invitrogen | 18427013 | |
| 碘克沙醇（OptiPrep） | Axis-Shield | 1114739 | |
| 酚红 | Merck & Co., Inc. | 107241 | |
| 质粒大提试剂盒 | Qiagen | 12181 | |
| 超速离心机 | Beckman Coulter Inc. | Optima L90K | |
| Quick-Seal 离心管 | Beckman Coulter Inc. | 342414 | |
| 电穿孔仪 | Bio-Rad | GenePulserXcell | |
| PCR 仪 | Eppendorf | Vapo Protect | |
| 加热金属块 | BIOER | MB-102 | |
| 荧光显微镜 | Olympus Corporation | IX81 | |
| FACS 分析仪 | Beckman Coulter Inc. | Cytomics FC500 MLP | |
| MegaX DH10B T1R 感受态细胞 | Invitrogen | C640003 | |
| 苯甲酸酶（Benzonase） | Merck & Co., Inc. | 101695 | |
| 腺病毒-5 | ATCC | VR-5 | |
| pBlueScript II KS(+) 质粒 | Stratagene, Agilent Technologies | 212207 | |
| cap5F（黄色标注 Pac I 位点，加粗部分为 cap5 特异性序列）：GACTCTTAATTAACAGGTATGTCTTTTGTTGATCACCCTCC | IDT | 定制引物 | |
| cap5R（绿色标注 Asc I 位点，加粗部分为 cap5 特异性序列）：GTGAGGGCGCGCCTTAAAGGGGTCGGGTAAGGTATC | IDT | 定制引物 |
参考文献
- Grimm, D., Kay, M. A. From virus evolution to vector revolution: use of naturally occurring serotypes of adeno-associated virus (AAV) as novel vectors for human gene therapy. Curr. Gene Ther. 3, 281-304 (2003).
- Grimm, D.
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