表达黄色荧光蛋白的小鼠脑组织透明化后的多光子显微成像

摘要

通过在成像前对器官进行光学透明化处理，可实现对整只小鼠器官的多光子显微成像，但并非所有方案都能保留荧光蛋白的荧光信号。我们采用基于乙醇脱水和苯甲醇：苯甲酸苄酯透明化的光学透明方法，展示了表达黄色荧光蛋白（YFP）的整只小鼠脑组织的高分辨率多光子图像。

摘要

通过在成像前对器官进行光学透明化处理，可实现对完整小鼠器官的多光子显微成像，包括其内在荧光和二次谐波产生（SHG）信号^1,2。然而，对于表达荧光蛋白（如GFP和YFP）的器官，若采用甲醇脱水并以苯甲醇:苯甲酸苄酯（BABB）进行透明化且未避光处理的光学透明化方案³，则无法有效保留荧光信号。本文所介绍的方案是一种可在保持神经元中表达的YFP荧光信号的同时，对小鼠脑组织进行全器官光学透明化的新方法。研究发现，将脱水步骤改为使用梯度乙醇系列进行，可显著减少对荧光蛋白的损伤，从而在多光子成像中有效保留其荧光信号⁴。通过优化光学透明化流程，采用基于乙醇的脱水步骤、避光条件下使用BABB进行透明化处理，我们获得了小鼠脑组织表面下超过2 mm深处神经元中黄色荧光蛋白（YFP）表达的高分辨率多光子图像。

方案

1. 动物灌注⁵与完整小鼠脑组织透明化

1. 整个操作过程的时长可能因每步脱水处理所用时间不同而有所变化，但总体而言，整个流程可在两天内完成。
2. 称量YFP小鼠体重，随后通过腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪（100 mg/kg : 10 mg/kg）进行深度麻醉。
3. 在开始手术前，确认小鼠已达到外科手术所需的深度麻醉状态。每5分钟检查一次动物，观察其对脚趾或尾部施加有力夹捏是否有反应。若动物出现反应，则需追加剂量（为初始剂量的1/3）的氯胺酮/赛拉嗪。
4. 待小鼠深度麻醉后，使用实验室胶带将各肢体固定于手术台上，使小鼠呈仰卧位（背侧卧位），暴露胸部以进行手术。手术台通常由金属或塑料网制成，并置于水槽内或带边沿的托盘上，以便于收集血液和固定液废液。
5. 开始时，在剑突下方做一切口。使用剪刀和镊子沿肋骨基部剪开皮肤，并在切割过程中将其向两侧拉开。沿小鼠胸骨两侧（穿过肋骨）各做切口，形成一个组织瓣，用止血钳将其从胸腔移开，从而暴露心脏。
6. 将23号针头插入心脏左心室，并在右心房的肌壁上做一个小切口，以允许血液流出。有关该操作的视频，请参见JoVE文章2497。⁵
7. 右心房切开后，立即开始用4 °C磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.2）灌注，直至右心房不再有血液流出（约30–40 ml，流速约为5 ml/min）。
8. 当血液完全排净（从右心房流出的液体变为澄清）后，将灌注液更换为预冷的4%多聚甲醛（PFA）溶液。继续灌注至小鼠身体明显变僵硬且触感冰凉（约30–40 ml，流速约为5 ml/min）。（浓缩的16% PFA溶液按制造商说明稀释，并加入NaOH调节至pH 7.2。操作时需佩戴手套和实验服，并在通风橱内处理和混合化学品。）
9. 灌注完成后，将小鼠从手术台上取下并断头，开始脑组织的切除。
10. 使用镊子和虹膜剪，从颅骨后部开始向前逐步小片去除颅骨。每隔2–4 mm用剪刀在颅骨上做小切口，同时用镊子小心地将骨片一小块一小块地从脑组织上剥离。重复此操作，直至整个脑表面完全暴露。
11. 使用宽度为5 mm的扁平刮铲将脑组织从颅骨中取出，并放入玻璃小瓶中。将其浸入4% PFA溶液中，在4 °C条件下后固定6小时。
12. 后固定完成后，将脑组织在室温PBS中清洗两次：先将玻璃小瓶中的PFA倒出，替换为PBS，轻轻摇晃使脑组织在PBS中充分混合，随后倒出并再次更换PBS进行第二次清洗。
13. 在室温下通过梯度乙醇孵育对脑组织进行脱水处理（依次为50%、70%、95%各一次，100%两次），每次孵育2小时，第二次100%乙醇孵育持续12小时，以从固定组织中彻底去除水分。每次孵育时，将玻璃小瓶中原有的乙醇溶液倒出，并替换为下一浓度的溶液，确保脑组织完全浸没。
14. 第二次100%乙醇孵育结束后，倒出溶液，替换为等体积的乙醇与含苯甲醇和苯甲酸苄酯的透明溶液（体积比1:2）。孵育2小时后，倾去该溶液，再替换为100%的苯甲醇和苯甲酸苄酯溶液（体积比1:2）。该透明溶液的折射率为n = 1.54。
15. 一旦置于BABB溶液中，脑组织将在4–5小时内明显变得透明。为获得最佳透明效果，建议将脑组织在室温避光条件下继续透明处理6天。

2. 显微镜设置

1. 当脑组织透明化完成并准备成像时，使用氰基丙烯酸酯将其固定在培养皿底部。在继续操作前，让粘合剂充分干燥。
2. 干燥后，将脑组织浸入BABB溶液中，并将培养皿置于显微镜物镜下进行成像。
3. 我们使用一台配备Mai Tai钛宝石激光器的多光子显微镜，激发波长可调范围为710 nm至990 nm。用于生成YFP信号的激发波长为886 nm。激光功率根据成像深度在30 - 100 mW之间调整。
4. 使用尼康5X物镜（数值孔径0.5）采集反射荧光信号，该物镜支持大视野成像（2 × 2 mm）。
5. 采用535/50带通滤光片对反射荧光信号进行过滤，并使用GaAsP PMT（H7422PA-40，Hamamatsu，Bridgewater，New Jersey）进行信号采集。
6. 使用ScanImage软件以2048 × 2048像素分辨率进行图像采集，扫描速率为每行2 ms，以生成高分辨率的YFP图像⁶。
7. 成像完成后，使用镊子将脑组织从培养皿中取出，并置于避光的BABB溶液中保存，以备后续成像使用。对于胶粘的样品，用剃须刀片以不超过30度的角度在胶水与培养皿之间轻轻分离组织。我们已将样品在BABB中保存长达1年，未观察到明显降解。

3. 代表性结果

此处展示的代表性图像和视频演示了光学透明化技术实现的高分辨率多光子成像能力。全脑成像使得海马体和皮层不同层中YFP标记的神经元在组织表面下深达2 mm处仍清晰可见。图1显示了一幅代表性的冠状面图像，对应于颅骨缝前点（bregma）后方2.92 mm处海马体的解剖特征⁷。该样本的成像深度为1.94 mm。这一差异部分是由于在脑组织尾端切除了小脑，其余差异则源于脱水过程引起的组织收缩。图像堆栈中的另一幅图像显示了新皮层第V/VI层表达YFP的锥体神经元，位于组织表面下2 mm处（图2）。所有图像均使用尼康5倍物镜采集，并通过ScanImage软件中的数字变焦功能进行放大。

通过放大新皮层，可清晰分辨新皮层第V层锥体神经元的单个轴突和神经元胞体，深度可达组织表面下1.02 mm（图3）。利用图3中的图像序列，通过ImageJ软件⁸对神经元区域进行了三维重建（图4）。

多光子显微镜（MPM）的高分辨率能力还使我们能够呈现完整单个神经元的图像。此处展示的是新皮层第五层锥体神经元的重建图像，其中单个树突结构清晰可见（图5）。

图1. 小鼠全脑1.2 mm图像堆栈（组织表面下0.8 - 2 mm）的代表性图像，显示新皮层及海马的不同分层。海马结构在组织表面下1.1 mm处可见，并使用以下代码进行标注：DG = 齿状回，GrDG = DG颗粒层，Lmol = 棘层分子层，Mol = DG分子层，Or = 锥体层，PoDG = DG多形层，Py = 锥体细胞层，Rad = 辐射层。⁷ 图像尺寸为1.8 × 1.8 mm，比例尺 = 200 μm。将脑部前端固定于培养皿，后端朝上朝向物镜，便于在冠状面进行成像。

图2. 小鼠全脑组织表面下0.8–2 mm范围内1.2 mm图像堆栈的代表性图像帧，突出显示新皮层区域。在组织表面下2 mm处，可见皮层第V/VI层表达YFP的锥体细胞及其突起。标记程度与先前关于新皮层稀疏标记的报道一致⁹。右上角插图为左侧方框区域的放大图像。图像尺寸为1.8 × 1.8 mm，比例尺 = 200 μm（插图比例尺 = 50 μm）。

图3. 从大脑新皮层第V层锥体神经元图像序列中获取的代表性图像帧，深度为组织表面下774 μm。图像序列的深度范围为组织表面下700 μm至1,020 μm。采用8倍数字放大以捕捉精细突起等细节。图像尺寸为225 × 225 μm，比例尺 = 20 μm。

图4. 三维重建的代表性图像（225 × 225 × 320 μm图像堆栈的） 图3. 图像尺寸为 225 x 225 μm 大小，比例尺 = 28 μm.

图 5. 使用10倍数字放大重建的新皮层第V层锥体神经元高分辨率图像。神经元长度为485 μm，比例尺 = 25 μm。每张图像图块的视野为180 μm × 180 μm。每个图块位于不同的深度（z层面）。皮层顶端树突通常不如同胞体那样强烈表达YFP。为了在同一视野中同时显示两者（如此处所示），需降低激光功率以避免胞体信号饱和；这会使细微结构显得较暗。本图的重点在于展示视野范围，而非精细结构。如需揭示更细微的结构，请使用数字放大，选择无胞体的区域进行聚焦，并提高激光功率。

讨论

尽管标准有机染料可与多种有机溶剂兼容，因此在透明化方案中不会带来特殊挑战，但荧光蛋白通常对溶剂变化的耐受性较低。⁴ 本研究旨在克服以往光学透明化方案中的一个严重局限，即XFPs的荧光信号会丢失或严重降解。本文展示的图像表明，YFP的荧光得以保留。此处描述的光学透明化技术可实现对完整小鼠大脑中YFP标记神经元的高分辨率成像，成像深度可达组织表面下2 mm。如先前研究所示，采用乙醇脱水也可有效保留绿色和红色荧光蛋白信号。⁴ 本文展示的图像说明了该光学透明化技术如何应用于研究表达荧光蛋白的整个器官区域，例如海马体或新皮层。多光子显微镜的高分辨率能力还可对器官区域内特定细胞或感兴趣区域进行清晰放大。为保留蛋白质荧光，关键要点包括：避免过度固定，确保固定液及所有溶液维持在接近中性的pH值，使用乙醇而非甲醇进行脱水，以及将样品避光保存。

尽管本文展示了光学透明化技术在小鼠脑成像中的应用，但该技术通常适用于大多数器官。本研究中，我们获得了整个小鼠脑区（新皮层和海马）的高分辨率图像，以及新皮层第V层内特定神经元的图像（Thy1-YFPH小鼠品系标记了海马...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
磷酸盐缓冲液	Sigma-Aldrich, Inc.	D8537	500 ml, pH 7.2
多聚甲醛	Electron Microscopy Sciences	15710	10 x 10 ml, 16% 多聚甲醛
乙醇	American Bioanalytical	AB00515-00500	500 ml, 200 proof
乙醇	Pharmco Products, Inc.	111000190	1 gal., 190 proof
苯甲醇	Sigma-Aldrich, Inc.	402834	500 ml, 99+%
苯甲酸苄酯	Sigma-Aldrich, Inc.	B6630-IL	500 ml, ≥ 99%
5X/0.5 NA 物镜	Nikon	AZ Plan Flour 5X	15 WD