表达黄色荧光蛋白的小鼠脑组织透明化后的多光子显微成像

摘要

通过在成像前对器官进行光学透明化处理，可实现对整只小鼠器官的多光子显微成像，但并非所有方案都能保留荧光蛋白的荧光信号。我们采用基于乙醇脱水和苯甲醇：苯甲酸苄酯透明化的光学透明方法，展示了表达黄色荧光蛋白（YFP）的整只小鼠脑组织的高分辨率多光子图像。

摘要

通过在成像前对器官进行光学透明化处理，可实现对完整小鼠器官的多光子显微成像，包括其内在荧光和二次谐波产生（SHG）信号^1,2。然而，对于表达荧光蛋白（如GFP和YFP）的器官，若采用甲醇脱水并以苯甲醇:苯甲酸苄酯（BABB）进行透明化且未避光处理的光学透明化方案³，则无法有效保留荧光信号。本文所介绍的方案是一种可在保持神经元中表达的YFP荧光信号的同时，对小鼠脑组织进行全器官光学透明化的新方法。研究发现，将脱水步骤改为使用梯度乙醇系列进行，可显著减少对荧光蛋白的损伤，从而在多光子成像中有效保留其荧光信号⁴。通过优化光学透明化流程，采用基于乙醇的脱水步骤、避光条件下使用BABB进行透明化处理，我们获得了小鼠脑组织表面下超过2 mm深处神经元中黄色荧光蛋白（YFP）表达的高分辨率多光子图像。

方案

1. 动物灌注⁵与完整小鼠脑组织透明化

1. 整个操作过程的时长可能因每步脱水处理所用时间不同而有所变化，但总体而言，整个流程可在两天内完成。
2. 称量YFP小鼠体重，随后通过腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪（100 mg/kg : 10 mg/kg）进行深度麻醉。
3. 在开始手术前，确认小鼠已达到外科手术所需的深度麻醉状态。每5分钟检查一次动物，观察其对脚趾或尾部施加有力夹捏是否有反应。若动物出现反应，则需追加剂量（为初始剂量的1/3）的氯胺酮/赛拉嗪。
4. 待小鼠深度麻醉后，使用实验室胶带将各肢体固定于手术台上，使小鼠呈仰卧位（背侧卧位），暴露胸部以进行手术。手术台通常由金属或塑料网制成，并置于水槽内或带边沿的托盘上，以便于收集血液和固定液废液。
5. 开始时，在剑突下方做一切口。使用剪刀和镊子沿肋骨基部剪开皮肤，并在切割过程中将其向两侧拉开。沿小鼠胸骨两侧（穿过肋骨）各做切口，形成一个组织瓣，用止血钳将其从胸腔移开，从而暴露心脏。
6. 将23号针头插入心脏左心室，并在右心房的肌壁上做一个小切口，以允许血液流出。有关该操作的视频，请参见JoVE文章2497。⁵
7. 右心房切开后，立即开始用4 °C磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.2）灌注，直至右心房不再有血液流出（约30–40 ml，流速约为5 ml/min）。
8. 当血液完全排净（从右心房流出的液体变为澄清）后，....

讨论

尽管标准有机染料可与多种有机溶剂兼容，因此在透明化方案中不会带来特殊挑战，但荧光蛋白通常对溶剂变化的耐受性较低。⁴ 本研究旨在克服以往光学透明化方案中的一个严重局限，即XFPs的荧光信号会丢失或严重降解。本文展示的图像表明，YFP的荧光得以保留。此处描述的光学透明化技术可实现对完整小鼠大脑中YFP标记神经元的高分辨率成像，成像深度可达组织表面下2 mm。如先前研究所示，采用乙醇脱水也可有效保留绿色和红色荧光蛋白信号。⁴ 本文展示的图像说明了该光学透明化技术如何应用于研究表达荧光蛋白的整个器官区域，例如海马体或新皮层。多光子显微镜的高分辨率能力还可对器官区域内特定细胞或感兴趣区域进行清晰放大。为保留蛋白质荧光，关键要点包括：避免过度固定，确保固定液及所有溶液维持在接近中性的pH值，使用乙醇而非甲醇进行脱水，以及将样品避光保存。

尽管本文展示了光学透明化技术在小鼠脑成像中的应用，但该技术通常适用于大多数器官。本研究中，我们获得了整个小鼠脑区（新皮层和海马）的高分辨率图像，以及新皮层第V层内特定神经元的图像（Thy1-YFPH小鼠品系标记了海马.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
磷酸盐缓冲液	Sigma-Aldrich, Inc.	D8537	500 ml, pH 7.2
多聚甲醛	Electron Microscopy Sciences	15710	10 x 10 ml, 16% 多聚甲醛
乙醇	American Bioanalytical	AB00515-00500	500 ml, 200 proof
乙醇	Pharmco Products, Inc.	111000190	1 gal., 190 proof
苯甲醇	Sigma-Aldrich, Inc.	402834	500 ml, 99+%
苯甲酸苄酯	Sigma-Aldrich, Inc.	B6630-IL	500 ml, ≥ 99%
5X/0.5 NA 物镜	Nikon	AZ Plan Flour 5X	15 WD