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离体肺切除标本的光学频率域成像：实现图像与组织病理学一对一相关性

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DOI：

10.3791/3855

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2013年1月22日

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1Department of Pathology, Harvard Medical School, 2Massachusetts General Hospital, 3Wellman Center for Photomedicine, Harvard Medical School, 4Pulmonary and Critical Care Unit, Massachusetts General Hospital, 5Pulmonary and Critical Care Unit, Harvard Medical School

本文内容

摘要

一种成像方法 离体 通过光学频率域成像（OFDI）对肺切除标本进行成像，并实现与组织病理学的精确对应，该方法对于建立肺部病理特异性的OFDI解读标准至关重要。此技术可推广应用于其他组织类型及成像技术，以获得精确的影像与组织病理学对应关系，从而实现准确的图像解读与评估。利用该技术建立的影像判读标准，可进一步用于未来影像评估研究。 体内 研究。

摘要

肺癌是癌症相关死亡的首要原因1。鳞状细胞癌和小细胞癌通常发生在中央气道区域，而腺癌则多位于肺的外周部位。由于多种限制因素，在疾病早期阶段检测肺部恶性肿瘤可能较为困难：包括影像学分辨率有限、支气管镜难以评估气道黏膜下组织并识别早期病理改变，以及组织活检样本量小和/或取样不完整等问题。高分辨率成像技术（如光学频率域成像，OFDI）可实时提供接近2 mm深度的组织微结构无损、大范围三维图像（图1）2-6。OFDI已被应用于多种临床场景，包括冠状动脉粥样硬化6,7以及食管肠上皮化生和异型增生的评估6,8-10。

支气管镜OCT/OFDI已被证实为一种安全的in vivo成像工具，可用于评估肺气道11-23（动画）。OCT已在动物模型的肺气道16,23和肺实质17,22以及人体in vivo气道14,15中得到评估。对正常气道的OCT成像已能够显示气道分层结构及肺泡附着，且对异型增生病变的评估有助于区分支气管黏膜中不同级别的异型增生11,12,20,21。支气管黏膜的OFDI成像已在一段较短的支气管节段（0.8 cm）中实现18。此外，已有研究报道了在猪和人体肺气道中in vivo实现跨越多个气道分支代数的三维OFDI成像19。支气管内OCT/OFDI通常采用细而柔韧的导管进行，这类导管可与标准支气管镜的介入端口兼容。此外，近年来已开发出基于针状探头的OCT和OFDI技术，可用于成像气道壁或胸膜表面以外的肺部区域17。

尽管OCT/OFDI已被应用并证明可用于体内肺部成像，但目前尚无精确匹配的一对一OFDI与组织病理学对照研究。因此，各类肺部疾病的特异性影像学诊断标准尚未建立。在体内获取的组织病理学样本仅由微小的活检碎片组成，难以与大范围的OFDI数据进行准确对应。此外，这些样本也无法提供与大体积OFDI图像配准所需的完整组织学信息。因此，在体内环境下无法建立肺部病变的特异性影像特征。精确匹配的一对一OFDI与组织病理学对照对于准确评估OFDI图像特征至关重要，需以组织病理学作为金标准，从而建立针对肺部肿瘤及其他肺部疾病的特异性影像解读标准。一旦通过离体条件下精确匹配的一对一组织病理学验证确立了特异性影像标准，这些标准便可应用于体内成像研究。本文介绍了一种在离体肺切除标本中实现高分辨率光学成像与组织病理学之间精确一对一关联的方法。本论文中详细描述了将OFDI图像与组织病理学图像进行匹配的技术流程。然而，该方法并不局限于OFDI，亦可用于其他任何光学成像技术，以获得与组织病理学配准的图像。我们采用一种特制的专用支气管镜2.4 French（0.8 mm直径）导管进行以气道为中心的OFDI成像。组织样本使用组织染料标记，该染料在OFDI和组织病理学图像中均可识别。通过严谨的定位操作，精确匹配成像区域与组织学取样位置。本论文所述技术已被用于首次实现大体积OFDI与基于组织诊断的精确对照，以评估肺部病理改变24。这一简单而有效的方法可推广至其他组织类型，为确定正常及病变组织的精细成像特征提供所需的精确影像-组织病理学对应关系。

方案

1. 成像系统

OFDI 的技术细节此前已有描述4-6。环形 OFDI 的成像速度为每秒 25 至 100 帧，每幅圆形横截面图像包含 512 至 2,048 个轴向深度扫描线。本研究中使用的定制 2.4 Fr（0.8 mm 直径）螺旋扫描导管设计用于通过标准支气管镜的通道。该导管由用于将光聚焦至支气管壁的内层光学核心和一次性外鞘组成。成像过程中导管主体保持静止，而内核以每秒 25 至 100 Hz 的速度旋转，并以每秒 1.25 至 5 mm 的回撤速度进行平移。系统的轴向分辨率为 6 mm（在组织中），成像深度范围为 7.3 mm4-6。本研究中采用基于导管的 OFDI 以模拟 in vivo 支气管镜 OFDI（图 1）。然而，该方案也可适用于台式光学系统的成像（图 3 和图 4）。

2. 成像系统设置

  1. 开启成像系统
  2. 设置并记录成像参数（旋转速度、回撤速度、图像采集速率等）。本研究使用的OFDI成像系统以10-50 fps的速度获取图像。
  3. 将导管连接至旋转接头和回撤装置。
  4. 旋转导管并检查图像质量。根据需要调整系统对准和偏移。

3. 组织制备

  1. 在实验台上放置一次性桌面吸水垫，并将肺组织标本置于垫上。
  2. 若对患者来源的手术切除离体标本进行成像，务必咨询病理科，确保所有切除边缘（支气管、血管及肺实质边缘）均已由病理医师评估、记录和/或切除。
  3. 确定从肺门进入切除标本的支气管气道。使用注射器内孔清除气道内可见的黏液。必要时，可在注射器内孔上连接一段较长的塑料管，以便深入气道进行抽吸。
  4. 触诊标本外表面，以确定目标病灶的位置。
  5. 使用细金属探针，轻柔地沿支气管树推进，直至接近目标病灶。
  6. 沿探针切开气道，直至目标病灶在气道黏膜下可见或可触及。
  7. 使用棉签小心清除覆盖在病灶上方气道黏膜表面的血液或黏液。
  8. 将OFDI导管置于气道黏膜上方，获取图像以确认病灶位于气道黏膜下方，并确定可用于组织学对照的高质量成像感兴趣区域。

4. 组织标记

  1. 根据第3.8步中的先前影像学结果，选择气道中的目标区域。
  2. 在组织上沿期望的成像线选择两个点。这些点可平行于纵向（图2）或环周的（图3) 气道部位，具体取决于预期结果。打点间距不超过1.5 cm，以便组织片段可放入一个组织学包埋盒中进行处理。若组织长度超过 > 需要1.5 cm的长度，然后将组织按长度分割为多个1.5 cm长的带墨标记的兴趣区域，以生成多组匹配的成像与组织学配对样本。
  3. 将细尖开口针头浸入即 25 号针头（长 7/8 英寸）插入组织标记染料（Triangle Biomedical Sciences，达勒姆，北卡罗来纳州）中。
  4. 用纱布小心擦去针头外表面多余的墨水，仅保留组织标记墨水在针管内部。
  5. 沿成像线在选定位置垂直于气道黏膜穿刺组织。
  6. 对气道黏膜上的第二个位点重复步骤 3.3 至 3.5。
  7. 如果墨水从穿刺部位向黏膜表面扩散，应使用棉签小心去除多余的墨水。
  8. 如有必要，用棉签清除气道黏膜表面的黏液或血液。
  9. 如果将墨点以环形方式置于气道内，可将气道两侧展开并用大头针固定，以使成像区域的组织保持平整图3a).

5. 组织成像

  1. 将OFDI导管置于每个墨水标记处进行成像，以确认标记在OFDI图像上可见。标记应表现为组织结构内的局灶性中断，伴有表层高散射颗粒及深层信号快速衰减，这对应于穿刺部位内的墨水颗粒（图3b、图4a、图4g）。
  2. 若墨水标记在OFDI图像上不可见，则对不可见的标记重复步骤4.3至4.7。若墨水标记在OFDI图像上可见，则进入步骤5.3。
  3. 将导管平行放置于气道黏膜表面的两个墨水标记上，使导管光学部分覆盖第一个墨水标记以外的组织（图2b）。使用轻质物体固定导管近端并固定远端，有助于减少运动伪影。
  4. 进行OFDI回拉成像。
  5. 查看OFDI回拉图像，确保两个墨水标记均在图像中可见，并检查是否存在运动伪影（图3和图4）。若标记不可见，则重复步骤5.1至5.4。

6. 组织的采集与处理

  1. 在气道黏膜组织上放置一个绿色墨水点（Triangle Biomedical Sciences，Durham，NC），以确定成像扫描的起始位置，该位置距离成像回撤过程中最先出现的墨迹标记0.3 cm处（图2c）。
  2. 切除包含两个黑色墨水标记和绿色墨水标记的组织。将组织修剪至适合标准组织学处理盒的大小。若新鲜组织难以切割，可在取材前先行固定。
  3. 将组织放入组织学处理盒中，并在10%福尔马林中固定至少48小时。
  4. 使用任何组织学部门均可提供的组织处理仪对组织进行处理。
  5. 将组织包埋于石蜡中，使切片方向与气道表面的两个黑色墨水标记平行。
  6. 使用组织切片机修块，直至可见任一墨水标记或整个组织切面完全暴露，以先达到者为准。
  7. 当两个黑色墨水标记均可见时，切取一张5 μm厚的切片并贴附于载玻片上。
  8. 继续每隔50 μm切取并贴附一张5 μm厚的切片，直至黑色墨水标记不再可见或组织耗尽，以先发生者为准。
  9. 按照标准的苏木精-伊红（H&E）染色流程对切片进行染色并加盖盖玻片。

7. 图像处理

如果图像是使用台式扫描仪或其他扫描技术获取的，且单个横截面图像中可同时看到两个墨迹标记，则该图像可直接与相应的组织学图像进行比对。如果使用螺旋扫描导管获取了三维数据集，则需要对图像进行重新插值处理，以获得一个同时穿过两个墨迹标记的单张二维图像，从而与组织学图像进行比对。此操作可通过 ImageJ 或其他图像处理软件实现。在某些情况下，墨迹可能不明显，此时应检查相邻的切片/玻片。

结果

黑色墨水标记之间的距离应保持在 1 - 1.5 cm 之间，以标示成像感兴趣区域。绿色墨水标记应置于成像扫描起始位置，在第一个黑色墨水标记之前，用于确定标本方向（图 2 和图 3a）。组织墨水标记应在 OFDI 成像和组织学切片中均可见（图 3 和图 4）。在正常的猪和人呼吸道中（图 3 和 图 4），应能观察到典型的气道分层结构。上皮层（E）表现为气道腔面一层薄而中等信号密度、均质的结构。固有层由信号强弱不一的有序组织构成，对应于固有层（LP）的不同成分，例如信号较强的结缔组织（包括弹性蛋白和胶原蛋白，EL），以及信号较弱的唾液腺样腺体组织（G）。偶尔可见信号较弱的导管（D）穿过呼吸上皮，与支气管腔相连。平滑肌表现为不连续、散在分布的肌束，在 OFDI 中难以辨认。在 H&E 染色和三色染色切片中可观察到气道的分层结构（图 3c、3d、3f、3g、4b、4c、4e 和 4f），其中三色染色显示表层致密的弹性纤维和胶原组织呈深蓝色，其下方的平滑肌染成红色（SM）。软骨环（C）表现为边界清晰、信号较弱的新月形结构，在猪气道中软骨环相互重叠，而在人呼吸道中则不重叠。环绕软骨环的软骨膜表现为一层薄而信号较强的组织，包绕着信号较弱的软骨环。在外周人呼吸道中（图 4g 和图 4h），肺泡附着结构（A）表现为细而信号较强的网状肺泡壁，其间为信号缺失的肺泡腔。固有层内的血管腔隙表现为线状或圆形的信号缺失结构，伴有轻度下方阴影伪影（箭头）。

光学相干断层扫描，纤毛结构，方法：成像分析，示意图。
图1. 猪气道的OFDI成像。 体内获取的机械通气下猪气道图像。（a）近端气道的OFDI横截面图像。（b）远端气道的OFDI横截面图像。（c）近端气道的OFDI纵向截面图像，为图（e）中红色高亮区域的高倍放大图像。（d）远端气道的OFDI纵向截面图像，为图（e）中绿色高亮区域的高倍放大图像。（e）从近端至远端（从左到右）气道的OFDI纵向截面图像。导管直径为0.8 mm，刻度线间隔为0.5 mm。尽管在OFDI图像中可分辨气道壁的不同层次及肺泡附着结构，但在缺乏直接匹配的组织学对照时，难以精确解释OFDI信号对应的解剖结构。e：上皮层，lp：固有层，sm：黏膜下层， c：软骨，a：肺泡附着结构。

主动脉夹层中的结扎过程；手术方法；显示插入和连接步骤的序列。
图 2. 猪气道的组织标记。 (a) 打开的气道，其管腔表面有两个黑色墨水标记，平行于气道的纵轴方向，相距 1.5 cm。 (b) OFDI 导管覆盖两个黑色墨水标记，以确保在 OFDI 回撤成像过程中包含这两个标记。 (c) 气道上增加一个绿色墨水标记，用于确定标本成像扫描的起始方向。

眼部组织切片的光学相干断层扫描与组织学；包含 G、E、D、EL、SM、C 分析。
图 3. 利用组织标记实现精确对应的猪气道光学频率域成像（OFDI）与组织学图像。(a) 打开的气道，其管腔表面有两个平行于气道周向的黑色墨水标记。使用大头针进一步撑开气道（箭头所示）。(b) 猪气道的 OFDI 图像，两个墨水标记均可见（星号所示），(c) 与之精确对应的苏木精-伊红（H&E）染色组织学图像（星号：在呼吸上皮上可见黑色墨水标记），以及 (d) 对应的三色染色图像。比例尺：2 mm。(e) OFDI 图像的高倍放大视图，(f) 对应的 H&E 染色组织学图像，以及 (g) 对应的三色染色图像。E：呼吸上皮，EL：致密胶原和弹性组织，SM：平滑肌，C：软骨环（组织学假象导致软骨环出现人为分离），G：唾液腺组织，D：进入上皮的唾液腺导管。比例尺：250 μm。 点击此处查看大图。

牙龈组织层次的组织学示意图；标注显示上皮、结缔组织、分析区域。
图 4. 人类气道的光学频率域成像（OFDI）与组织学结果，通过组织标记实现精确对应。 (a) 人类近端气道的 OFDI 图像，两个墨水标记均可见（星号）。 (b) 与 (a) 精确对应的苏木精-伊红（H&E）染色组织学图像，可见呼吸上皮上的黑色墨水标记（星号），以及 (c) 对应的三色染色图像。比例尺：2 mm。(d) OFDI 图像的更高倍放大视图，(e) 对应的 H&E 染色组织学图像，以及 (f) 三色染色图像。比例尺：250 μm。E：呼吸上皮，LP：固有层，G：唾液腺组织，C：软骨环，PC：软骨膜。在人类气道中，典型的分层结构清晰可见。在疏松结缔组织内，可见散在的红色染色平滑肌束（SM，图 c 和 f），这些肌束不形成连续带状结构，因此在 OFDI 中无法显示为明显的分层。(g) 人类远端气道的 OFDI 图像，以及 (h) 与之精确对应的 H&E 染色组织学图像，可见呼吸上皮上的黑色墨水标记（星号）。比例尺：2 mm。肺泡附着结构（A）表现为信号强的网状肺泡壁，其间为无信号的肺泡腔。固有层内的血管腔隙也表现为无信号结构，其下方伴有轻度信号衰减（箭头）。

讨论

由于缺乏症状以及无法通过影像学或支气管镜检查观察到早期肿瘤性改变，早期肺部恶性病变的评估极具挑战性。OFDI 可提供接近组织学分辨率的实时大面积三维组织微结构图像2-6。已有研究表明，内镜支气管 OFDI 是一种安全的技术，可用于肺气道长段区域获取高分辨率三维数据集11-13（动画）。然而，在体内环境中仅能获取微小活检组织作为组织病理学对照，无法为肺部病变成像标准的建立提供足够的 OFDI 与组织学对应关系。为了准确评估肺部成像中观察到的 OFDI 特征，必须实现 OFDI 图像与组织学之间的精确匹配。本文介绍一种简单而有效的方法，用于实现 OFDI 与组织学在离体肺切除标本气道成像中精确的一一对应关联，该方法几乎适用于任何类型的离体组织。一旦通过一对一匹配的组织学在离体条件下建立成像标准，这些标准便可进一步应用于体内成像。

用于标记成像感兴趣区域的组织染料在OFDI和组织学图像中均清晰可见。通过使用简单的技术对组织进行定位，可在成像和组织学中匹配墨水标记，从而实现OFDI特征与组织学结果之间的一一对应比较，以确定组织病理学的可识别成像特征。该技术成本低廉且实用，因此在多种光学成像应用中具有广泛用途。

在体内环境中，可采用激光标记等方法进行组织定位25。然而，支气管活检样本体积较小，仍是利用体内研究建立肺部病理特异性成像标准的限制因素。尽管离体研究可作为体内成像的适当替代方法，但仍存在一些局限性。离体肺组织标本通常处于未膨胀状态，并常表现出手术引起的肺不张，这会改变正常肺泡结构的外观。对经手术切除的肺组织进行膨胀处理并结合组织学标记以实现与组织病理学的对应关系，在技术上具有挑战性，因为大多数手术切除的肺标本在病理学冰冻切片评估后才被获取，而此过程中胸膜表面常被破坏，从而干扰标本的膨胀。非病理性的肺不张在体内环境中并不存在，因此这一局限性不影响体内肺部成像。此外，离体标本中血管内缺乏血液，可能难以区分血管结构与其他信号缺失结构。在体内环境中，将多普勒光学相干断层成像（OCT/OFDI）26-28与结构OCT/OFDI结合，将有助于识别血管结构。

可能会观察到运动伪影 体内 它们不存在的地方 离体这在具有较慢采集速率的标准OCT系统中可能存在问题。然而，OFDI系统的快速帧率目前 > 200 fps29-31因此，预计运动伪影不会成为显著问题。此前 体内 OCT 和 OFDI 成像研究已成功实现了精细成像特征的可视化14,15,18,19.

本研究展示了与组织病理诊断精确对应的容积式光学频率域成像（OFDI），用于评估肺部病变。所述方法旨在提供与OFDI图像解读精确匹配的组织学结果，作为OFDI图像解释的金标准。

一旦针对肺部病理的特定影像学标准得到开发并经过验证 离体 结合一对一匹配的组织学结果，这些标准可随后应用于 体内 以支气管活检作为影像学特征评估的金标准进行成像研究。该技术以肺切除标本为应用示例，但可适用于几乎任何类型的组织，以实现精确的影像与组织学对照，从而确定正常及病变组织的细微影像特征。

披露

本文的出版和免费获取由 NinePoint Medical Inc. 赞助。

致谢

作者谨此感谢 Sven Holder 先生和 Stephen Conley 先生在本研究中提供的宝贵帮助。本工作部分由美国国立卫生研究院 [资助号 R00CA134920] 和美国肺脏协会 [资助号 RG-194681-N] 资助。NinePoint Medical Inc. 资助了本稿件相关的出版费用。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
组织标记染料Triangle BiomedicalTMD-BK, TMD-G

参考文献

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