使用硅烷偶联剂将生物探针连接到二氧化硅光学生物传感器上

摘要

生物传感器通过表面修饰将高灵敏度传感器与高特异性探针结合，从而与复杂的生物环境相互作用并实现靶向检测。在此，我们演示了使用硅烷偶联剂作为桥梁，通过生物素对二氧化硅光学传感器进行表面功能化修饰的方法。

摘要

为了与生物环境相互作用，生物传感器平台（例如广泛使用的Biacore系统，基于表面等离子体共振（SPR）技术）采用多种表面修饰技术，这些技术可以防止表面污染、调节表面的疏水性/亲水性、适应多种电子环境，而最常见的是赋予传感器对特定目标分子的选择性。^1-5 这些技术将原本高灵敏度的生物传感器功能拓展至复杂环境下的实际应用，例如血液、尿液和废水分析。^2,6-7 尽管Biacore等商用生物传感平台已有明确且标准化的表面修饰方法，但这些方法尚未以标准化的方式应用于其他无标记生物传感平台，例如回音壁模式（Whispering Gallery Mode, WGM）光学谐振器。^8-9

回音壁模式（WGM）光学谐振器是一种极具前景的技术，可用于在极低浓度下实现对多种物质的无标记检测。^6,10-12 这类平台的高灵敏度源于其独特的几何光学特性：WGM光学谐振器将循环光限制在特定的整数共振频率上。¹³ 与表面等离子体共振（SPR）平台类似，光学场并非完全局限于传感器器件内部，而是会发生倏逝；这种“倏逝尾部”可与周围环境中的物质发生相互作用。该相互作用会引起光学场有效折射率的变化，从而导致器件共振频率发生微小但可检测的偏移。由于光学场在谐振器内循环传播，可多次与周围环境相互作用，因而实现了信号的内在放大，使器件对环境中的微小变化具有极高的灵敏度。^2,14-15

为了在复杂环境中实现靶向检测，这些平台必须通过表面修饰与探针分子（通常为结合对的一半，例如抗体/抗原）相偶联。² 尽管回音壁模式（WGM）光学谐振器可由多种材料体系制成多种几何结构，但二氧化硅微球是最常见的类型。这些微球通常在光纤末端制备，从而形成一个“茎部”，便于在功能化和检测实验中操作微球。可采用二氧化硅表面化学方法将探针分子固定在其表面；然而，为平面基底开发的传统技术通常不适用于这些三维结构，因为微球表面的任何变化（如灰尘、污染、表面缺陷或涂层不均）都可能对其检测能力产生严重不利影响。本文中，我们展示了一种简便的方法，利用硅烷偶联剂在无机表面与生物环境之间搭建桥梁，将生物素连接到二氧化硅表面，从而实现二氧化硅微球WGM光学谐振器的表面功能化。^8,16 尽管本研究中以二氧化硅微球WGM谐振器作为传感系统，但所描述的实验方案具有普适性，可用于将生物素功能化至任何二氧化硅器件的表面。

方案

1. 背景

通过一个简单的三步过程，将生物素连接到这些装置的表面（图1）。首先，我们通过将装置暴露于氧气等离子体或piranha溶液中，对表面进行清洗并使其表面富含羟基。其次，我们采用气相沉积法，通过水解和缩合反应将末端带有伯胺基团的硅烷偶联剂连接到羟基上。第三步，我们利用N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯化学法将生物素连接到表面。有关这些技术的开发细节以及我们选择这些技术的动机，建议感兴趣的读者参阅我们之前的文献⁸。

在加入伯胺以及生物素后，可通过光学显微镜和荧光显微镜评估这些反应的成功程度。光学显微镜可用于判断表面功能化流程是否对微球表面造成损伤或污染；而荧光显微镜则用于验证生物素分子在表面覆盖的质量与均匀性，以及表面生物素与（链霉）亲和素结合的能力。为评估表面伯胺的覆盖情况，我们使用了异硫氰酸荧光素（FITC）荧光染料，该染料可与伯胺反应，在微球表面形成稳定的共价硫脲键连接。为标记表面的生物素基团，采用与亲和素偶联的德克萨斯红（Texas Red）荧光染料，通过生物素-亲和素相互作用进行标记。在这两种情况下，所选用的染料均可通过受体-配体相互作用或共价键合方式与表面的功能基团发生作用。

在此，含有三个离去基团和一个功能基团的硅烷偶联剂在无机表面与有机探针分子之间起到桥梁作用。伯胺功能基团可与NHS酯定量反应，形成....

讨论

如实验方案所述，我们设计了一种承载平台，用于在功能化过程中通过微球的茎部对其进行转移。该承载平台的开发旨在解决微球在功能化流程中与各种容器壁接触所导致的表面污染和损伤问题。我们发现，主要困难在于功能化过程中需要反复将单个微球连接和脱离不同的容器。当使用镊子夹持微球茎部逐个移动时，很难避免微球与物体表面发生刮擦。通过将每个微球固定在载玻片上的特定位置，我们仅需操作载玻片本身，而非微球的茎部，即可方便地将多个微球整体移入或移出不同的容器。通过这种方法，我们能够同时对大量微球进行功能化处理，并消除了因操作不当引起的污染和表面损伤，最终实现了约90%的完整且成功功能化的微球制备成功率。

如实验方案所述，我们探索了两种对二氧化硅微球进行羟基化的方法。虽然通常使用piranha溶液进行该处理，但该方法耗时较长，且需要湿化学操作。在处理微球时，我们发现通过氧气等离子体处理进行羟基化具有更优的效果。氧气等离子体处理无需接触液体溶液、无需干燥步骤，也无需直接操作二氧化硅微球。此外，该方法在表面引入羟基的速度要快得多。然而，我们认识到并非所有研究团队都能获得氧气等离子体设备，因此可能需要使用pira.......