方法文章

旋转壁式生物反应器衍生的三维上皮细胞模型的培养与应用

DOI：

10.3791/3868

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2012年4月3日

 , 
1Basic Medical Sciences, University of Arizona College of Medicine - Phoenix

本文内容

摘要

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一种可使上皮细胞在生理条件下生长并形成三维细胞聚集体的旋转式细胞培养系统被描述。所生成的聚集体表现出 体内-样特征，而这些特征在传统培养模型中未被观察到，因此可作为多种科学研究中更为精确的器官型模型系统。

摘要

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机体内的细胞和组织会受到其微环境的影响，从而决定其结构、细胞间通讯以及整体功能。体外细胞培养模型若要准确模拟目标组织，培养环境是必须重点考虑的关键因素。传统的细胞培养系统通常在平坦的二维（2-D）不可渗透表面上培养上皮细胞。尽管传统培养系统已使我们获得大量研究成果，但许多结果在人体临床试验或组织离体实验中无法重现，这可能是由于缺乏具有生理相关性的微环境所致。

在此，我们介绍一种培养系统，该系统利用创新的旋转壁式反应器（RWV）生物反应器技术，克服了传统二维细胞培养中的诸多培养条件限制。我们及其他研究团队已证实，由RWV构建的类器官模型能够模拟人体组织的结构、功能以及对外界刺激的真实人类反应，其特性与人源外植体组织相似。 1-6RWV 生物反应器是一种悬浮培养系统，可在低生理流体剪切力条件下支持上皮细胞的生长。该生物反应器有两种不同形式：高宽比旋转容器（HARV）和低速横向转动容器（STLV），二者区别在于通气来源。上皮细胞可与多孔、胶原包被的微载体小球共同加入所选的生物反应器中。 （图1A）细胞在生物反应器中持续自由下落期间，利用微珠作为生长支架 （图1B）生物反应器提供的微环境可使细胞形成三维（3-D）聚集体，表现出 体内-在标准二维培养条件下通常无法观察到的类似特征 （图1D）这些特征包括紧密连接、黏液分泌以及顶-基底极性。 体内 蛋白质定位及其他上皮细胞类型特异性特性

从单层上皮细胞发展为完全分化的三维细胞聚集体的过程因细胞类型而异1, 7-13。定期从生物反应器中取样，可监测上皮细胞聚集体的形成、细胞分化标志物及细胞活力（图1D）。当细胞分化和聚集体形成确立后，可将细胞从生物反应器中收获，并对三维聚集体进行类似于二维培养细胞的多种检测，但需考虑若干因素（图1E-G）。在本研究中，我们详细描述了在RWV生物反应器系统中培养三维上皮细胞聚集体的具体步骤，以及适用于这些三维聚集体的多种潜在检测与分析方法。这些分析包括但不限于：结构/形态学分析（共聚焦显微镜、扫描电镜和透射电镜）、细胞因子/趋化因子分泌与细胞信号通路检测（流式微球阵列和Western印迹分析）、基因表达分析（实时PCR）、毒理学/药物分析以及宿主-病原体相互作用研究。这些检测方法的运用为更深入和广泛的后续研究奠定了基础，例如代谢组学、转录组学、蛋白质组学及其他基于阵列的应用。我们的目标是提供一种非常规的培养人上皮细胞的方法，以在简便且稳健的系统中构建能够模拟人体in vivo组织的类器官三维模型，供具有不同科研兴趣的研究人员使用。

方案

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所有步骤均应在生物安全二级（BSL-2）条件下于层流罩内进行。

1. 准备STLV生物反应器

  1. 根据制造商的说明书组装STLV生物反应器，并执行脱毒程序以确保生物反应器的无菌状态。用鲁尔帽封闭所有开放的端口，并向STLV中加入95%乙醇，浸泡24小时。
  2. 移除乙醇，并用灭菌蒸馏水填充STLV，浸泡24小时。
  3. 仅使用灭菌蒸馏水重复步骤1.2。
  4. 使用供应商提供的工具，松开STLV上的所有螺丝、盖帽和中心塞，将其放入灭菌袋中，在110 °C下高压灭菌20分钟。
  5. 待STLV冷却后，拧紧螺丝，并重复步骤1.1至1.4，以确保无菌性及完成彻底脱毒。
  6. 将冷却后的STLV螺丝拧紧，并在每个端口上旋紧预先灭菌的单向旋塞阀。
  7. 将旋钮置于垂直位置以打开旋塞阀。
  8. 从10 mL和5 mL鲁尔锁紧式注射器中取出推杆，并将推杆重新套入原包装中以维持无菌状态。将注射器旋接到旋塞阀上（此步骤必须使用鲁尔锁紧式注射器）。
  9. 向10 mL注射器中加入杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS），直至STLV完全充满并开始流入5 mL注射器。
  10. 将无菌推杆重新插入各注射器中，并通过交替推动两个注射器的推杆，排除生物反应器中残留的气泡。
  11. 在完全排除气泡后，保持注射器连接在生物反应器上。关闭旋塞阀，将STLV固定于旋转垂直....

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讨论

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此处介绍的RWV生物反应器技术可能使研究人员能够将其现有的细胞培养系统提升为更接近生理状态的类器官型细胞培养模型。RWV生物反应器细胞培养系统可提供低剪切力的微环境，使细胞能够形成三维细胞聚集体 体内类特性，包括紧密连接、黏蛋白分泌、胞外结构（如微绒毛）以及细胞极性。本文所展示的大部分数据和实例均采用在RWV系统中培养的阴道上皮细胞，但RWV系统也已被用于培养其他类型的上皮细胞，如小肠和大肠、肺、膀胱、肝脏及扁桃体上皮细胞，以构建三维类器官模型 1, 7-13, 18此外，该系统已被用于培养非上皮细胞类型的细胞，目前复杂的多细胞类器官培养模型的开发工作正在进行中。 2, 18.

本文所述方案旨在作为指导，可能需要根据目标细胞类型进行调整。在RWV系统中培养上皮细胞时，最常见的方案修改包括：细胞在STLV中培养的时间长度、将聚集体从STLV转移至HARV的决策及其时机，以及在STLV中初始接种时的细胞/微载体珠比例。为成功形成聚集体，还可考虑更专业的修改，例如微载体珠或支架的特性，包括表面积、直径、形状、表面涂层、密度、.......

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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作者感谢 Brooke Hjelm 提供的技术支持以及 Andrew Larsen 进行的蛋白质分析。本工作部分由替代研究与发展基金会（MMHK）资助项目以及美国国立卫生研究院过敏与传染病研究所性传播感染与局部微杀菌剂合作研究中心项目（IU19 AI062150-01，MMHK）资助。我们衷心感谢《生殖生物学》允许重复使用图示。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Alexa Fluor 488InvitrogenA21131按1:500稀释使用
FACSDivaBD Biosciences流式细胞仪
β-tublin 抗体Calbiochem654162按1:5000稀释使用
Bio-Plex 2000Bio-Rad171-000205v5 软件
生物反应器及组件SyntheconRCCS-4
细胞筛BD Biosciences352340孔径40μm
锥形管（50 mL）Corning5-538-60
盖玻片VWR international48366067
细胞因子微球阵列试剂盒Bio-Rad定制人源试剂盒
Cytodex 微珠Sigma-AldrichC3275
DPBSGIBCO, by Life Technologies14190
EDTASigma-AldrichED-500G乙二胺四乙酸
上皮特异性抗体（ESA）Chemicon InternationalCBL251按1:50稀释使用
胎牛血清（FBS）GIBCO, by Life Technologies10438热灭活
HARV（一次性）SyntheconD-405
盐酸Sigma-Aldrich25814837%
兜甲蛋白抗体Sigma-AldrichI 9018
载玻片VWR international16004-368
MTT试剂MP Biomedicals1945923-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐
MUC1抗体（显微镜用）Santa Cruz Biotechnology, Inc.Sc-7313按1:50稀释使用
MUC1抗体（流式细胞术用）BD Biosciences559774又称CD227，每次检测使用20μL
多聚甲醛Electron Microscopy Sciences15710用DPBS稀释至4%
培养皿（小号）BD Biosciences353002
带滤膜的聚苯乙烯管BD Biosciences352235
聚苯乙烯流式管BD Biosciences352058
PR抗体DakoM3569按1:100稀释使用
ProLong GoldInvitrogenP36931含DAPI的封片剂
RNeasy Mini KitQiagen74903
十二烷基硫酸钠Sigma-Aldrich71725
灭菌袋VWR international11213-035
活塞阀（单向）MedexSupplyMX5061L
注射器（10 mL）BD Biosciences309604鲁尔锁扣式针头
注射器（5 mL）BD Biosciences309603鲁尔锁扣式针头
台盼蓝InvitrogenT10282
Vp5抗体Santa Cruz Biotechnology, Inc.sc-13525HSV-2抗体克隆6F10；按1:5000稀释使用

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Herbst-Kralovetz, M. M., et al. Quantification and comparison of toll-like receptor expression and responsiveness in primary and immortalized human female lower genital tract epithelia. Am. J. Reprod. Immunol. 59 (3), 212-224 (2008).
  2. Hjelm, B. E., Berta, A. N., Nickerson, C. A., Arntzen, C. J., Herbst-Kralovetz, M. M.

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