一种可使上皮细胞在生理条件下生长并形成三维细胞聚集体的旋转式细胞培养系统被描述。所生成的聚集体表现出 体内-样特征，而这些特征在传统培养模型中未被观察到，因此可作为多种科学研究中更为精确的器官型模型系统。
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摘要
摘要
机体内的细胞和组织会受到其微环境的影响，从而决定其结构、细胞间通讯以及整体功能。体外细胞培养模型若要准确模拟目标组织，培养环境是必须重点考虑的关键因素。传统的细胞培养系统通常在平坦的二维（2-D）不可渗透表面上培养上皮细胞。尽管传统培养系统已使我们获得大量研究成果，但许多结果在人体临床试验或组织离体实验中无法重现，这可能是由于缺乏具有生理相关性的微环境所致。
在此，我们介绍一种培养系统，该系统利用创新的旋转壁式反应器（RWV）生物反应器技术，克服了传统二维细胞培养中的诸多培养条件限制。我们及其他研究团队已证实，由RWV构建的类器官模型能够模拟人体组织的结构、功能以及对外界刺激的真实人类反应，其特性与人源外植体组织相似。 1-6RWV 生物反应器是一种悬浮培养系统，可在低生理流体剪切力条件下支持上皮细胞的生长。该生物反应器有两种不同形式：高宽比旋转容器（HARV）和低速横向转动容器（STLV），二者区别在于通气来源。上皮细胞可与多孔、胶原包被的微载体小球共同加入所选的生物反应器中。 （图1A）细胞在生物反应器中持续自由下落期间，利用微珠作为生长支架 （图1B）生物反应器提供的微环境可使细胞形成三维（3-D）聚集体，表现出 体内-在标准二维培养条件下通常无法观察到的类似特征 （图1D）这些特征包括紧密连接、黏液分泌以及顶-基底极性。 体内 蛋白质定位及其他上皮细胞类型特异性特性
从单层上皮细胞发展为完全分化的三维细胞聚集体的过程因细胞类型而异1, 7-13。定期从生物反应器中取样，可监测上皮细胞聚集体的形成、细胞分化标志物及细胞活力（图1D）。当细胞分化和聚集体形成确立后，可将细胞从生物反应器中收获，并对三维聚集体进行类似于二维培养细胞的多种检测，但需考虑若干因素（图1E-G）。在本研究中，我们详细描述了在RWV生物反应器系统中培养三维上皮细胞聚集体的具体步骤，以及适用于这些三维聚集体的多种潜在检测与分析方法。这些分析包括但不限于：结构/形态学分析（共聚焦显微镜、扫描电镜和透射电镜）、细胞因子/趋化因子分泌与细胞信号通路检测（流式微球阵列和Western印迹分析）、基因表达分析（实时PCR）、毒理学/药物分析以及宿主-病原体相互作用研究。这些检测方法的运用为更深入和广泛的后续研究奠定了基础，例如代谢组学、转录组学、蛋白质组学及其他基于阵列的应用。我们的目标是提供一种非常规的培养人上皮细胞的方法，以在简便且稳健的系统中构建能够模拟人体in vivo组织的类器官三维模型，供具有不同科研兴趣的研究人员使用。
方案
所有步骤均应在生物安全二级（BSL-2）条件下于层流罩内进行。
1. 准备STLV生物反应器
- 根据制造商的说明书组装 STLV 生物反应器，并执行脱毒程序以确保生物反应器的无菌状态。用鲁尔帽封闭开放的端口，并向 STLV 中加入 95% 乙醇，浸泡 24 小时。
- 移除乙醇，并用灭菌蒸馏水填充 STLV，浸泡 24 小时。
- 仅使用灭菌蒸馏水重复步骤 1.2。
- 使用供应商提供的工具，松开 STLV 上的所有螺丝、盖帽和中心塞，并将其放入灭菌袋中，在 110 °C 下高压灭菌 20 分钟。
- 待 STLV 冷却后，拧紧螺丝，并重复步骤 1.1–1.4，以确保无菌状态并完成脱毒处理。
- 将冷却后的 STLV 螺丝拧紧，并在每个端口上旋紧预先灭菌的单向旋塞。
- 将旋塞手柄置于垂直位置以打开旋塞。
- 从 10 mL 和 5 mL 鲁尔锁式注射器中取出推杆，并将推杆重新套入包装纸中以保持无菌状态。将注射器旋接到旋塞上（此步骤必须使用鲁尔锁式尖端注射器）。
- 向 10 mL 注射器中加入杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS），直至 STLV 完全充满并开始流入 5 mL 注射器。
- 将无菌推杆重新插入各注射器中，并通过交替推动两个注射器的推杆，排除生物反应器中产生的残留气泡。
- 在排除所有气泡后，保持注射器连接在生物反应器上。关闭旋塞，将 STLV 固定到旋转垂直平台上，至少旋转 24 小时以监测是否泄漏。
2. 准备微载体珠
- 在50 mL锥形管中加入15 mL DPBS至约250 mg Cytodex微载体珠粒，并在与STLV相同的条件下进行高压灭菌（1.4）。
- 冷却后，移除DPBS，加入用于培养目标上皮细胞的培养基，轻轻旋转管子使珠粒重悬。
- 用培养基重复洗涤步骤两次。最后一次洗涤后，向珠粒中加入15 mL生长培养基。
3. 将上皮细胞和微珠接种至STLV生物反应器中
- 将目标上皮细胞在组织培养瓶中以单层形式培养，直至获得 ≥1×107 个细胞。从培养瓶中收集细胞（例如胰蛋白酶消化法或EDTA法），计数以确定细胞浓度，并通过台盼蓝染色排除法测定细胞活力1。
- 向含有预处理微珠的锥形管中（见步骤2.3），根据目标上皮细胞类型加入所需浓度的细胞（2×105–1×107 个上皮细胞）2,8 （图1A）。用缓冲液冲洗锥形管，确保所有细胞均转移完全。
- 从STLV装置中移除DPBS溶液和注射器。
- 拔除中心端口的塞子，使用10 mL移液管将上皮细胞/微珠悬液加入STLV中。冲洗锥形管以确保所有细胞/微珠均转移至STLV，随后重新插入中心端口的塞子。
- 从5 mL和10 mL注射器中取出推杆，并将推杆重新套入原包装中以维持无菌状态。将注射器旋入带有开放旋塞的端口，向STLV中注入培养基，插入推杆，然后关闭旋塞。
- 将接种后的STLV置于37 °C培养箱中静置30分钟，期间不进行旋转。
- 打开旋塞，使用推杆排出气泡，然后关闭旋塞。
- 将STLV置于37 °C、5% CO2、湿度充足的培养箱中，以20 rpm持续旋转 （图1B）。除取样、更换培养基或收集细胞聚集体（见下节）时可暂时停止外，培养过程需连续旋转，每日24小时不间断。
4. 培养物的培养、取样与照片记录
- 在生物反应器中培养细胞初始 96–120 小时后，通过倾斜 STLV 并使细胞/微珠沉降来更换培养基。取下注射器，打开两个旋塞，从侧口倒出约 75% 的培养基（图 1C）。根据细胞对培养基的代谢情况，在初次接种及初始培养 96–120 小时后，每隔一天或每天更换一次培养基。
- 将不含活塞的 5 和 10 mL 注射器拧紧，按照上述（1.7–1.11）补液程序操作，然后将 STLV 重新拧紧并放回旋转平台上的原位。
- 接种至 STLV 后，每 5–7 天监测一次聚集体的生长状态和活力，小心地从中心口取出少量聚集体（约 200 μL）至两个 1.5 mL 离心管中。为避免聚集体剪切损伤，所有聚集体转移均应使用已从尖端截去约 2 cm 并灭菌的 1000 μL 移液枪头。
- 更换中心塞，接入新的注射器，按上述方法（1.7–1.11）向 STLV 中加入新鲜培养基，并将 STLV 放回带旋转功能的培养箱中（见 3.8）。
- 为检测细胞活力，取步骤 4.3 中分装的两个 1.5 mL 离心管中的一个，以去除贴壁培养瓶中上皮细胞的相同方式（即胰酶消化法）将细胞从微珠上分离。通过台盼蓝排斥染色法检测细胞活力1。
- 为观察细胞聚集体形态，向第二个 1.5 mL 聚集体分装样品中加入 0.5–1 mL 培养基，使用截头的 1000 μL 移液枪头转移至小型培养皿中。使用倒置光学显微镜观察聚集体（图 1D）。
5. 转移与收获聚集体
- 对于某些上皮细胞模型，有必要将聚集体转移至一次性HARV中，以增强培养物的通气2。在收获聚集体进行分析前约一周，从STLV中移除注射器和旋塞阀，并从侧端口倒出约50%的培养基。
- 取下STLV的中心塞，从中央端口小心地将所有内容物倒入50 mL锥形管中（图1E）。用5 mL培养基将STLV冲洗两次，并将冲洗液与其余聚集体合并。
- 继续按照5.2节所述方法转移聚集体，但将聚集体从50 mL锥形管转移至HARV中。
- 约一周后或根据细胞类型从HARV或STLV中（如上所述，5.2节）小心收获聚集体。聚集体收获后的潜在检测形式、检测方法及分析见下文。
6. 聚集体的潜在分析、应用及检测方法
- 为不同实验形式接种类器官。 使用无菌剪切的 1000 μL 枪头，将所需数量的类器官从 50 mL 锥形管转移至 1.5 mL 离心管、24 孔板或 96 孔板中 (图 1F)。
- 洗涤并准备用于分析的类器官。 待类器官沉降后，吸除培养基。将 DPBS 直接加入管或孔的中央，使所有类器官悬浮。待类器官再次沉降至底部后，吸除 DPBS，并根据需要重复洗涤多次。
- 运输类器官用于异地实验与分析。 将所需数量的类器官加入 50 mL 管中，并按步骤 6.2 进行洗涤。用培养基完全充满 50 mL 管，盖紧盖子，并用封口膜包裹盖口以防泄漏。在室温条件下，通过隔夜快递将类器官安全运送至目的地。
- 固定类器官用于电子显微镜观察（图 2）。 可通过将 150–300 μL 类器官转移至 1.5 mL 管中，并用 DPBS 洗涤 3 次（步骤 6.2）来进行扫描电镜、透射电镜或免疫电镜分析。加入 200 μL 针对特定应用（SEM、TEM、免疫电镜等）的电子显微镜固定液，进行所需时间的孵育。去除固定液后，用 DPBS 洗涤类器官 2 次，并按照 Hjelm et al. 2010 中所述步骤进行扫描和透射电子显微镜分析2。
- 免疫荧光显微镜成像（图 3）。 将约 100 μL 类器官转移至 1.5 mL 管中，并进行洗涤（步骤 6.2）。在 1.5 mL 管中，以与单层细胞类似条件对类器官进行固定和抗体标记。封片时，在载玻片上滴加一滴封片剂，用剪切的 1000 μL 枪头将标记后的类器官转移至封片剂上，盖上盖玻片，用指甲油密封盖玻片边缘，并将载玻片在室温下干燥过夜2。
- 使用 MTT 法测定细胞活力/增殖（图 4）。 将类器官转移至 24 孔板中，并更换为 625 μL 无酚红培养基。向每孔加入 62.5 μL 的 5 mg/mL 四唑盐（MTT），在 37 °C 孵育 4 小时。向每孔加入 625 μL 的 100 mg/mL SDS-0.01 M HCl 溶液，并孵育过夜。在 570 nm 处测定吸光度，并使用以下公式计算细胞活力百分比：
- 毒理学研究。将类器官转移至24孔板，对至少2个孔进行台盼蓝排斥实验，以测定初始细胞活力和浓度。在复孔中加入不同浓度的待测化合物。对于细胞活力检测 (图5A)，处理后洗涤类器官并进行台盼蓝排斥实验。对于TC50测定 (图5B)，随时间测定每个浓度下复孔的细胞活力，并采用Reed-Muench法计算50%毒性浓度2, 15。
- 细胞因子微球阵列（CBA）或ELISA。在任何所示实验体系接种细胞后，均可收集细胞上清液。对已接种的类器官进行刺激（方法同单层培养细胞），收集上清液（≥120 μL），并于-80 °C保存，用于后续ELISA或CBA分析 (图6)。
- RNA分析。将≥500 μL的类器官转移至1.5 mL离心管中，并用DPBS洗涤类器官。使用Qiagen RNAeasy试剂盒及动物细胞RNA提取方案进行RNA提取，裂解液需通过20号针头进行匀浆。在转移上清液前，务必让磁珠完全沉降至管底，切勿将空磁珠转移至离心柱中（磁珠会堵塞柱膜，导致RNA得率降低） (图7)。
- 蛋白质分析。采用与单层细胞相同的方法，使用1.5 mL离心管或更大规模的实验体系收获类器官。然而，在类器官裂解后，需静置使磁珠沉降，再将裂解液转移至新的离心管中，随后进行蛋白凝胶电泳或其他蛋白质分析 (图8)。
- 感染研究。将类器官接种至目标实验体系中。使用至少两个孔/样本进行胰蛋白酶消化，以计数细胞数量并评估细胞活力。按照单层培养细胞的感染方法，以选定的感染复数（MOI）对类器官进行病原体感染 (图9)。洗涤步骤须参照6.2节操作。
- 流式细胞术：将类器官接种至50 mL离心管中，洗涤类器官（步骤6.2），并在37 °C下加入2 mM EDTA孵育5–10分钟。向细胞中加入5–10 mL培养基，并通过细胞滤网过滤。取1×106个细胞分装至聚丙烯管中，用冷阻断液（含1% FBS的PBS）洗涤细胞。加入抗体重悬细胞，按照试剂说明书推荐条件进行孵育。离心洗涤细胞后，重悬于PBS中，并转移至滤芯管中用于流式分析 (图10)。
7. 代表性结果
在STLV生物反应器系统中培养的分化人上皮细胞聚集体示例如下所示 图2扫描电镜和透射电镜图像采集自在STLV中培养39天的人类阴道细胞，可见细胞顶面存在微脊、质膜内陷、细胞内分泌囊泡及微绒毛。进一步展示 体内通过共聚焦免疫荧光显微镜图像可观察到在生物反应器中培养的上皮细胞的类上皮特征图3表达黏蛋白（MUC1）以及上皮细胞特异性标志物（ESA）和终末分化标志物（Involucrin；INV）的三维阴道细胞。
如图所示，三维细胞聚集体展现出与组织相似的超微结构特征，但其更接近生理状态的表型也使其成为评估化合物毒性的优良平台。MTT 法是一种常用于检测细胞活力、代谢活性或增殖能力的实验方法，可用于测定多种化学物质和化合物的毒性（图4）。Triton X-100 是一种可破坏细胞膜的去垢剂，被用作验证 MTT 法的阳性对照。另一种在测试化合物处理后评估毒性的方法是台盼蓝排斥法（图5）。在经壬基酚聚氧乙烯醚-9（N-9）处理后，阴道组织聚集体表现出与宫颈外植体模型相似的毒性反应，但与单层培养细胞相比则呈现不同的毒性特征2, 16。
进一步的研究表明，在生物反应器中培养的上皮细胞能够以类似于组织的方式发挥功能并进行信号传导 体内 可以观察到 图6当受到被Toll样受体（TLR）识别的微生物来源分子刺激时，这些聚集体可产生应答并分泌包括IL-6在内的促炎性细胞因子。1。孕激素受体（PR）是一种可响应激素刺激的受体，其在阴道细胞中可在RNA和蛋白质水平均被检测到（图7 和 图8，分别）。这些三维聚集体不仅能够对病原体和激素分子产生响应，还能够功能性地支持单纯疱疹病毒2型（HSV-2）感染。一幅共聚焦显微镜图像显示了感染HSV-2的三维阴道聚集体图9) 显示感染情况。由于HSV-2感染导致严重的细胞破坏，平行的2D阴道上皮细胞培养未予展示。RWV衍生的3D聚集体还分别被用于通过细胞内生长曲线和蚀斑测定法来定量细菌和病毒的复制。8, 9最后，还可以通过流式细胞术定量分析聚集体中单个细胞的物理和功能特性。例如，我们采用流式细胞术检测了单个阴道细胞表面MUC1的表达水平图10）。与单层培养细胞相比，阴道三维聚集体表面表达的MUC1比例较低（27.7% vs 67.2%）。三维聚集体表面MUC1比例低于单层细胞，可能是由于大部分MUC1被细胞分泌至胞外，这与在阴道组织中观察到的现象一致 17, 18.
图1. 在RWV中培养人上皮细胞的示意图及利用RWV来源的聚集体进行的潜在应用。A) 上皮细胞最初在组织培养瓶中以单层形式培养。待细胞融合后，将其从培养瓶中消化下来，并与微载体珠一起加入STLV生物反应器中。比例尺：80 μm。B) STLV在平台上旋转，形成持续自由下落的低流体剪切环境，使细胞能够附着在微珠上并生长，从而形成可见的细胞聚集体。C) 培养约96小时后，需更换STLV中的培养基以适应细胞代谢需求。通过侧口倒出旧培养基，再通过连接的10 mL注射器（已移除活塞）加入新鲜培养基，随后装回注射器活塞并用于排出气泡。D) 培养约5天（d）后，聚集体开始形成。每隔7天取样一次，并通过光学显微镜观察其发育进程（3D人阴道上皮细胞，20倍放大）。E) 当聚集体完全形成且细胞完成分化后，从生物反应器中收获聚集体，并转移至50 mL锥形管中。F) 可将聚集体接种至1.5 mL离心管或多孔板中，用于后续实验分析和检测。G) 可在聚集体上开展的潜在检测与分析的概要。此代表性分析列表并非涵盖所有可能下游应用的详尽目录。
图2. 利用电子显微镜分析三维人上皮细胞聚集体的形态学与结构特征。（A）三维人阴道上皮细胞聚集体的扫描电子显微镜（SEM）图像。比例尺：200 μm（100倍）、100 μm（200倍）、50 μm（500倍）。三维人阴道上皮细胞聚集体的透射电子显微镜（TEM）图像，箭头所示为（B）细胞内分泌囊泡和微绒毛，或（C）“胞质突起”。比例尺：2 μm（修改自Hjelm et al. 2010）2。
图3. 共聚焦免疫荧光显微镜用于鉴定三维上皮细胞聚集体中的连接分化及蛋白标志物。 从生物反应器中收获培养32天的人源三维阴道细胞，固定后分别用 (A) 黏蛋白抗体MUC1、(B) 上皮细胞特异性抗体ESA，或 (C) 抗终末分化上皮细胞抗体Involucrin（INV）进行染色。聚集体通过Alexa 488二抗间接标记（绿色）。比例尺：60 μm（改编自Hjelm et al. 2010）2。
图 4. MTT 法用于检测细胞活力。将人源三维阴道类聚体接种于24孔板中，分别用培养基（未处理）或含0.01%、0.1%或1.0% Triton X-100 的溶液在37 °C下处理1小时。处理结束后移除培养基，进行MTT检测以评估细胞活力。** 表示 p<0.001；采用单尾Student t检验将Triton X-100处理组与未处理对照组进行比较。
图 5. 利用三维上皮细胞聚集体筛选化合物毒性。(A) 非离子表面活性剂-9（N-9）处理 24 小时后，三维人源阴道上皮细胞模型（红线/柱）的剂量依赖性活力曲线，与相同细胞类型在融合单层培养条件下的结果（黑线/柱）对比。(B) 图 (A) 中阴道上皮细胞培养物在处理后 1.5 小时、4 小时、8 小时和 24 小时的 N-9 TC50 水平。* 表示 p<0.05；采用单尾 Student t 检验比较每个暴露时间点的单层培养与三维细胞。 （改编自 Hjelm et al. 2010）2。
图6. 三维上皮细胞在Toll样受体（TLR）激动剂刺激下细胞因子产生的分析。 三维人阴道细胞分别用FSL-1（TLR2/6）、PIC（TLR3）、FLAG（TLR5）和CL097（TLR7/8）刺激24小时，通过细胞因子微球阵列法检测分泌的细胞因子。图中显示的IL-6为所产生并检测到的代表性促炎性细胞因子。*表示刺激组与PBS组相比，p<0.05；单尾Student t检验。（改编自Hjelm et al. 2010）2。
图 7. 三维上皮细胞中基因表达的监测。 对单层（ML）或三维人阴道上皮细胞中孕酮受体（PR）表达进行的半定量 RT-PCR 分析。GAPDH 作为上样对照。所示扩增产物为经过 30 个 PCR 循环后转录表达的结果。箭头指示仅在三维样本中出现的 PR 条带。
图8. 三维上皮细胞的蛋白表达分析。 对单层和三维人阴道上皮细胞全细胞裂解液（30μg）进行Western印迹分析，使用抗孕酮受体（PR）抗体进行检测。以β-微管蛋白作为上样对照的探针。
图 9. 三维人源上皮细胞模型支持有效的病毒感染。 感染 HSV-2 的三维人源阴道上皮细胞聚集体的共聚焦免疫荧光显微镜图像。细胞以 1.0 的感染复数（MOI）感染 2 小时，洗涤后于感染后 24 小时用 4% 多聚甲醛固定，并用 HSV-2 特异性 VP5 衣壳抗体（绿色）和细胞核染料 DAPI（蓝色）染色。比例尺：50 μm。
图10. 通过流式细胞术对三维人上皮细胞模型中的单个细胞进行分析。（A） 单层细胞或 （B） 三维人阴道上皮细胞聚集体经EDTA解离后，用FITC标记的MUC1抗体（蓝色）、同型对照抗体（绿色）或PBS（红色）进行染色，并通过流式细胞术定量检测FITC表达水平。数值表示在排除同型对照染色细胞的背景荧光后，仍呈黏蛋白抗体阳性染色的细胞百分比。非均一性峰形是由于这些细胞表面存在多种糖基化模式以及MUC1表达水平不同所致。
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讨论
此处介绍的RWV生物反应器技术可能使研究人员能够将其现有的细胞培养系统提升为更接近生理状态的类器官型细胞培养模型。RWV生物反应器细胞培养系统可提供低剪切力的微环境，使细胞能够形成三维细胞聚集体 体内类特性，包括紧密连接、黏蛋白分泌、胞外结构（如微绒毛）以及细胞极性。本文所展示的大部分数据和实例均采用在RWV系统中培养的阴道上皮细胞，但RWV系统也已被用于培养其他类型的上皮细胞，如小肠和大肠、肺、膀胱、肝脏及扁桃体上皮细胞，以构建三维类器官模型 1, 7-13, 18此外，该系统已被用于培养非上皮细胞类型的细胞，目前复杂的多细胞类器官培养模型的开发工作正在进行中。 2, 18.
本文所述方案旨在作为指导，可能需要根据目标细胞类型进行调整。在RWV系统中培养上皮细胞时，最常见的方案修改包括：细胞在STLV中培养的时间长度、将聚集体从STLV转移至HARV的决策及其时机，以及在STLV中初始接种时的细胞/微载体珠比例。为成功形成聚集体，还可考虑更专业的修改，例如微载体珠或支架的特性，包括表面积、直径、形状、表面涂层、密度、...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 Brooke Hjelm 提供的技术支持以及 Andrew Larsen 进行的蛋白质分析。本工作部分由替代研究与发展基金会（MMHK）资助项目以及美国国立卫生研究院过敏与传染病研究所性传播感染与局部微杀菌剂合作研究中心项目（IU19 AI062150-01，MMHK）资助。我们衷心感谢《生殖生物学》允许重复使用图示。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21131 | 按1:500稀释使用 |
| FACSDiva | BD Biosciences | 流式细胞仪 | |
| β-tublin 抗体 | Calbiochem | 654162 | 按1:5000稀释使用 |
| Bio-Plex 2000 | Bio-Rad | 171-000205 | v5 软件 |
| 生物反应器及组件 | Synthecon | RCCS-4 | |
| 细胞筛 | BD Biosciences | 352340 | 孔径40μm |
| 锥形管（50 mL） | Corning | 5-538-60 | |
| 盖玻片 | VWR international | 48366067 | |
| 细胞因子微球阵列试剂盒 | Bio-Rad | 定制人源试剂盒 | |
| Cytodex 微珠 | Sigma-Aldrich | C3275 | |
| DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED-500G | 乙二胺四乙酸 |
| 上皮特异性抗体（ESA） | Chemicon International | CBL251 | 按1:50稀释使用 |
| 胎牛血清（FBS） | GIBCO, by Life Technologies | 10438 | 热灭活 |
| HARV（一次性） | Synthecon | D-405 | |
| 盐酸 | Sigma-Aldrich | 258148 | 37% |
| 兜甲蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | I 9018 | |
| 载玻片 | VWR international | 16004-368 | |
| MTT试剂 | MP Biomedicals | 194592 | 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐 |
| MUC1抗体（显微镜用） | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-7313 | 按1:50稀释使用 |
| MUC1抗体（流式细胞术用） | BD Biosciences | 559774 | 又称CD227，每次检测使用20μL |
| 多聚甲醛 | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 用DPBS稀释至4% |
| 培养皿（小号） | BD Biosciences | 353002 | |
| 带滤膜的聚苯乙烯管 | BD Biosciences | 352235 | |
| 聚苯乙烯流式管 | BD Biosciences | 352058 | |
| PR抗体 | Dako | M3569 | 按1:100稀释使用 |
| ProLong Gold | Invitrogen | P36931 | 含DAPI的封片剂 |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74903 | |
| 十二烷基硫酸钠 | Sigma-Aldrich | 71725 | |
| 灭菌袋 | VWR international | 11213-035 | |
| 活塞阀（单向） | MedexSupply | MX5061L | |
| 注射器（10 mL） | BD Biosciences | 309604 | 鲁尔锁扣式针头 |
| 注射器（5 mL） | BD Biosciences | 309603 | 鲁尔锁扣式针头 |
| 台盼蓝 | Invitrogen | T10282 | |
| Vp5抗体 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-13525 | HSV-2抗体克隆6F10；按1:5000稀释使用 |
参考文献
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- Hjelm, B. E., Berta, A. N., Nickerson, C. A., Arntzen, C. J., Herbst-Kralovetz, M. M. Development and characterization of a three-dimensional organotypic human vaginal epithelial cell model. Biol. Reprod. 82, 617-627 (2009).
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