通过实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）检测前列腺肿瘤中的微小RNA

摘要

定量实时聚合酶链式反应（qPCR）是一种快速且灵敏的方法，用于检测肿瘤样本中多种微小RNA（miRNA）分子的表达水平。利用该方法，可从同一cDNA模板扩增、定量并分析数百种不同miRNA分子的表达。

摘要

microRNA（miRNA）是单链、长度为18–24个核苷酸的非编码RNA分子。它们几乎参与了包括发育¹、凋亡²和细胞周期调控³在内的所有细胞过程。据估计，miRNA通过与靶标信使RNA（mRNA）结合⁵，可调控30%至90%人类基因的表达⁴。在多种疾病及癌症亚型中，已报道存在miRNA的广泛失调⁶。由于其普遍存在性及独特结构，这些小分子有望成为下一代生物标志物、治疗药物和/或治疗靶点。

用于检测miRNA表达的方法包括基于SYBR Green I染料以及基于TaqMan探针的qPCR。若要将miRNA有效应用于临床环境，必须确保其在新鲜和/或存档的临床样本中的检测具有准确性、可重复性和特异性。qPCR已广泛用于验证全基因组分析（如微阵列研究）中miRNA的表达⁷。本方案所用样本来自接受根治性前列腺切除术的临床局限性前列腺癌患者；但也可替换为其他组织或细胞系。前列腺标本在切除后立即在液氮中速冻。同时收集每位患者的临床变量及随访信息，以供后续分析⁸。

前列腺肿瘤样本中miRNA水平的定量。肿瘤qPCR分析的主要步骤包括：总RNA提取、cDNA合成以及使用miRNA特异性引物检测qPCR产物。使用TRIzol试剂从样本中提取包含mRNA、miRNA及其他小RNA在内的总RNA。采用Qiagen的miScript系统进行cDNA合成和qPCR（图1）。内源性miRNA不含poly(A)尾，因此在逆转录过程中，通过poly(A)聚合酶对miRNA进行poly(A)修饰。随后以miRNA为模板，在寡核苷酸oligo-dT和逆转录酶的作用下合成cDNA。oligo-dT引物5'端带有一段通用标签序列，可在PCR步骤中促进cDNA的扩增。PCR产物的扩增通过SYBR Green染料发出的荧光水平进行检测，该染料可嵌入双链DNA中。特异性miRNA引物与可结合通用标签序列的通用引物共同作用，可扩增特定的miRNA序列。

miScript引物检测试剂盒可用于检测一千多种人源特异性miRNA以及数百种小鼠源特异性miRNA。本实验采用相对定量法对miRNA的表达水平进行定量。为校正不同样本之间的差异，需将目标miRNA的表达水平归一化至参考基因的表达水平。在相对定量分析方法中，参考基因的选择至关重要。常用的参考基因包括小分子RNA RNU6B、RNU44和RNU48，因为它们在大多数样本中表达稳定。本实验方案中选用RNU6B作为参考基因。

方案

1. 前列腺样本采集

1. 在前列腺切除术时采集前列腺样本。使用解剖学标志对样本进行定位。前列腺和精囊用以下方式标记：右侧涂绿色，左侧涂蓝色。
2. 取与直肠面垂直的前列腺随机横切中段，浸入液氮中速冻，并于 -80 °C 下保存⁹。
3. 将保存的组织切片进行复印，根据前、后、右、左方向进行定位，并将其四等分。使用冷冻切片机进行切片。
4. 切片用 H&E 染色，并由病理学家进行评估，以在染色切片及其对应图像上确定并勾画出肿瘤区域与正常区域。所标记的区域作为后续步骤中提取用于RNA提取的肿瘤组织的参考依据。

2. 从样品中分离总RNA（包括miRNA）

1. 将冷冻的前列腺样本置于干冰上，并参照已标记的复印件，切取前列腺肿瘤的一小部分（50 至 100 mg）。
2. 将前列腺肿瘤组织在 1 mL TRIzol 试剂中匀浆。后续步骤中的用量均基于使用 1 mL TRIzol 试剂。

注意：此处我们使用TRIzol试剂提取RNA，但其他可分离含小RNA的总RNA的试剂盒也可使用。

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讨论

与正常组织相比，某些miRNA在前列腺肿瘤中的异常表达 consistently 被发现¹⁰，其中一些miRNA已被命名为针对前列腺癌的潜在新型治疗剂¹¹。因此，miRNA的异常表达水平可作为有用的诊断和/或预后生物标志物。本文介绍的实时qPCR方法可实现对前列腺肿瘤组织中miRNA水平的精确定量。所使用的miScript PCR系统能够检测成熟miRNA之间的单核苷酸差异。然而，miScript miRNA qPCR检测法不适用于检测茎环前体miRNA，对于此类前体miRNA，可使用不同的miScript前体检测法。

该技术的可靠性取决于输入RNA的质量，因此在进行实时PCR之前，应检测RNA的浓度、完整性和纯度。此外，核糖核酸酶非常稳定，容易降解RNA，因此在处理RNA时需格外小心。所有反应均应在冰上进行，以尽量减少RNA降解。逆转录前也可在反应体系中加入RNase抑制剂。操作过程中应频繁更换手套，并且整个实验过程必须使用无菌、一次性塑料耗材。

如果在实时荧光定量PCR中未扩增出.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
TRIzol 试剂	Invitrogen	15596
miScript 反转录试剂盒	Qiagen	218061
miScript 引物检测试剂	Qiagen	实验特异性
miScript SYBR Green PCR 试剂盒	Qiagen	218073
LightCycler 3.5 实时荧光定量 PCR 系统	Roche 集团
Light Cycler 毛细管	Roche 集团	04929292001
NanoDrop 1000 分光光度计	Thermo Fisher Scientific, Inc.	2538
Agilent 2100 Bioanalyzer	G2943CA