我们开发了一种基于介孔二氧化硅薄膜的技术，用于从人血清中选择性回收低分子量蛋白质和多肽。通过精细调控介孔芯片的理化性质，可有效控制多肽的富集过程，进而对血清蛋白质组进行分析，用于诊断目的。
本文内容
摘要
摘要
循环生物标志物的鉴定在无创性早期诊断、预后评估以及治疗效果监测方面具有巨大潜力1-3。循环低分子量蛋白质组（LMWP）由组织和细胞释放的小分子蛋白或大分子蛋白经蛋白水解降解产生的肽段组成，已被证实与患者的病理状态相关，可能反映了疾病的实际情况4,5。尽管具有这些潜在的临床应用价值，但由于血清中蛋白质和肽段的浓度动态范围极大，利用质谱法（MS）对生物体液中的LMWP进行分析仍面临巨大挑战6。若不进行样本预处理，血清/血浆中某些高丰度蛋白会掩盖低丰度成分的检测。目前基于蛋白质组学的方法，如二维聚丙烯酰胺凝胶电泳（2D-PAGE）和鸟枪法蛋白质组学技术，耗时费力、通量低，且在临床应用中适用性有限7-9。因此，亟需一种更有效的策略，用于从血液中分离LMWP，并实现临床样本的高通量筛选。
本文介绍了一种基于介孔二氧化硅芯片的快速、高效且可靠的多组分分离系统，可特异性靶向并富集低分子量蛋白质（LMWP）10,11。采用三嵌段共聚物模板法制备了在纳米尺度上具有可调特性的介孔二氧化硅（MPS）薄膜。通过在前驱体溶液中使用不同的聚合物模板及聚合物浓度，调控了多种孔径分布、孔结构、孔道连通性及表面性质，并将其应用于低分子量蛋白质的选择性回收。根据理化性质将富集的肽段选择性地划分为不同亚类，有助于提高对低丰度组分的回收与检测效率。结合质谱分析与统计学分析，我们揭示了介孔二氧化硅薄膜的纳米相特征与其在低分子量蛋白质组富集过程中的特异性及效率之间的关联。本文结果表明，这种基于纳米技术的方法有望成为从复杂生物液体中富集低分子量蛋白质的传统方法之外的一种强有力替代方案。由于该技术具备可调控材料特性、低成本生产、样品采集简便快速，以及显著降低分析所需样品量等优势，这一新型纳米技术将对蛋白质组生物标志物研究及临床蛋白质组学评估领域产生重大影响。
方案
1. 芯片制备
- 从水解的硅酸盐前体溶液开始制备芯片的包被溶液。在磁力搅拌（1200 rpm）下，将14 mL正硅酸乙酯（TEOS）、17 mL乙醇、6.5 mL去离子水和0.5 mL 6 M HCl混合。将该溶液在80 °C下加热2小时，并持续保持搅拌。
- 在室温下，将所需量的三嵌段共聚物（Pluronic F127、L121 和 P123）加入10 mL乙醇中，强力搅拌。随后，将7.5 mL硅酸盐溶液（来自步骤1.1）加入三嵌段共聚物溶液中，继续在室温下强力搅拌2小时，即得到最终的涂层溶液。
- 将1 mL包被溶液通过旋涂法涂覆于4英寸硅片上，转速为1500 rpm，持续20秒。随后在80 °C下加热12小时。
- 以每分钟升高1 °C的速率将薄膜加热至425 °C，以去除有机表面活性剂，随后在该温度下焙烧5小时。
- 使用氧气等离子体灰化仪（Plasma Asher - March Plasma System）对介孔二氧化硅（MPS）芯片表面进行预处理。2 流速：80 sccm，功率：300 W，时间：10 分钟。
- 可选表面化学修饰：将芯片在室温下于含3%有机硅烷的甲醇:去离子水（19:1）溶液中硅烷化处理72小时，置于N₂氛围中2 手套箱。依次用甲醇和去离子水冲洗。在鼓风烘箱中于 110 °C 下固化芯片 15 分钟。
2. 样品预处理
- 向每份血清样品中加入TFA和ACN，使终浓度分别为0.01% TFA和5% ACN。涡旋混匀。
- 在室温下将这些样品置于旋涡振荡器上振荡30分钟。
3. 血清分级分离
- 将芯片在 160 °C 的烘箱中过夜预烘烤。或者，将芯片存放在干燥器中，直至准备使用，以防止空气中的水分使芯片表面发生水合。
- 使用压缩空气吹去芯片表面可能存在的任何颗粒。
- 裁剪预先制备并购买的 CultureWell 带孔盖玻片，使其包含所需数量的孔。用 100% 乙醇清洁盖玻片，然后将其放置在 MPS 芯片表面。用镊子按压盖玻片，确保其与芯片完全密封。
- 将 10 μL 血清样本加入每个 3 mm 的孔中。在室温下的湿化环境中孵育 30 分钟。
- 用移液器吸出孔中的血清并弃去。向每个孔中加入 10 μL 去离子水，以洗去较大的蛋白质。重复此步骤 4 次。
- 向每个样本孔中加入 5 μL 洗脱缓冲液（0.1% TFA + 50% ACN）。在孔内移动移液器吸头的同时，反复吹吸 30 次，以充分混匀洗脱缓冲液。（每次仅对 1-2 个样本加样，以防止洗脱缓冲液过快蒸发）。
- 混匀后，将全部洗脱缓冲液吸出，并转移至微量离心管中，待进行 MALDI-TOF 分析时使用。
- 为模拟生物样本的复杂性，并评估我们芯片上分级系统在富集低分子量物质方面的效果，我们选择并配制了一种标准蛋白质和多肽混合物，共包含 26 种不同组分，其分子量范围广泛（900–66 500 Da），等电点（pI）范围为 4.0–10.2，浓度范围为 0.5–8 pmol/μL（参见 表 1 中的蛋白质列表）。
4. 肽的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析
- 取0.5 μL样品点样至MALDI靶板上，静置干燥。
- 取0.5 μL基质溶液（α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA），5 g/L）或含0.1% TFA的50%乙腈中饱和的反式-3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸（SA）溶液点样，静置共结晶。
- 取0.5 μL校准溶液点样至每个校准点，静置干燥。
- 将靶板插入MALDI-TOF质谱仪中。仪器应设置为正离子反射模式，激光强度为4200，每样品采集3000次。质荷比范围应设为800至5000 Da，目标质量设为2000 Da。
- 以线性模式进行相同的MALDI-TOF分析，但将质荷比范围调整为900至10,000 Da或3000至70,000 Da，目标质量设为5000 Da。
5. 数据分析
- 使用 ConvertPeakList 软件对原始谱图进行处理，并将数据导出至 SpecAlign 软件进行预处理。所有谱图均采用 PAFFT 相关法进行对齐，并将各对应谱图的强度归一化至总离子流（TIC）。所有谱图均以因子 4 进行平滑处理，并以因子 0.5 去除噪声。峰检测参数设置为基线 0.5、质量窗口 21 和高度比 1.5，分析前已去除负值。
- 使用 Cluster 3.0 进行层次聚类分析，并通过 MapleTree 软件进行可视化。MALDI MS 数据（m/z 峰强度）经对数转换、归一化及中位数中心化处理。采用 Pearson 相关系数计算样本间的距离，并进行完全连接聚类分析。
- 在进行无监督层次聚类分析之前，对每组检测到的 MS 峰在两组之间（n = 2 组）采用独立样本 Student t 检验进行比较。P 值小于或等于 0.02 被认为具有显著性，用于筛选不同介孔蛋白质组芯片（大孔 vs. 小孔）间差异富集的肽段和蛋白质。
6. 代表性结果
如图1所示，本研究中我们制备了一系列具有多种纳米结构的介孔二氧化硅薄膜，并系统地探讨了其在从人血清中选择性捕获和富集低分子量（LMW）肽和蛋白质方面的应用。图2a和b分别展示了未经处理的血清样品在900至10,000 Da范围内的肽段以及3,000 ~ 70,000 Da范围内的蛋白质的质谱图。这些谱图表明，由于白蛋白等易电离且高丰度的高分子量（HMW）蛋白质的存在，低分子量区域出现了明显的信号抑制。图2c和d展示了使用MPS L121（孔径6 nm）对血清样品进行分级处理后的质谱图，其中大部分大分子已被去除，从而实现了对低分子量组分的显著富集。作为对照，将相同的血清样品施加于非多孔的纯硅胶表面，以评估介孔二氧化硅薄膜在低分子量肽和蛋白质（LMWP）回收中的特异性。如图2e和f所示，在非多孔硅胶表面未观察到肽或蛋白质的显著富集。因此可以得出结论：介孔结构而非二氧化硅表面的亲和性，是实现LMWP富集的主要因素。
通过使用具有不同疏水嵌段长度的共聚物，可实现对孔径大小的精确调控。利用设计的蛋白质和多肽混合物，研究了孔径大小对低分子量（LMW）多肽和蛋白质回收效率的影响，所用MPS薄膜由四种Pluronic表面活性剂（F127、P123、L121以及L121加溶胀剂）制备而成，其亲水与疏水组分的体积比不同，分别形成3.7 nm、5.2 nm、7.4 nm和9.0 nm的孔径。该范围内的不同孔径可通过尺寸和形状排阻效应，从同一样本血清中回收出不同谱系的多肽和蛋白质（图3）。高分子量区域的蛋白谱图展示了每种芯片的分子截留阈值。除了高分子量（HMW）蛋白质的尺寸依赖性耗竭外，芯片对标准溶液的分级还显示出与孔径相关的差异性和选择性富集低分子量物种的现象。图3b所示的双向层次聚类展示了不同MSC芯片获得的低分子量标准品富集模式。即使所有多肽的分子量均低于芯片的截留阈值，孔径大小与被捕获物种的分子量之间仍存在正相关关系。具有较大孔径（最大达9 nm）的MSC芯片优先捕获较大的多肽，而较小孔径的芯片则更高效地回收较小的多肽。介孔结构的结构转变是通过调节模板聚合物的浓度实现的。提高模板聚合物的浓度会降低水相、共聚物和硅酸盐相之间的界面曲率，从而引发从球形结构向柱状结构的连续转变。Pluronic F127因其高分子量而具有高度的结构周期性。通过增加起始溶液中F127的浓度，可获得从三维（3D）到二维（2D）的不同MPS薄膜周期性纳米结构。尽管3D立方体和蜂窝状六方纳米结构与2D六方结构具有相似的孔径分布和相同的血清分级分子截留阈值，但前者具有更理想的纳米孔连通性和更易接近的纳米孔形貌，在选择性富集低分子量多肽方面表现出更优异的性能（图4）。我们还通过引入氧气等离子体灰化对MPS芯片表面进行预处理，从而简化了有机硅烷在MPS芯片上的偶联过程。为了定性研究静电效应对芯片上选择性富集的影响，我们使用了蛋白质和多肽混合物。MPS芯片（以L121制备并偶联化学功能基团）对蛋白质组学标准溶液进行分级后的质谱分析结果如图5所示。带正电荷和负电荷的多肽及低分子量蛋白质分别被捕获在阴离子型和阳离子型芯片上。多种MPS芯片在回收带正净电荷多肽方面的定量比较如图5a所示。与经APTES（-NH2）修饰的芯片相比，带负电荷的芯片以及未经修饰（原始带有轻微负电荷）的芯片对这些多肽的富集效果显著更高。相反，带正电荷的MPS芯片在回收带负净电荷的多肽方面表现出卓越能力，如图5b所示。然而，由于α-内啡肽的等电点（pI）约为6，其富集行为未表现出显著变化。
图 1. MPS芯片分级和低分子量（LMW）富集的原理。样品点样至表面后，低分子量蛋白质和肽段被截留在孔隙内，而较大分子则留在孔外，并在洗涤步骤中被去除。随后洗脱富集的组分，并通过基质辅助激光解吸电离（MALDI）进行分析。
图 2. 使用介孔二氧化硅薄膜芯片进行肽段富集。在介孔二氧化硅薄膜（L121，6 nm）上处理血清前后，MALDI 质谱图谱在低质量范围（900 至 10 000 Da）和高质量范围（3000 至 70 000 Da）的检测结果，分别为处理前（a, b）和处理后（c, d）。当使用空白非多孔二氧化硅表面时，分子回收率显著降低（e, f）。
图 3. MPS芯片的分子截留阈值及尺寸依赖性富集效应。（a）MALDI质谱图的放大视图，显示每种MPS芯片特有的分子截留阈值，该阈值与孔径大小相关。（b）不同芯片间肽段混合物特征的双向层次聚类分析。红色或黄色的深浅表示肽段的相对浓度。较大孔径的芯片更有利于较大肽段（3600 至 8500 Da）的富集，而较小肽段（900 至 3500 Da）则优先从较小孔径的芯片中回收。
图 4. MPS 薄膜的物理表征及具有不同纳米结构的选择性回收。XRD 图谱（a, b, c），TEM 图像（插图 a, b, c），前驱体溶液中 Pluronic F127 的不同浓度：4.0×10-3 M（a）、6.0×10-3 M（b）和 8.0×10-2 M（c）。（d）检测信号强度的柱状图，显示在三维立方和三维六方 F127 蛋白质组芯片（分别为 Cub 和 Hex）上的选择性多肽回收。不同的结构修饰表现出选择性富集。
图 5. 不同表面功能芯片的电荷特异性回收率。功能化芯片上选择性捕获肽的质谱检测强度条形图。根据等电点，肽在 pH 7.0 时带正电荷或负电荷。(a) 正电荷肽（(1) 去精氨酸1-缓激肽、(2) 缓激肽、(3) P 物质酰胺、(4) 神经降压素、(5) 促肾上腺皮质激素(1-17)、(6) 促肾上腺皮质激素(7-38)）在带负电荷的表面被特异性富集。(b) 负电荷肽（(7) 谷氨酸1-纤维蛋白肽B、(8) α-内啡肽、(9) 促肾上腺皮质激素(18-39)、(10) 胰岛素、(11) 表皮生长因子、(12) 胰岛素样生长因子II）在带正电荷的表面被特异性富集。请点击此处查看该图的放大版本。
图 6. 分馏血清的芯片上稳定化。（a）血清分馏后立即洗脱（上图）或室温下在芯片上储存 3 周后洗脱（下图）的低分子量肽和蛋白质的代表性 MALDI 图谱。（b）从上到下：将每份重复样品中检测到的质谱峰平均强度与第 1 份重复样品进行比较的线性回归分析，分别针对新鲜分馏的血清以及分馏后在 MPS 芯片上室温储存 3 周的血清。图中显示了方程、变异系数（CV）和决定系数（R2）。请点击此处查看此图的放大版本。
讨论
越来越多的证据表明，循环蛋白质组中的低分子量区域是用于疾病早期检测的诊断生物标志物的丰富来源。在本技术中，我们展示了一系列具有不同孔径、孔结构和表面修饰的介孔二氧化硅芯片，用于选择性富集肽段和低分子量蛋白质。为评估蛋白质稳定性，将MPS芯片与人血清孵育，洗涤后干燥，并在室温下保存3周。所获得的蛋白质/肽段图谱与新鲜分馏血清的结果相当（图6a），统计分析结果（图6b）进一步证实了这一点。通过平均变异系数（CV）估算，粗制血清的峰信号变异性为12.7%，分馏样品为14.2%。这种微小的差异可能源于MALDI仪器的内在变异性，表明芯片上的预处理和储存过程未引起质谱蛋白质谱图的显著改变。相同实验也在非多孔硅表面进行。在硅表面储存后回收的干燥血清，经MPS芯片分馏后再进行MALDI分析。所得质谱图谱较差，表明介孔表面具有更好的稳定化优势。类比先前提出的机制，我们假设被截留在纳米孔内的低分子量物质由于蛋白酶的尺寸排阻效应，或因在纳米孔受限空间内蛋白水解活性受到空间位阻抑制，从而避免了降解。基于MPS芯片的方法可能成为复杂生物液体中肽段和低分子量蛋白质谱分析研究的有力工具。MPS芯片制造成本低廉，且可实现规模化生产，从而同时处理大量样本，为探索性筛选和生物标志物发现提供了有利特性。
披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
本工作由纳米健康联盟预备中心资助项目（W81XWH-11-2-0168）和德克萨斯癌症纳米医学中心（1U54CA151668-01）资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 四乙氧基硅烷 | Sigma-Aldrich | 131903 | 98% |
| 旋涂仪 | Brewer Science, Inc. | Cee 200X | |
| 等离子体灰化仪 | Nordson March | AP-600 | |
| 光谱椭偏仪 | J. A. Woollam Co. | M-2000DI | |
| MALDI-TOF | Applied Biosystems | Voyager-DE-STR | |
| α-氰基-4-羟基肉桂酸 | Sigma-Aldrich | C8982 | MALDI-TOF基质 |
| 反式-3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸 | Sigma-Aldrich | 85429 | MALDI-TOF基质 |
| 加热磁力搅拌器 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 11-475-30Q | |
| CultureWell 多孔盖玻片 | Sigma-Aldrich | GBL103350 | 直径3 mm × 深度1 mm，容积3-10 μL，无菌 |
| Pluronic F 127 | BASF | PEO106-PPO70-PEO106 | |
| Pluronic L121 | BASF | PEO5-PPO70-PEO5 | |
| Pluronic P123 | BASF | PEO20-PPO70-PEO20 | |
| 表1. 所选肽和蛋白质标准品的理化性质及设计浓度（分子量和等电点）。 |
参考文献
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