收获小鼠肺泡巨噬细胞及评估聚酸酐纳米颗粒诱导的细胞活化

摘要

本文描述了分离小鼠肺泡巨噬细胞（肺部固有先天免疫细胞）并检测其在与聚酐纳米颗粒共培养后活化反应的实验方案。

摘要

可生物降解的纳米颗粒已成为设计和实施针对呼吸道传染病新型鼻内疫苗的多功能平台。特别是由脂肪族癸二酸（SA）、芳香族1,6-双(p-羧基苯氧基)己烷（CPH）或两亲性1,8-双(p-羧基苯氧基)-3,6-二氧杂辛烷（CPTEG）组成的聚酸酐纳米颗粒，具有独特的整体和表面侵蚀动力学特性^1,2，可用于在体内缓慢释放功能性生物分子（例如蛋白质抗原、免疫球蛋白等）in vivo^3,4,5。这些纳米颗粒还具有内在的佐剂活性，使其成为疫苗递送平台的理想选择^6,7,8。

为了阐明鼻内黏膜接种后固有免疫激活的机制，必须评估负责启动免疫应答的抗原呈递细胞（APCs）的分子与细胞反应。树突状细胞是传导气道中主要的抗原呈递细胞，而肺泡巨噬细胞（AMɸ）则在肺实质中占主导地位。^9,10,11. 巨噬细胞在清除肺部微生物病原体和细胞碎片方面效率极高^12,13此外，这类细胞在将微生物抗原转运至引流淋巴结方面发挥着重要作用，这是启动适应性免疫应答的重要第一步。⁹巨噬细胞还表达较高水平的天然模式识别受体和清道夫受体，分泌促炎介质，并激活初始T细胞^12,14通过肺灌洗可轻松获得相对纯净的肺泡巨噬细胞群体（例如，纯度高于80%），用于实验室研究。从免疫功能健全的动物中分离的定居型肺泡巨噬细胞，能够代表实际接触基于颗粒的疫苗的巨噬细胞表型。 体内本文描述了从小鼠中分离和培养腹腔巨噬细胞（AMɸ）的实验方案，并研究了聚酸酐纳米颗粒处理后巨噬细胞的活化表型。 体外.

方案

1. 通过肺灌洗从小鼠中收获肺泡巨噬细胞（AMɸ）

1. 穿戴适当的个人防护装备（PPE），例如实验服、一次性手套和合适的眼部防护装置。
2. 在开始收获前准备完全培养基（cAMɸ）。向222.25 mL的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中加入2.5 mL青霉素/链霉素（pen/strep）溶液、250 μL β-巯基乙醇（2-巯基乙醇）以及25 mL热灭活胎牛血清（FBS）。在负压条件下，使用0.2 μm孔径的瓶顶滤器对cAMɸ培养基进行过滤除菌。
3. 在安乐死舱内通过CO₂窒息法对健康小鼠实施安乐死。尽管本项目使用的是6至8周龄的C57BL/6小鼠，但该肺灌洗技术适用于任何品系的小鼠。使用压缩气体钢瓶，在将小鼠放入舱内前先向舱内通气1分钟，以确保舱内已完全充满CO₂。将小鼠置于舱内至少1分钟以完成安乐死。此外，通过心脏穿刺放血作为物理方法确认小鼠死亡，具体操作如1.4所述。
4. 将小鼠仰卧放置（背侧朝上），喷洒70%乙醇消毒，定位胸骨，并以与腹部呈30度角的方向，将连接1 mL注射器的23号针头插入胸腔约50 mm。若针头位置正确，可根据小鼠体型采集0.4至1 mL血液。检查动物生命体征是否停止。
5. 将小鼠放置于实验台上，使其俯卧（腹侧朝下）。用70%乙醇喷洒小鼠以消毒操作环境。在小鼠脊柱中段附近捏起皮肤。使用经70%乙醇消毒的解剖剪，在皮肤上做一个小切口。
6. 抓住切口两侧的皮肤，....

讨论

聚酸酐纳米颗粒疫苗平台在单剂量鼻内给药时已显示出有效性⁵。检测该疫苗递送平台诱导的肺部常驻吞噬细胞群体的活化情况，有助于评估其最终促进适应性免疫应答的潜在能力。

具体而言，从肺泡灌洗液中分离肺泡巨噬细胞，并用不同配方的纳米颗粒进行处理，可深入了解不同颗粒化学性质激活巨噬细胞的能力，从而促进抗原呈递^6,8。此外，这些体外（in vitro）研究对于在开展更大规模且更复杂的体内（in vivo）研究之前，评估这些颗粒佐剂配方激活肺泡巨噬细胞的潜力具有重要意义。实验中应始终设置表面标志物上调的阳性对照处理，例如使用Toll样受体4的激动剂脂多糖（LPS）。在采集肺泡巨噬细胞前进行实验设计时需格外注意，因为本方案可能无法获得单次实验中多种处理所需的足够细胞数量。因此，可能需要对多只小鼠进行肺泡灌洗，以确保获得足够数量的细胞（每只小鼠约 5.0 × 10⁵ 个细胞），满足包含更多处理组的较大规模实验需求。其他物种的肺泡灌洗技术也有报道，所用灌洗液体积与所研究物种的肺容量成正比（例如，小鼠肺.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>cAM 培养基
DMEM	Cellgro	15-013-CV
50 mM 2-巯基乙醇–乙醇	Sigma-Aldrich	M3148-25ML
青霉素/链霉素 10,000 μg/mL 溶液	Cellgro	30-002-CI
胎牛血清	Atlanta Biologicals	S11150
<强>FACS 缓冲液
氯化钠	Fisher Scientific	S671-500
磷酸钠	Fisher Scientific	MK7868500
氯化钾	Fisher Scientific	P217500
磷酸钾	Fisher Scientific	P288-200
BSA（牛血清白蛋白）	Sigma-Aldrich	A7888
叠氮化钠	Sigma-Aldrich	S2002
<强>抗体
大鼠IgG	Sigma-Aldrich	I4341
抗小鼠 CD16/32	eBioscience	16-0161
抗小鼠MHC II类单倍型I-A/I-E，克隆株M5/114.15.2，与异硫氰酸荧光素（FITC）偶联	eBioscience	11-5321
抗小鼠 CD86，克隆株 GL-1，偶联藻红蛋白别藻青素（APC）-Cy7	Biolegend	105030
抗小鼠 CD40，克隆 1C10，APC 标记	eBioscience	17-0401
抗小鼠 CD209，克隆 5H10，生物素标记	eBioscience	13-2091
抗小鼠 CD11b，克隆 M1/70，偶联 Alexa Fluor 700	eBioscience	56-0112
抗小鼠 F4/80，克隆株 BM8，与藻红蛋白偶联–PE-Cy7	eBioscience	25-4801
PE-Texas red 标记的链霉亲和素	BD 生物科学	551487
<强>其他耗材与试剂
乙醇	Fisher Scientific	A405-20	用作70%（v/v）
压缩 CO2	Linweld	16000060
1 mL注射器	BD 生物科学	309659
Sovereign 3 ½" Fr Tom Cat导管	Kendall	703021
生物安全柜	NUAIRE	第22系列
解剖剪	Fisher Scientific	138082
镊子	Roboz外科器械公司	RS-8254
不含钙和镁的1× PBS	Cellgro	21-040-CM
带螺旋盖的15 mL离心管	VWR 国际公司	21008-216
六孔组织培养处理板	Costar	3516
塑料试管架	Nalge Nunc International	5970
细胞刮刀 24 cm	Techno Plastic Products	99002
5 mL 聚苯乙烯圆底管	Falcon BD	352008
Pipet-aid XL	Drummond Scientific	4-000-105
10、5 和 2 mL 移液管	Fisher Scientific	13-675
200 和 10 μL 微量移液器	Gilson Pipetman	F123601
200 和 10 μL型移液器吸头	Fisher Scientific	02-707
BD固定稳定剂	BD 生物科学	338036
Isoton II 稀释液	贝克曼库尔特公司	8546719
Zap-oglobin II 裂解液	贝克曼库尔特公司	7546138
库尔特计数器聚苯乙烯小瓶	贝克曼库尔特公司	14310-684
试管	BD 生物科学	352008
<强>仪器设备
冷冻离心机	Labnet International	50075040
加湿培养箱 CO2	Nuaire	Model Autoflow 8500
FACSCanto 流式细胞仪	BD 生物科学	338960
库尔特颗粒计数器 Z1	贝克曼库尔特公司	WS-Z1DUALPC
带微探头的超声波液体处理设备	Misonix	型号 S-4000