本文描述了分离小鼠肺泡巨噬细胞（肺部固有先天免疫细胞）并检测其在与聚酐纳米颗粒共培养后活化反应的实验方案。
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摘要
摘要
可生物降解的纳米颗粒已成为设计和实施针对呼吸道传染病新型鼻内疫苗的多功能平台。特别是由脂肪族癸二酸（SA）、芳香族1,6-双(p-羧基苯氧基)己烷（CPH）或两亲性1,8-双(p-羧基苯氧基)-3,6-二氧杂辛烷（CPTEG）组成的聚酸酐纳米颗粒，具有独特的整体和表面侵蚀动力学特性1,2，可用于在体内缓慢释放功能性生物分子（例如蛋白质抗原、免疫球蛋白等）in vivo3,4,5。这些纳米颗粒还具有内在的佐剂活性，使其成为疫苗递送平台的理想选择6,7,8。
为了阐明鼻内黏膜接种后固有免疫激活的机制，必须评估负责启动免疫应答的抗原呈递细胞（APCs）的分子与细胞反应。树突状细胞是传导气道中主要的抗原呈递细胞，而肺泡巨噬细胞（AMɸ）则在肺实质中占主导地位。9,10,11. 巨噬细胞在清除肺部微生物病原体和细胞碎片方面效率极高12,13此外，这类细胞在将微生物抗原转运至引流淋巴结方面发挥着重要作用，这是启动适应性免疫应答的重要第一步。9巨噬细胞还表达较高水平的天然模式识别受体和清道夫受体，分泌促炎介质，并激活初始T细胞12,14通过肺灌洗可轻松获得相对纯净的肺泡巨噬细胞群体（例如，纯度高于80%），用于实验室研究。从免疫功能健全的动物中分离的定居型肺泡巨噬细胞，能够代表实际接触基于颗粒的疫苗的巨噬细胞表型。 体内本文描述了从小鼠中分离和培养腹腔巨噬细胞（AMɸ）的实验方案，并研究了聚酸酐纳米颗粒处理后巨噬细胞的活化表型。 体外.
方案
1. 通过肺灌洗从小鼠中收获肺泡巨噬细胞（AMɸ）
- 穿戴适当的个人防护装备（PPE），例如实验服、一次性手套和合适的眼部防护装置。
- 在开始收获前准备完全培养基（cAMɸ）。向222.25 mL的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中加入2.5 mL青霉素/链霉素（pen/strep）溶液、250 μL β-巯基乙醇（2-巯基乙醇）以及25 mL热灭活胎牛血清（FBS）。在负压条件下，使用0.2 μm孔径的瓶顶滤器对cAMɸ培养基进行过滤除菌。
- 在安乐死舱内通过CO2窒息法对健康小鼠实施安乐死。尽管本项目使用的是6至8周龄的C57BL/6小鼠，但该肺灌洗技术适用于任何品系的小鼠。使用压缩气体钢瓶，在将小鼠放入舱内前先向舱内通气1分钟，以确保舱内已完全充满CO2。将小鼠置于舱内至少1分钟以完成安乐死。此外，通过心脏穿刺放血作为物理方法确认小鼠死亡，具体操作如1.4所述。
- 将小鼠仰卧放置（背侧朝上），喷洒70%乙醇消毒，定位胸骨，并以与腹部呈30度角的方向，将连接1 mL注射器的23号针头插入胸腔约50 mm。若针头位置正确，可根据小鼠体型采集0.4至1 mL血液。检查动物生命体征是否停止。
- 将小鼠放置于实验台上，使其俯卧（腹侧朝下）。用70%乙醇喷洒小鼠以消毒操作环境。在小鼠脊柱中段附近捏起皮肤。使用经70%乙醇消毒的解剖剪，在皮肤上做一个小切口。
- 抓住切口两侧的皮肤，并沿小鼠头尾轴方向向相反方向拉伸皮肤。操作正确时，皮肤将从小鼠尸体上完全剥离。
- 此时小鼠颈部应暴露出肌肉和腺体。小心剪开该组织，并用镊子将其向小鼠前部牵拉，从而暴露小鼠的喉部、气管和食管。注意避免损伤颈静脉或颈动脉。
- 气管现已可见，其特征为周围有软骨环的组织。用镊子轻轻夹住气管，小心提起并将其与位于背侧的食管分离。
- 在夹持气管位置的前方、喉部后方做一个小切口，切口角度约为45°。注意不要完全横断气管，以免其回缩至体腔内。
- 用无菌PBS填充配有Tom Cat导管的1 cc注射器，准备将导管插入气管腔内。用镊子固定气管，用手握住导管靠近尖端处以增强控制，然后轻轻将其插入气管切口处。将导管轻柔地插入气管约20 mm。用手指夹紧导管周围的气管，释放另一只手。
- 使用配有导管的1 mL注射器，缓慢向肺部注入0.75 mL室温无菌PBS，然后轻柔地将PBS回吸至注射器中。重复此过程三次，同时对外部胸部进行轻柔按摩。将注射器从导管上断开，将灌洗液排入15 mL离心管中。用0.75 mL新鲜PBS重新填充注射器并重新连接至导管后，对每只小鼠重复步骤1.9和1.10两次。液体回收可能不完全，回收量可能少于注入量。若从多只小鼠中收集细胞，请将含有收获细胞的15 mL管置于冰上，直至所有肺灌洗操作完成。
2. 肺泡灌洗液中肺泡巨噬细胞的收获处理
- 将肺灌洗液在 4 °C 条件下以 250 x g 离心 10 分钟。
- 采用无菌操作技术，在生物安全柜内将上清液倾入适当的废液容器中。通过将离心管在试管架顶部轻轻刮动，重悬细胞沉淀。加入 1 mL cAMɸ 培养基以重悬细胞。
- 使用 Coulter Particle Counter Z1 对细胞进行计数：将 20 μL 细胞悬液加入含 10 mL Isoton II 稀释液的 Coulter 计数管中。向管中加入 3 至 4 滴 Zap-oglobin II 裂解试剂，轻轻倒置混匀 3 至 4 次，然后将样品管加载到计数仪上以获得细胞浓度。务必在计数仪中设置稀释倍数为 2 x 104，以便显示每毫升的细胞数量。
- 用 cAMɸ 培养基将细胞稀释至每毫升 2.5 x 105 个细胞。
- 将每毫升含 2.5 x 105 个细胞的悬液 2 mL 分装至 6 孔组织培养板的每个孔中。
- 为富集 AMɸ，将培养板置于 37 °C、含 5% CO2 的湿润培养箱中孵育 6 小时，使细胞贴附于孔底。轻轻吸除上清液，避免扰动贴壁细胞。
- 使用无菌 PBS（不含钙和镁）冲洗各孔，以去除未贴壁的细胞和碎片。每孔加入 2 mL cAMɸ 培养基。
- 在添加刺激物之前，将细胞在 37 °C、含 5% CO2 的湿润培养箱中过夜孵育。经过此富集步骤后，约 87% 的细胞对巨噬细胞标志物 CD11b 和 F4/80 呈阳性（图 2c）。
3. 添加聚酸酐纳米颗粒及对照处理
- 通过聚酸酐反溶剂纳米封装技术制备纳米颗粒15。在此过程中，将聚合物溶解于二氯甲烷中（4 °C，浓度为 25 mg/mL），并在戊烷中沉淀（-20 °C，二氯甲烷与戊烷体积比为 1:200）。
- 使用无菌称量纸在可精确测量微克量级的天平上称取聚酸酐纳米颗粒。将颗粒加入1.5 mL 微量离心管中。
- 用冰上预冷的cAMɸ重悬纳米颗粒。计算时应确保每孔加入的培养基体积不超过0.3 mL，以达到所需的纳米颗粒浓度。重悬后的颗粒需保持在冰上，直至加入细胞培养孔中。
- 在将纳米颗粒加入AMɸ培养物之前，使用带有微探头的台式超声仪对颗粒进行超声处理。超声前，用70%乙醇喷洒微探头并用无菌Kimwipe擦拭以灭菌。将离心管置于冰上，以10–20 焦耳功率超声30至45秒。肉眼观察纳米颗粒悬液。若颗粒分散不充分，将悬液在冰上静置1至2分钟，确保纳米颗粒温度低于聚合物的玻璃化转变温度后，再重复超声30至45秒。该超声步骤的目的是充分分散纳米颗粒，因为50:50 CPTEG:CPH纳米颗粒在接触水性环境时容易发生聚集。然而，悬液中仍可能存在少量小聚集体。
- 充分分散后的纳米颗粒悬液应保持在冰上，并立即使用，以防止过早的表面侵蚀或聚集。
- 从培养箱中取出含有AMɸ的培养皿，放入生物安全柜中。将培养板倾斜约45度角，用移液器吸除将要加入纳米颗粒悬液的等量培养基（不应超过0.3 mL）。移除培养基时避免扰动贴壁细胞。
- 在将聚酸酐纳米颗粒悬液加入相应孔之前，短暂涡旋混匀。将适量纳米颗粒悬液（不超过0.3 mL）加入指定孔中；但不要反复吹打混匀，以免导致贴壁AMɸ脱落。颗粒将沉降至孔底并与细胞接触。本报告所述研究中，与AMɸ共培养的纳米颗粒终浓度为125 μg/mL。依次处理后续孔及所需处理组。应包括阳性和阴性对照组，例如仅含培养基的对照孔以及含200 ng/mL脂多糖（LPS）的处理孔。
- 将培养皿放回37 °C、含5% CO2的加湿培养箱中培养48小时。本实验室的动力学研究表明，48小时是评估细胞表面标志物表达和细胞因子分泌的最佳培养时间，因其为转录和蛋白质合成提供了充足的时间。尽管在更长的培养时间（如72小时）内细胞因子积累水平更高，但在该时间点评估表面标志物表达可能受到高水平细胞因子的干扰，所观察到的表面标志物表达变化可能并非直接由纳米颗粒刺激引起。
4. 使用流式细胞术评估巨噬细胞活化
- 在收集与纳米颗粒或刺激物共培养的贴壁巨噬细胞之前，用 0.1 M 磷酸盐缓冲液（pH 7.4）配制流式细胞分选（FACS）缓冲液（含 0.1% 叠氮化钠和 0.1% 牛血清白蛋白（BSA））。
- 配制封闭缓冲液和单克隆抗体的工作液。封闭缓冲液的配制方法：将大鼠 IgG（Sigma）和抗 CD16/32 抗体（eBioscience）分别用 FACS 缓冲液稀释至 1 mg/mL 和 10 μg/mL。将表面标志物抗体组合按制造商推荐浓度或用户优化浓度用 FACS 缓冲液稀释。本研究中所用的表面标志物组合包括针对 MHC II、CD86、CD40 和 CIRE（CD209）的抗体。为在数据分析过程中准确鉴定巨噬细胞表型，该组合中还包含针对巨噬细胞标志物 F4/80 和 CD11b 的抗小鼠抗体。选择针对 MHC II 分子的抗体时需格外注意，因为近交系小鼠的 MHC II 单倍型常有差异，所选抗体必须能与目标小鼠品系所表达的特定 MHC 同种异体抗原发生反应。
- 与纳米颗粒和/或刺激物共孵育 48 小时后，将细胞培养皿置于冰上 20 分钟。使用 24 cm 细胞刮刀轻轻刮取培养孔，以脱离贴壁的巨噬细胞。
- 使用 5 mL 移液管，将细胞和培养基轻柔吹打 5 次，制成单细胞悬液。将各孔中的内容物分别转移至独立的 5 mL 聚苯乙烯管中，避免不同实验处理组的细胞混合。
- 向每根试管中加入 2 mL FACS 缓冲液。
- 在 4 °C 条件下，以 250 × g 离心 10 分钟。
- 弃去上清液，通过将试管在试管架顶部轻轻刮动，使细胞沉淀在残留液体中轻柔重悬。
- 为防止单克隆抗体发生非特异性结合，向每根细胞管中加入 10 μL 封闭缓冲液（按 4.2 步骤配制）。涡旋混匀后，冰上孵育 30 分钟。
- 向每根试管中加入适量稀释的单克隆抗体，避光冰上孵育 15 分钟。待分析样品的试管应加入多色抗体组合（各实验室应事先优化抗体组合）。为正确设定流式细胞仪的采集参数，应包括未标记抗体的细胞管以及分别使用单一荧光标记的补偿管作为额外对照组。为准确设定流式细胞分析的设门，采集过程中应包含荧光减一（FMO）对照。FMO 对照是指使用组合中所有荧光素标记的抗体进行染色，但其中一种抗体被其相应的同型对照替代的细胞样本。FMO 和补偿对照管中还应包括阳性与阴性细胞群体（即分别用阳性对照刺激物和仅培养基处理的细胞等分试样）。
- 向每根试管中加入 2 mL FACS 缓冲液，涡旋混匀，并在 4 °C 条件下以 250 × g 离心 10 分钟。
- 弃去上清液，通过将试管在试管架顶部轻轻刮动，使细胞沉淀在残留液体中重悬。
- 若抗体组合中包含未直接偶联荧光素、而是偶联生物素的抗体，则需使用荧光素标记的链霉亲和素来检测表面标志物。在此步骤中，加入适量稀释的荧光素标记链霉亲和素，避光冰上孵育 15 分钟。与步骤 4.2 相同，链霉亲和素应稀释至制造商推荐浓度或用户优化浓度。此步骤仅适用于包含生物素化一抗的抗体组合。
- 按照步骤 4.10 所述进行洗涤步骤。
- 将 BD 固定稳定剂按 1:3 体积比用去离子水稀释。在轻柔涡旋条件下，向每根试管中加入 100 μL 稀释后的固定剂，以防止细胞聚集。标记并固定的细胞可在 4 °C 避光条件下稳定保存约一周，之后进行流式细胞仪检测。
5. 代表性数据
3.1 步骤中制备的纳米颗粒平均直径为 163 ± 24 nm，其形貌与先前研究中获得的结果一致5,16。在超声处理前后的溶液中纳米颗粒的形态如图 1所示，以说明超声处理对于确保颗粒充分分散的必要性。通过肺灌洗获取的肺泡巨噬细胞经流式细胞术分析的结果如图 2所示。使用抗小鼠 CD11b 和抗小鼠 F4/80 抗体组合以及相应的 FMO 对照对细胞进行标记，可确定背景标记水平、鉴定肺泡巨噬细胞并设门用于进一步分析。用聚酸酐纳米颗粒处理肺泡巨噬细胞可增强其活化，表现为 MHC II、CD40、CD86 和 CIRE 的平均荧光强度增加（图 3）。
图 1. 超声处理前（A）和超声处理30秒后（B）的50:50 CPTEG:CPH 纳米颗粒。
图 2. 收获的肺泡巨噬细胞经（A）Alexa Fluor 700 标记的抗CD11b抗体与PE-Cy7同型对照、（B）Alexa Fluor 700同型对照与PE-Cy7标记的抗F4/80抗体、以及（C）Alexa Fluor 700标记的抗CD11b抗体与PE-Cy7标记的抗F4/80抗体染色后的流式细胞术分析结果。右上角的数值表示双阳性细胞的百分比。
图3. 直方图显示，肺泡巨噬细胞与50:50 CPTEG:CPH 聚酸酐纳米颗粒共培养48小时后，MHC II（A）、CD40（B）、CD86（C）和 CIRE（D）表面表达的荧光强度增加。直方图展示了以下三组结果：作为FMO对照的肺泡巨噬细胞（AMɸ）（
）、未处理但用针对所有细胞表面标志物的抗体标记的AMɸ（
），以及与纳米颗粒共培养并用针对所有细胞表面标志物的抗体标记的AMɸ（
）。
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讨论
聚酸酐纳米颗粒疫苗平台在单剂量鼻内给药时已显示出有效性5。检测该疫苗递送平台诱导的肺部常驻吞噬细胞群体的活化情况，有助于评估其最终促进适应性免疫应答的潜在能力。
具体而言，从肺泡灌洗液中分离肺泡巨噬细胞，并用不同配方的纳米颗粒进行处理，可深入了解不同颗粒化学性质激活巨噬细胞的能力，从而促进抗原呈递6,8。此外，这些体外（in vitro）研究对于在开展更大规模且更复杂的体内（in vivo）研究之前，评估这些颗粒佐剂配方激活肺泡巨噬细胞的潜力具有重要意义。实验中应始终设置表面标志物上调的阳性对照处理，例如使用Toll样受体4的激动剂脂多糖（LPS）。在采集肺泡巨噬细胞前进行实验设计时需格外注意，因为本方案可能无法获得单次实验中多种处理所需的足够细胞数量。因此，可能需要对多只小鼠进行肺泡灌洗，以确保获得足够数量的细胞（每只小鼠约 5.0 × 105 个细胞），满足包含更多处理组的较大规模实验需求。其他物种的肺泡灌洗技术也有报道，所用灌洗液体积与所研究物种的肺容量成正比（例如，小鼠肺...
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致谢
作者感谢美国陆军医学研究与物资司令部（资助编号：W81XWH-09-1-0386 和 W81XWH-10-1-0806）提供的经费支持，以及爱荷华州立大学流式细胞术实验室的 Shawn Rigby 博士提供的专业技术协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>cAM 培养基 | |||
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| 50 mM 2-巯基乙醇–乙醇 | Sigma-Aldrich | M3148-25ML | |
| 青霉素/链霉素 10,000 μg/mL 溶液 | Cellgro | 30-002-CI | |
| 胎牛血清 | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| <强>FACS 缓冲液 | |||
| 氯化钠 | Fisher Scientific | S671-500 | |
| 磷酸钠 | Fisher Scientific | MK7868500 | |
| 氯化钾 | Fisher Scientific | P217500 | |
| 磷酸钾 | Fisher Scientific | P288-200 | |
| BSA（牛血清白蛋白） | Sigma-Aldrich | A7888 | |
| 叠氮化钠 | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| <强>抗体 | |||
| 大鼠IgG | Sigma-Aldrich | I4341 | |
| 抗小鼠 CD16/32 | eBioscience | 16-0161 | |
| 抗小鼠MHC II类单倍型I-A/I-E，克隆株M5/114.15.2，与异硫氰酸荧光素（FITC）偶联 | eBioscience | 11-5321 | |
| 抗小鼠 CD86，克隆株 GL-1，偶联藻红蛋白别藻青素（APC）-Cy7 | Biolegend | 105030 | |
| 抗小鼠 CD40，克隆 1C10，APC 标记 | eBioscience | 17-0401 | |
| 抗小鼠 CD209，克隆 5H10，生物素标记 | eBioscience | 13-2091 | |
| 抗小鼠 CD11b，克隆 M1/70，偶联 Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0112 | |
| 抗小鼠 F4/80，克隆株 BM8，与藻红蛋白偶联–PE-Cy7 | eBioscience | 25-4801 | |
| PE-Texas red 标记的链霉亲和素 | BD 生物科学 | 551487 | |
| <强>其他耗材与试剂 | |||
| 乙醇 | Fisher Scientific | A405-20 | 用作70%（v/v） |
| 压缩 CO2 | Linweld | 16000060 | |
| 1 mL注射器 | BD 生物科学 | 309659 | |
| Sovereign 3 ½" Fr Tom Cat导管 | Kendall | 703021 | |
| 生物安全柜 | NUAIRE | 第22系列 | |
| 解剖剪 | Fisher Scientific | 138082 | |
| 镊子 | Roboz外科器械公司 | RS-8254 | |
| 不含钙和镁的1× PBS | Cellgro | 21-040-CM | |
| 带螺旋盖的15 mL离心管 | VWR 国际公司 | 21008-216 | |
| 六孔组织培养处理板 | Costar | 3516 | |
| 塑料试管架 | Nalge Nunc International | 5970 | |
| 细胞刮刀 24 cm | Techno Plastic Products | 99002 | |
| 5 mL 聚苯乙烯圆底管 | Falcon BD | 352008 | |
| Pipet-aid XL | Drummond Scientific | 4-000-105 | |
| 10、5 和 2 mL 移液管 | Fisher Scientific | 13-675 | |
| 200 和 10 μL 微量移液器 | Gilson Pipetman | F123601 | |
| 200 和 10 μL型移液器吸头 | Fisher Scientific | 02-707 | |
| BD固定稳定剂 | BD 生物科学 | 338036 | |
| Isoton II 稀释液 | 贝克曼库尔特公司 | 8546719 | |
| Zap-oglobin II 裂解液 | 贝克曼库尔特公司 | 7546138 | |
| 库尔特计数器聚苯乙烯小瓶 | 贝克曼库尔特公司 | 14310-684 | |
| 试管 | BD 生物科学 | 352008 | |
| <强>仪器设备 | |||
| 冷冻离心机 | Labnet International | 50075040 | |
| 加湿培养箱 CO2 | Nuaire | Model Autoflow 8500 | |
| FACSCanto 流式细胞仪 | BD 生物科学 | 338960 | |
| 库尔特颗粒计数器 Z1 | 贝克曼库尔特公司 | WS-Z1DUALPC | |
| 带微探头的超声波液体处理设备 | Misonix | 型号 S-4000 |
参考文献
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