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方法文章

利用微吸管对贴壁细胞进行吸吮以评估细胞刚性

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DOI：

10.3791/3886

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2012年9月27日

 ,  ,  , 
1Section of Respiratory, Critical Care and Sleep Medicine, Department of Medicine, University of Illinois, 2Institute for Medicine and Engineering, University of Pennsylvania

本文内容

摘要

本文介绍一种快速、简单的细胞刚度测量方法。该方法的基本原理是通过微管对细胞表面施加明确定义的负压，测量细胞膜在负压作用下的形变。该方法为研究贴壁细胞的生物力学特性提供了一种强有力的工具。

摘要

越来越多的研究表明，单个细胞的生物力学特性在多种细胞功能中发挥着重要作用，包括细胞增殖、分化、迁移以及细胞间相互作用。细胞生物力学的两个关键参数是细胞的可变形性（或称刚度）以及细胞收缩并产生力的能力。本文介绍一种快速简便的方法，通过测量玻璃微吸管对细胞表面施加负压时细胞膜的变形程度，来估算细胞刚度，该技术称为微吸管吸吮法（Micropipette Aspiration）或微吸法。

微吸术通过拉制玻璃毛细管，制备出具有极小尖端（直径为2-50 μm，具体取决于细胞或组织样本的大小）的微移液管，然后将其连接至气动压力传感器，并在显微镜下移至细胞附近。当移液管尖端接触细胞时，气动压力传感器向移液管施加一步负压，从而在细胞膜上产生明确的压力。作为对压力的响应，细胞膜被吸入移液管内，膜的逐步形变或“膜突起”进入移液管的程度随时间被测量。该实验方法的基本原理是：细胞膜在特定机械力作用下的形变程度取决于膜的刚度。膜越刚硬，其形变速率越慢，稳态吸吮长度也越短。该技术可用于悬浮或贴附于基底的分离细胞、大型细胞器以及脂质体。

通过比较不同细胞群体或实验条件下，给定压力所达到的最大膜变形程度来进行分析。通过绘制膜变形的吸入长度随施加压力变化的函数关系，可估算“刚度系数”。此外，可进一步分析数据以估算细胞的杨氏模量（E），这是表征材料刚度最常用的参数。需要注意的是，真核细胞的质膜可被视为一个双组分系统，其中膜脂双层下方由膜下细胞骨架支撑，而正是细胞骨架构成了膜的机械支架，并主导了细胞包膜的可变形性。因此，该方法可用于探究膜下细胞骨架的生物力学特性。

方案

1. 拉制玻璃微电极

设备： 微电极拉制仪，显微操作仪。

玻璃： 硼硅酸盐玻璃毛细管（外径约 1.5 mm，内径约 1.4 mm）。

  1. 拉制微移液管采用与制备电生理记录用玻璃微电极相似的基本方法。简而言之，将一根玻璃毛细管在中间加热，当玻璃开始熔化时，将毛细管的两半拉开，从而形成两根微移液管。目前有多种商用拉制仪可用于该过程，从利用重力将两根移液管分开的相对简单的垂直拉制仪，到可编程控制拉速及其他拉制参数的高精度水平拉制仪均有涵盖。在我们的实验中，两种类型的拉制仪均有使用。
  2. 移液管尖端几何形状的要求：本实验所用移液管的尖端外径通常介于2至6 μm之间，具体取决于细胞的大小。另一个重要参数是尖端的形状，应近似为圆柱形管状（见图1）。可通过优化拉制参数并在显微镜下观察尖端形状，直至获得理想形态来实现该目标。移液管杆部的最佳长度取决于预期的变形程度：若变形较小（<10 μm），则移液管的圆柱状部分也可相对较短（同数量级）；对于更大的变形，应相应调整长度。通常，提高加热温度和/或增加“拉力”可减小尖端直径，而增加“拉力”还会产生更长的锥形过渡段。在我们的实验中，使用Sutter P-97水平拉制仪，程序优化为以下参数：加热值473；拉力22；速度22；时间200；压力500。也可通过拉制极长的杆部，随后折断并抛光来制备圆柱形尖端。Sutter操作手册中提供了制备不同类型移液管的详细说明。
  3. 微加工仪（Microforge）：建议对移液管尖端进行火焰抛光，以形成光滑的玻璃表面，从而与细胞质膜形成良好的密封。该操作通过微加工仪将移液管尖端短暂地靠近加热的玻璃球来完成，时间仅为极短的一瞬间。类似技术在制备电生理记录用微电极时也常规使用。
  4. 填充微移液管：微移液管应填充生理盐溶液，如PBS或非荧光培养基。重要的是，溶液中应添加30%血清，以使细胞膜能够顺畅地进入移液管内。可采用两种方法去除移液管尖端的气泡：（i）先将移液管尖端浸入溶液中，利用毛细作用使液体充满尖端，再从另一端反向填充移液管；或（ii）从移液管后端完全填充，同时轻轻敲击杆部以驱除尖端的气泡。
  5. 注意：移液管必须在实验当天制备。

2. 细胞的制备

  1. 接种细胞：对悬浮培养或贴附于基质上的单个细胞进行微吸管穿刺。对于悬浮细胞，需在实验前将细胞从基质上解离，并用移液器转移至安装在倒置显微镜上的浅层纵向腔室中。对于贴壁细胞，则需将其接种于小型盖玻片（直径约10 mm）上，并在实验前将盖玻片置于微吸管穿刺腔室内。采用浅层纵向腔室的设计原理是使微吸管能够以非常小的角度、尽可能接近水平方向接近细胞，从而确保被吸入微吸管内的细胞膜可在单一焦平面上清晰成像（见图2）。
  2. 观察细胞膜：为观察细胞膜在吸管内的延伸情况，需使用亲脂性荧光染料（如diI）对细胞膜进行染色，染色步骤遵循标准操作流程。
    1. 预热PBS溶液。
    2. 用预热的PBS溶液将diI储备液稀释至工作浓度（5 μM）。
    3. 超声处理5分钟，以打散染料聚集体。
    4. 离心5分钟，取上清液。
    5. 用PBS洗涤细胞3次，每次5分钟。
    6. 将细胞与染料溶液在37 °C培养箱中孵育30分钟。
    7. 用PBS洗涤细胞3次，每次5分钟。
  3. 注意：也可用观察膜下细胞骨架的方法替代细胞膜染色，因为细胞骨架会随细胞膜一同被拉入吸管内。但需注意，干扰细胞骨架可能改变细胞的生物力学特性。此外，在对贴壁细胞进行微吸管穿刺实验时，建议采用三维成像技术，以准确估算位于细胞焦平面倾斜角度下的吸管内膜延伸长度。

3. 微吸管吸取与图像采集

设备：倒置荧光显微镜，最好具备三维去卷积功能（如蔡司Axiovert 200M，配备由计算机控制物镜Z轴移动的系统，或性能相当的设备）；连接至计算机的摄像机（如AxioCam MRm或性能相当的设备）；压力传感器（BioTek或性能相当的设备）；无振动平台（TMD或性能相当的设备）；显微操作器（Narishige、Sutter、Burleigh或性能相当的品牌；操作器可为机械式、液压式或压电式）。还需强调，微吸管技术也可使用不具备三维成像能力的显微镜来评估悬浮状态细胞的刚性，例如红细胞1,2或中性粒细胞3、分离的细胞器（如细胞核4）或人工脂质体5。

图像采集软件：Zeiss AxioVision 或同等产品。

  1. 将细胞安装到倒置荧光显微镜上的微吸管腔室中，具体方法如上所述。选择一个用于实验的细胞，并将其置于视野中央。这些实验必须在无振动环境中进行，特别是对于基底贴壁细胞的实验，因为通常在实验台或普通桌面上存在的微小振动可能会完全破坏封接的形成，导致微吸管尖端断裂，或引起吸管位置的显著偏移，从而影响实验结果的分析。
  2. 将一根充满 PBS/含血清培养基溶液的微吸管插入连接至压力传感器的吸管夹持器中，通过柔性管连接，管径需与夹持器接口匹配以确保紧密连接。每次实验开始时，需将吸管内压力调节至与大气压平衡。将吸管固定在显微操作器上，以便在微米尺度上精确控制其移动。将吸管以较小角度接近腔室底部，并将其尖端移至视野中央。通过以下两个步骤使吸管杆部（即吸管尖端的圆柱形部分，细胞膜将被吸入此处）与焦平面保持水平：(1) 将吸管调整至尽可能小的角度（10–15°）；(2) 将吸管杆部轻轻抵住腔室底部。由于杆部非常细，具有足够的柔韧性，可在接近细胞时沿腔室底部滑动，如图1示意图所示。使用粗调操作器缓慢将微吸管下降至单个细胞侧方，直至接近细胞的焦平面。然后使用精细操作器将微吸管移至细胞边缘，直至吸管尖端轻轻接触细胞膜。拍摄一张图像以观察吸管位置。当吸管整个尖端与细胞表面完全接触且接触稳定时，可形成良好的封接。然而，除目视检查外，并无明确的客观标准来判断封接质量。
  3. 使用传感器施加一步负压，并维持该压力直至膜突起稳定。将细胞膜吸入吸管所需的压力大小因细胞类型和具体实验条件而异。在本实验中，通常在施加 -2 至 -15 mm Hg 范围内的压力时可观察到初始形变。施加压力后，细胞膜逐渐被吸入吸管内，直至在某一长度处达到稳定，此过程通常持续 2–3 分钟。在此期间，每 30 秒采集一次膜形变图像，以追踪膜被拉入吸管的进程。
  4. 以 2–5 mm Hg 为步长逐步增加压力，并重复整个过程，直至膜突起从细胞上脱离并完全进入吸管，此时停止实验。

4. 分析

为了量化膜变形的程度，需测量从移液管尖端到膜凸起圆周顶点的吸入长度（L）。但需要注意的是，在相同压力水平下，较大的移液管会对细胞膜施加更大的作用力。因此，为了校正不同实验中移液管直径（D）之间的差异，需将吸入长度相对于每次实验测得的移液管直径进行归一化处理。

可使用内皮细胞的标准线性黏弹性半空间模型进一步分析数据，该模型如先前研究6,7所述。具体而言，采用以下公式估算细胞的弹性模量：

水力传导率的流体动力学方程，公式 E=(3aΔp)/(2πl)φ(η)，公式示意图。

其中 E 是杨氏模量， a 是移液管的内半径， Δp 是压力差， L 是相应的带音时长，以及 φ(η) 是由 Theret 所述的力模型计算得出的壁函数 等 7需要注意的是，已有多种模型被用于分析微吸液数据，包括有限元模型（假设细胞为具有各向同性与均质材料特性的可变形球体）以及液滴模型（假设细胞呈球形，能够连续变形并在外力释放后恢复原状），相关模型已在多篇优秀的综述中有所描述： 8-10微吸法也可用于研究细胞和组织的其他生物力学参数，例如细胞的黏弹性特性、皮层张力，以及不同结构组分对细胞和组织生物力学的贡献（更多信息请参见上述所列综述）。

5. 代表性结果

在早期的研究中，微管吸吮技术通常应用于脂质体5，或未贴附于基底的细胞2,11-13。然而，在我们的研究中，细胞通常保持贴附于基底，以避免细胞脱离时可能发生的细胞骨架结构改变14-16。为了验证微吸吮技术在贴附于基底的细胞上的适用性，我们检测了该方法是否能够反映F-肌动蛋白（F-actin）破坏后牛主动脉内皮细胞（BAECs）刚度的降低。如预期所示，图3结果表明情况确实如此。具体而言，图3A展示了一组典型的荧光图像，显示内皮细胞膜在微管施加的负压作用下逐步发生形变。正如预期，细胞膜逐渐被吸入微管，且吸入长度随施加压力的增加而增大。形变过程的时间曲线显示，在所有压力条件下，F-肌动蛋白的破坏均显著增加了突起部分的吸入长度（图3B）14。

采用这种方法，我们发现当细胞膜中的胆固醇被耗竭时，细胞刚度增加，而胆固醇富集则无此效应14。图4展示了在-15 mm Hg负压下达到最大吸液长度后的胆固醇富集细胞、对照细胞和胆固醇耗竭细胞（4A）。膜突起通常在-10 mmHg时开始形成，并可在-10、-15和-20 mmHg的负压条件下测量膜变形的时间进程（4B）。当施加超过-25 mmHg的压力时，被吸入的膜突起会脱离，形成独立的囊泡。在不同胆固醇条件下，导致膜脱离的压力水平相似。这一发现令人高度意外，因为先前研究表明，在膜脂双层中，膜胆固醇的增加会提高膜的刚度5,17。我们后续的研究通过多种独立方法进一步验证了这些观察结果，包括原子力显微镜18,19和牵引力显微镜20。

光学系统示意图，光路示意图；ED=2b，D=2a；光聚焦装置。
图 1. 记录电极的示意图侧视图。 电极经拉制后，其尖端形成圆柱形管柄（侧视图）。微电极参数：D=2a=内径，ED=2b=外径。

显微注射过程，示意图和图像显示了针头角度、细胞穿刺、荧光分析。
图 2. 微量移液管接近贴壁于基底的细胞。 （A）侧视示意图；（B）微量移液管管体接触典型形态细胞的明场对比图像，该细胞常用于吸吮实验；（C）同一细胞经 DiIC18 标记后的荧光图像。微量移液管仍存在，但不可见（引自14）。

Cell deformation images under varying pressure; Latrunculin A, control; graph of deformation metrics.
图3. 利用微吸吮法检测基质贴壁细胞刚度的验证实验。A：在对照条件下及暴露于Latrunculin后BAECs细胞膜逐渐变形的图像. 移液器在图像中不可见，因为它不产生荧光。细胞被暴露于 2 μM 用latrunculin A处理10分钟，可显著减少F-actin含量（通过罗丹明-鬼笔环肽荧光测定，结果未显示），但对细胞形态无明显影响。在经latrunculin处理的细胞中，吸入性突起中部的膜出现变薄，但该突起仍与细胞保持连接。 BLatrunculin A 对膜变形时间过程的影响，其中 L 为膜突起的吸吮长度，D 为移液管直径，n=14 的对照细胞及经 Latrunculin A 处理的细胞 2 μM 用latrunculin A处理10分钟（n=5）。 细胞分别在 -10 mm Hg（菱形）、-15 mm Hg（方形）和 -20 mm Hg（三角形）条件下进行抽吸。（来自 14.)

流体动力学分析；荧光显微镜图像；L/D 随时间、压力变化的图谱。
图 4. 细胞胆固醇水平对牛主动脉内皮细胞（BAECs）膜变形的影响。A. 富含胆固醇、缺乏胆固醇及对照组细胞的膜变形典型图像（对照组细胞暴露于摩尔比为1:1的MβCD:MβCD-胆固醇混合物，该处理对细胞内游离胆固醇水平无影响（见插图））。所示图像为在-15 mm Hg负压下达到的最大变形状态。箭头指示吸吮突起的位置。标尺为30 μm。B. 三种实验细胞群体吸吮长度的平均时间过程曲线。C. 最大吸吮长度随施加压力的变化关系图。在-15 mm Hg和-20 mm Hg压力下，胆固醇缺乏细胞的最大归一化长度显著低于对照组细胞（P < 0.05）。（来自14。）

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讨论

微吸法通过向细胞膜施加负压并测量细胞膜在明确定义的压力下的变形能力，提供了一种简单且高度可重复的细胞刚度/可变形性评估方法。该方法最初由 Mitchison 和 Swann（1954 年）开发，用于表征海胆卵细胞的弹性特性，以揭示细胞分裂的机制21，随后被用于研究红细胞的力学特性1。此方法已在多项研究中被用于评估多种细胞类型的生物力学特性（例如2,3,12,13）。我们近期的研究将微吸法与三维成像相结合，进一步拓展了该方法，用于评估贴壁细胞的刚度14,15,22。细胞膜的刚度和弹性可提供关于细胞表型以及细胞如何响应动态环境的重要信息，特别是对血流产生的血流动力学力或细胞外基质黏弹性变化所引发的各种力学信号的响应。事实上，早期研究表明，细胞刚度会随着流体剪切应力的增加而升高13,23，并随基底刚度的增加而变化16,24。细胞刚度的变化预计将对细胞的机械敏感性和机械转导产生重大影响。具体而言，我们近期研究发现，内皮细胞刚度的增加可增强其对流动的敏感性25。我们还发现，内皮...

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披露

未声明任何利益冲突。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
萨特拉制仪Sutter InstrumentsP-97
微电极拉制仪NarishigeMF-830
倒置荧光显微镜ZeissAxiovert 200M显微镜最好配备三维成像/去卷积功能。
摄像机ZeissAxioCam MRm
图像采集软件ZeissAxioVision
气动压力传感器BioTekDPM-1BDPM1B 气动传感器测试仪现可通过 FLUKE 公司获取。
移液管玻璃管Richland定制玻璃管移液管定制内径为 1.2，外径为 1.6。
DiI 染料InvitrogenD282可良好溶于 DMSO

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