利用微吸管对贴壁细胞进行吸吮以评估细胞刚性

摘要

本文介绍一种快速、简单的细胞刚度测量方法。该方法的基本原理是通过微管对细胞表面施加明确定义的负压，测量细胞膜在负压作用下的形变。该方法为研究贴壁细胞的生物力学特性提供了一种强有力的工具。

摘要

越来越多的研究表明，单个细胞的生物力学特性在多种细胞功能中发挥着重要作用，包括细胞增殖、分化、迁移以及细胞间相互作用。细胞生物力学的两个关键参数是细胞的可变形性（或称刚度）以及细胞收缩并产生力的能力。本文介绍一种快速简便的方法，通过测量玻璃微吸管对细胞表面施加负压时细胞膜的变形程度，来估算细胞刚度，该技术称为微吸管吸吮法（Micropipette Aspiration）或微吸法。

微吸术通过拉制玻璃毛细管，制备出具有极小尖端（直径为2-50 μm，具体取决于细胞或组织样本的大小）的微移液管，然后将其连接至气动压力传感器，并在显微镜下移至细胞附近。当移液管尖端接触细胞时，气动压力传感器向移液管施加一步负压，从而在细胞膜上产生明确的压力。作为对压力的响应，细胞膜被吸入移液管内，膜的逐步形变或“膜突起”进入移液管的程度随时间被测量。该实验方法的基本原理是：细胞膜在特定机械力作用下的形变程度取决于膜的刚度。膜越刚硬，其形变速率越慢，稳态吸吮长度也越短。该技术可用于悬浮或贴附于基底的分离细胞、大型细胞器以及脂质体。

通过比较不同细胞群体或实验条件下，给定压力所达到的最大膜变形程度来进行分析。通过绘制膜变形的吸入长度随施加压力变化的函数关系，可估算“刚度系数”。此外，可进一步分析数据以估算细胞的杨氏模量（E），这是表征材料刚度最常用的参数。需要注意的是，真核细胞的质膜可被视为一个双组分系统，其中膜脂双层下方由膜下细胞骨架支撑，而正是细胞骨架构成了膜的机械支架，并主导了细胞包膜的可变形性。因此，该方法可用于探究膜下细胞骨架的生物力学特性。

方案

1. 拉制玻璃微电极

设备： 微电极拉制仪，显微操作仪。

玻璃： 硼硅酸盐玻璃毛细管（外径约 1.5 mm，内径约 1.4 mm）。

1. 拉制微移液管采用与制备电生理记录用玻璃微电极相似的基本方法。简而言之，将一根玻璃毛细管在中间加热，当玻璃开始熔化时，将毛细管的两半拉开，从而形成两根微移液管。目前有多种商用拉制仪可用于该过程，从利用重力将两根移液管分开的相对简单的垂直拉制仪，到可编程控制拉速及其他拉制参数的高精度水平拉制仪均有涵盖。在我们的实验中，两种类型的拉制仪均有使用。
2. 移液管尖端几何形状的要求：本实验所用移液管的尖端外径通常介于2至6 μm之间，具体取决于细胞的大小。另一个重要参数是尖端的形状，应近似为圆柱形管状（见图1）。可通过优化拉制参数并在显微镜下观察尖端形状，直至获得理想形态来实现该目标。移液管杆部的最佳长度取决于预期的变形程度：若变形较小（<10 μm），则移液管的圆柱状部分也可相对较短（同数量级）；对于更大的变形，应相应调整长度。通常，提高加热温度和/或增加“拉力”可减小尖端直径，而增加“拉力”还会产生更长的锥形过渡段。在我们的实验中，使用Sutter P-97水平拉制仪，程序优化为以下参....

讨论

微吸法通过向细胞膜施加负压并测量细胞膜在明确定义的压力下的变形能力，提供了一种简单且高度可重复的细胞刚度/可变形性评估方法。该方法最初由 Mitchison 和 Swann（1954 年）开发，用于表征海胆卵细胞的弹性特性，以揭示细胞分裂的机制²¹，随后被用于研究红细胞的力学特性¹。此方法已在多项研究中被用于评估多种细胞类型的生物力学特性（例如^2,3,12,13）。我们近期的研究将微吸法与三维成像相结合，进一步拓展了该方法，用于评估贴壁细胞的刚度^14,15,22。细胞膜的刚度和弹性可提供关于细胞表型以及细胞如何响应动态环境的重要信息，特别是对血流产生的血流动力学力或细胞外基质黏弹性变化所引发的各种力学信号的响应。事实上，早期研究表明，细胞刚度会随着流体剪切应力的增加而升高^13,23，并随基底刚度的增加而变化^16,24。细胞刚度的变化预计将对细胞的机械敏感性和机械转导产生重大影响。具体而言，我们近期研究发现，内皮细胞刚度的增加可增强其对流动的敏感性²⁵。我们还发现，内皮.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
萨特拉制仪	Sutter Instruments	P-97
微电极拉制仪	Narishige	MF-830
倒置荧光显微镜	Zeiss	Axiovert 200M	显微镜最好配备三维成像/去卷积功能。
摄像机	Zeiss	AxioCam MRm
图像采集软件	Zeiss	AxioVision
气动压力传感器	BioTek	DPM-1B	DPM1B 气动传感器测试仪现可通过 FLUKE 公司获取。
移液管玻璃管	Richland	定制玻璃管	移液管定制内径为 1.2，外径为 1.6。
DiI 染料	Invitrogen	D282	可良好溶于 DMSO