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方法文章

多囊肾病患者及小鼠染色体异常研究的光谱核型分析

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DOI：

10.3791/3887

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2012年2月3日

 ,  , 
1Department of Pharmacology, University of Toledo, College of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 2Department of Emergency and Intensive Care, ProMedica Sponsored Research

本文内容

摘要

光谱核型分析（SKY）是一种先进的细胞遗传学技术，用于鉴定基因组和染色体异常。该技术利用染色体涂染探针，能够对所有染色体进行分类。SKY 还可用于识别多种疾病（包括多囊肾病）的小鼠和人类模型中的复杂染色体异常及分离缺陷。

摘要

传统方法通过分析特定物种每条染色体独特的带型模式来识别和分类单个染色体1, 2。然而，这种经典的带型技术在识别复杂的染色体畸变（如与癌症相关的畸变）时并不可靠。为了克服带型技术的局限性，引入了光谱核型分析（Spectral Karyotyping, SKY），以提供更为可靠的染色体异常信息。

SKY 是一种多色荧光技术 原位 荧光原位杂交（FISH）技术结合光谱显微镜检测中期染色体 3, 4SKY 已被证实是分析多种遗传病和恶性肿瘤相关染色体异常的有力工具 5, 6SKY 技术利用通过 PCR 从简并寡核苷酸引物制备的多色荧光标记 DNA 探针，从而使每条染色体呈现出独特的光谱颜色 原位 使用不同荧光染料（罗丹明、德克萨斯红、Cy5、FITC 和 Cy5.5）标记的探针进行杂交。SKY 所用的探针包含多达 55 种染色体特异性探针 7-10.

SKY 技术的操作流程包括多个步骤（图1）。SKY 需要获取来自正常或病变组织或血液中具有高有丝分裂指数的细胞。将从新鲜分离的原代细胞或细胞系中获得的单个细胞的染色体铺展在玻璃载玻片上。该染色体铺展使用针对每条染色体特异的荧光染料组合进行标记。为了探针检测和图像采集，光谱成像系统由萨尼亚克干涉仪和 CCD 相机组成。该系统可测量样本发出的可见光光谱，并获取单个染色体的光谱图像。用于分析所捕获图像结果的软件 HiSKY，能够便捷地识别染色体异常。最终结果是一幅中期分裂相图像和核型分类图像，其中每对染色体均呈现独特的颜色（图2）。这使得染色体身份鉴定和易位检测变得简便直观。欲了解更多信息，请访问 Applied Spectral Imaging 官方网站（http://www.spectral-imaging.com/）。

最近，SKY技术被用于鉴定常染色体显性多囊肾病（ADPKD）患者及小鼠模型中的染色体分离缺陷和染色体异常。ADPKD是一种由初级纤毛功能障碍引起的遗传性疾病11-13。利用该技术，我们证实了ADPKD患者和小鼠模型中存在染色体异常分离及染色体缺陷14。进一步使用SKY进行的分析不仅使我们能够确定染色体的数量和身份，还能准确检测极为复杂的染色体畸变，例如染色体缺失和易位（图2）。

方案

1. 细胞预处理与中期相制备

  1. 细胞在含10-15%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中，于37°C、5% CO2培养箱中培养，直至细胞融合度达到70-80%。
  2. 用终浓度为0.05 μg/ml的秋水仙胺溶液处理细胞，作用30-60分钟。
  3. 收集含有悬浮细胞的培养基至50 ml无菌Falcon离心管中。用无菌1×PBS冲洗培养板上的贴壁细胞，加入无菌胰蛋白酶孵育1-2分钟后，将剩余细胞收集至同一离心管中。
  4. 以1000 r.p.m.离心5分钟，吸除上清液，保留约0.5 ml液体，仅通过手指轻弹管底使沉淀松散。
  5. 根据沉淀体积，加入5-10 ml由dH2O配制的0.56% KCl低渗溶液，于37°C孵育30-45分钟。
  6. 每毫升低渗细胞悬液中加入一滴甲醇/冰醋酸（3:1，体积比）固定液，轻轻颠倒混匀。
  7. 以1200 r.p.m.离心5分钟，收集沉淀（参照步骤1.4），在持续轻弹沉淀的同时，逐滴加入5 ml新鲜的甲醇/冰醋酸（3:1，体积比）固定液。此步骤至关重要，可防止中期染色体被包裹在细胞团块中，从而避免影响实验结果。
  8. 再次以1200 r.p.m.离心5分钟，沿管壁加入5-10 ml预冷的甲醇/冰醋酸固定液。此时，如需保存，可将细胞置于密封良好的离心管中，短期保存于-20°C，长期保存（数年）则置于-80°C，以备后续使用。
  9. 用无水乙醇清洗载玻片，然后将载玻片浸入dH2O中约10次，以在玻片表面形成一层水膜。将玻片置于玻璃板上，从距玻片约10英寸高处滴加15-20 μl细胞悬液（来自步骤1.8）。将玻片置于65-70°C水浴中1-2分钟，随后自然干燥。
  10. 在光学显微镜下使用10X和40X干镜观察玻片，确认是否存在中期染色体以及染色体展布是否均匀。检查染色体周围是否存在细胞质残留。若存在细胞质，则需进行玻片预处理（胃蛋白酶消化）；若无细胞质残留且染色体形态良好，则无需预处理。

2. 载玻片预处理（胃蛋白酶处理）

  1. 在24 mm × 60 mm的显微镜盖玻片上加入120 μl 1:200的RNase溶液（20 mg/ml，溶于2X-SSC），将中期分裂相玻片倒扣于盖玻片上，然后轻轻翻转使玻片正面朝上，在37°C下孵育45分钟。
  2. 小心取下盖玻片，避免划伤玻片，随后在盛有2X-SSC缓冲液的考普林瓶中洗涤，室温下轻轻振荡，每5分钟更换一次缓冲液，共洗涤15分钟。
  3. 将5–15 μl胃蛋白酶储备液（100 mg/ml，溶于dH2O）加入洁净烧杯中，再加入100 ml预热至37°C的0.01M HCl。必须先将胃蛋白酶加入洁净烧杯中，再加入HCl溶液，不可直接将胃蛋白酶加入HCl溶液中，否则无法充分溶解。 将玻片置于含有HCl/胃蛋白酶溶液的考普林瓶中，在37°C下孵育3–5分钟。此步骤极为关键：消化过度会导致染色体结构破坏，消化不足则会残留细胞质，可能导致探针非特异性结合，干扰杂交信号。
  4. 在盛有100 ml 1X-PBS的考普林瓶中室温洗涤玻片，每次5分钟，重复两次。
  5. 在盛有100 ml 1X-PBS/MgCl2的考普林瓶中室温洗涤玻片5分钟（配制方法：将50 ml 1M MgCl2加入950 ml 1X-PBS中）。
  6. 将玻片置于盛有100 ml 1%甲醛的考普林瓶中，室温固定10分钟（配制方法：将1.7 ml 37%甲醛加入100 ml 1X-PBS/MgCl2中）。
  7. 在盛有100 ml 1X-PBS的考普林瓶中洗涤玻片5分钟。
  8. 在光学显微镜下使用40X干镜观察玻片，确认消化程度适当，无细胞质残留，且染色体形态保持良好。使用金刚石笔标记用于杂交的区域。

3. 染色体和探针变性与杂交

  1. 配制新鲜的变性液（70% 甲酰胺/2X SSC，pH 7.0），置于水浴中的染色缸内预热至 70–80°C。将载玻片放入盛有变性液的染色缸中，在水浴中于 70°C（小鼠染色体）或 80°C（人类染色体）下处理 30 秒至 1.5 分钟。
  2. 立即把载玻片依次浸入冰浴的 70% 乙醇中 3 分钟，随后分别在 80% 和 100% 乙醇中各浸泡 3 分钟，然后空气干燥。检查载玻片上的染色体形态，良好的染色体形态表现为染色深，而非“相位发亮”或晕轮状染色体。
  3. 将 SkyPaint 探针（SKY paint 试剂盒；小瓶#1）在 37°C 下振荡加热 20 分钟，涡旋混匀后短暂以 1000 r.p.m. 离心数秒。
  4. 将探针置于热循环仪中进行两步变性程序：85°C 变性 5 分钟，随后 37°C 保持 60 分钟，以实现标记探针 DNA 的预杂交退火。
  5. 取 10 μL 变性后的探针滴加至杂交区域，覆盖 22 mm × 40 mm 的盖玻片，注意避免产生气泡。用橡胶胶水密封盖玻片边缘，置于湿化孵育盒中 37°C 孵育 48–72 小时。

4. 荧光探针检测

  1. 小心取下盖玻片，将载玻片放入盛有预热（45°C）洗涤液 I（新配制的含 50% 甲酰胺的 2X SSC 溶液）的考普林瓶中，在 45 r.p.m. 摇动水浴中 45°C 洗涤 5 分钟，重复三次。
  2. 在 45°C 条件下，用洗涤液 II（1X SSC）振荡洗涤载玻片，每次 5 分钟，重复两次。
  3. 在 45°C 条件下，用洗涤液 III（4X SSC/0.1% Tween 20）振荡洗涤载玻片 5 分钟，重复三次。
  4. 加入 80 μl 封闭试剂（SKY paint 试剂盒；瓶号#2），加盖盖玻片，37°C 孵育 30 分钟。
  5. 取出载玻片，使液体自然沥干。加入 80 μl Cy5 染色试剂（浓缩抗体检测试剂盒 CAD；瓶号#3），加盖盖玻片，37°C 孵育 40 分钟。
  6. 用洗涤液 III 在 45°C 振荡洗涤载玻片，每次 5 分钟，重复三次。
  7. 加入 80 μl Cy5.5 染色试剂（浓缩抗体检测试剂盒 CAD；瓶号#4），加盖盖玻片，37°C 孵育 40 分钟。
  8. 用洗涤液 III 在 45°C 振荡洗涤载玻片，每次 5 分钟，重复三次。
  9. 倾斜载玻片，使液体沥干。加入 20 μl 抗荧光淬灭 DAPI 试剂（SKY paint 试剂盒；瓶号#5），加盖 24 mm × 60 mm 显微镜盖玻片，小心去除可能形成的气泡。载玻片可立即进行成像，或在 4°C 避光保存不超过 1 周后成像。

5. 图像采集与分析

  1. 通过使用配备60倍油镜、光谱立方体（定制设计的三通带滤光片）、DAPI滤光片以及带有CCD相机的萨尼亚克干涉仪模块的奥林巴斯显微镜观察中期玻片，完成图像采集。
  2. 根据用户手册，使用应用光谱成像公司SKY View软件（版本1.62）进行光谱核型分析。
  3. 图像分析完成后，染色体可呈现为彩色图像（具有特定荧光颜色）、伪彩图像（以颜色进行分类）和倒置DAPI图像（显示特异性条带模式）。

6. 典型结果

完整的SKY实验流程通常需要约一周时间（图1），前提是能够提供足够数量的中期细胞用于图像采集与分析。核型分析显示，来自野生型小鼠的细胞具有正常的小鼠核型（40,XY）（图2a）。相比之下，来自Pkd1-/-小鼠（常染色体显性多囊肾病小鼠模型）的细胞则表现出染色体数目显著增加以及明显的结构异常，例如染色体缺失（染色体#8）和易位（染色体#11和19）（图2b）。我们还分析了来自ADPKD患者的血管组织样本。通过简单的染色体计数研究发现，非ADPKD样本及部分ADPKD血管样本具有正常的23对染色体（图2c）。然而总体而言，我们观察到ADPKD样本中存在染色体分离失败现象，导致染色体数目为46对而非正常的23对（图2d）。

原位荧光杂交示意图；染色体变性、探针杂交过程。
图1. SKY 实验流程图。 SKY 实验流程图展示了从细胞预处理和中期制备到图像采集与分析的完整实验步骤。左侧列出了大致为期一周的时间安排，并逐日列出了每一步的操作流程。

染色体比较图谱；野生型、Pkd1-突变型小鼠；非ADPKD、ADPKD人类患者的核型。
图2. 对永生化小鼠细胞系及新鲜分离的人原代细胞进行光谱核型分析。 在染色体分选前，显示了各条染色体的颜色和倒置DAPI图像。分选后，染色体呈现在“分类”表格中。a) 来自野生型小鼠的中期分裂相SKY图像显示正常核型（40, XY）。b) 来自Pkd1-/-小鼠的中期分裂相SKY图像显示染色体数目异常（68条而非40条），并存在染色体缺失（染色体#8）和染色体易位（染色体#11和#19）等染色体异常。c) 来自非ADPKD患者血管组织的中期分裂相SKY图像显示正常核型（46, XX）。d) 来自ADPKD患者血管组织的中期分裂相SKY图像显示异常核型（92, XXXX）。部分数据此前已有报道，经许可重复使用14。

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讨论

光谱核型分析（Spectral Karyotyping, SKY）是一种用于研究基因组和染色体组成的细胞遗传学技术。该技术利用染色体涂染探针，并通过萨尼亚克干涉仪检测这些探针。完整的SKY过程通常需要约一周时间，涉及多个关键步骤（图1）。SKY采用一种标准操作流程，最初由Padilla-Nash 等3描述。此后，该流程已被包括我们实验室在内的多个细胞遗传学实验室所改进和应用。

在该实验方案的关键步骤中，获得高质量的中期相制备样本对于成功进行光谱核型分析（SKY）极为重要。例如，如果染色体附着过多细胞质，或载玻片存放时间过久，都可能影响图像质量。如我们在视频片段中所见，使用高分辨率的微分干涉差显微技术可轻松识别细胞质残留情况。此外，进行SKY分析的前提是必须存在处于活跃分裂状态的细胞；这一问题可通过延长秋水仙胺处理时间或向细胞中添加其他生长因子来解决。SKY分析的整体成功率在很大程度上取决于操作人员的技术水平和实践经验。

SKY 提供了一种强大且可靠的...

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致谢

作者感谢Brian Muntean、Shao Lo、Maki Takahashi和Blair Mell提供的技术支持。本研究工作得到了美国国立卫生研究院（NIH，项目编号DK080640）以及托莱多大学与ProMedica转化研究激励奖对Surya Nauli博士的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DMEMCellgro10-013-CV
胎牛血清（FBS）HycloneSH30088-03
青霉素/链霉素Thermo Fisher Scientific, Inc.SV30010
秋水仙胺（Colcemid）Roche Group10 295 892 00110 μg/ml
HClFisher ScientificA144-500
KClFisher ScientificS77375-1
磷酸盐缓冲液Thermo Fisher Scientific, Inc.SH30256-01
SKY 荧光探针试剂盒（人源）Applied Spectral ImagingSKY000028
SKY 荧光探针试剂盒（小鼠源）Applied Spectral ImagingSKY000030
浓缩型抗体检测试剂盒Applied Spectral ImagingSKY000033
胰蛋白酶Thermo Fisher Scientific, Inc.SH30236.01
甲醇Fisher ScientificA433P-4
乙酸Fisher ScientificA38-212
RNase ARoche Group10 109 169 001
胃蛋白酶Sigma-AldrichP6887-5G
MgCl2Fluka63069-500ML
37% 甲醛Mallinckrodt Baker Inc.2106-02
20X SSCPromega Corp.V4261
甲酰胺Fluka47671使用前新鲜配制
吐温-20Fisher ScientificBP337-500
显微镜载玻片Fisher Scientific12-549
24×60 mm 盖玻片VWR international16004-312
橡胶胶水Elmer’s
杂交/湿化室/托盘SimportM920-2底部放置湿润的纸巾
PCR仪（热循环仪）EppendorfEpgradient S
摇床/轨道式摇床Bellco Glass
振荡/水浴锅Precision Scientific
DAPI滤光片组Chroma Technology Corp.
SKY滤光片组Chroma Technology Corp.
SpectraCubeApplied Spectral Imaging
倒置细胞培养显微镜Nikon InstrumentsNikon Eclipse TS100
荧光显微镜Olympus CorporationIX7060X油镜

参考文献

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